（运动人体科学专业论文）白藜芦醇对耐力训练小鼠抗氧化抗运动性疲劳和免疫功能的影响.pdf

摘要本文研究白藜芦醇对耐力训练小鼠的抗氧化能力和免疫功能的影响，探讨白藜芦醇对抗运动性疲劳的作用，为自篓芦醇作为抗运动性疲劳营养补剂的开发利用提供理论依据。试验选用昆明小鼠，根据体重将7 2 只小鼠随机分为三组：a 组为安静对照组；b组为耐力训练组；c 组为耐力训练+ 白藜芦醇组。c 组小鼠每日给予白藜芦醇1 0 m g k g灌胃。与b 组共同进行6 周递增负荷游泳训练，再进行力竭游泳实验。力竭运动后即刻测定血乳酸浓度，力竭后2 4h 处死小鼠，制备各组织匀浆、血清、红细胞和线粒体。测定各组小鼠抗氧化、免疫功能和疲劳的相关指标：骨骼肌、心肌、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏线粒体的s o d 、g s h 1 x 活性和m d a 含量和红细胞s o d 活性、m d a 含量和全血g s h p x 活性：血糖、肝糖原、肌糖原、血尿素氮和肝脏线粒体中游离钙的含量；死亡率，胸腺指数、脾脏指数，白细胞计数和分类，腹腔巨噬细胞吞噬功能，脾淋巴细胞增殖反应，自藜芦醇对激活小鼠体外脾淋巴细胞增值的作用，小鼠外周血t 淋巴细胞亚群c d 3 + c d 4 + 、c d 3 + c d 8 + 百分数及c d 3 + c i m + c d 3 + c d 8 + 值，血清细胞因子i l - 2 、s l l - 2 r浓度，血清i g g 浓度，外周血红细胞参数( 血红蛋白含量、红细胞计数、红细胞压积、红细胞平均体积、红细胞平均血红蛋白、红细胞平均血红蛋白浓度) 和小鼠红细胞的免疫黏附能力结果发现：( 1 ) 白藜芦醇显著提高耐力训练小鼠骨骼肌s o d 、g s h p x 活性，降低m d a 含 量i 提高心肌g s h p x 活性；降低胸腺m d a 台 量；提高脾脏s o d 活性：提高肝脏线粒体s o d 活性并降低m d a 含量；以及降低红细胞m d a 台 量c 2 ) 白藜芦醇对耐力训练小鼠的胸腺、脾脏指数无影响，但显著降低耐力训练所致的小鼠死亡率；防止耐力训练所致的小鼠单核细胞、淋巴细胞和白细胞数量的降低和白细胞亚群的比例失调：避免耐力训练造成的c d 3 + c d 8 + 下降及恢复延迟，维持c d 3 + c d 4 + ，c d 3 + c d 8 + 值在正常范围；提高耐力训练小鼠腹腔巨嗜细胞吞噬能力；有效防止耐力训练小鼠脾t 淋巴细胞增殖能力的降低，而且不同浓度白藜芦醇体外均提高小鼠脾t 淋巴细胞的增殖能力；提高耐力训练小鼠血清i l - 2 的浓度；与安静对照组相比，显著提高耐力训练小鼠血清i 如的含量；同时，白藜芦醇还显著提高耐力训练小鼠r b c 、h b 、h c t ，维持r d w 、m c h 等参数在正常范围，显著提高红细胞的免疫黏附能力，减轻耐力训练对小鼠红细胞形态和功能的损伤( 3 ) 白藜芦醇显著提高耐力训练小鼠肝糖原的含量，但并不能恢复力竭运动所造成的血糖水平低下和降低血乳酸的浓度：与安静对照组相比，显著降低耐力训练小鼠血尿素氮的含量；显著延长耐力训练小鼠力竭游泳的时间；显著降低耐力训练小鼠肝脏线粒体内游离钙的含量，避免耐力训练造成的线粒体钙超载，维持线粒体内钙代谢的稳态。结论：白藜芦醇有效降低小鼠机体的脂质过氧化水平，显著提高耐力训练小鼠的抗氧化能力；从细胞的形态、数目、功能及细胞因子等多层次、多方面显著提高耐力训练小鼠的免疫功能和运动能力，具有抗运动性疲劳的作用；白藜芦醇维持线粒体钙的稳态可能是其抗疲劳的机制之一白藜芦醇具有提高耐力训练小鼠的免疫功能、抗氧化和抗疲劳的能力，因此，在作为抗运动性疲劳营养补剂的应用开发上具有较大的价值。关键词：白蘩芦醇；耐力训练；小鼠；抗氧化；免疫功能；运动性疲劳a b s t r a c ti no r d e rt oe x p l o i ta n du t i l i z er e s v c r a t m la san u t r i t i o n a ls u p p l e m e n tt h a tc o u l de l i m i n a t ee x e r c i s e - i n d u c e df a t i g u e , t h ee f f e c t so fr e s v e r a t r o io na n t i 枷d a t i o na n di m m u n i t yi nt h ee n d u r a n c ee x e r c i s em i c ew c t ei n v e s t i g a t e d , a n dt h ee f f e c to fr e s v r a t r o lo ne l i m i n a t i n ge x e r c i s e - i n d u c e df a t i g u ew a sa l s od i s c u s s e di nt h i sp q o e r ok u n m i n gm i c e ，7 2 ，w c t er a n d o m l yd i v i d e di n t o3g r o u p sa c c o r d i n gt ow e i g h t ：g r o u pa ( s e d e n t a r yc o n t r 0 1 ) ；g r o u pb ( e n d u r a n c ee x e r c i s e ) ；g r o u pc ( r e s v c r a t r o l + e n d u r a n c ee x c r c i s c ) f e e d e dw i t hr e s v c r a t r o l ( 1 0m gk 9 1f 1 ) ，t h em i c co fg r o u pcw c r ct a k e np r o g r e s s i v e l yt i m e - i n c r e a s i n gs w i m m i n ge n d u r a n c ct r a i n i n gf o rs i xw e e k sa n dt h e nh a dae x h a u s t i o ns w i m m i n ga sd i dt h em i c eo fg r o u pb t h el a c t a t ec o n c e n t r a t i o ni nb l o o do fm i c ew a st e s t e di m m e d i a t e l ya f t e re x h a u s t i o ns w i m m i n g ；a n da l lm i c ew e r es a c r i f i c e da n ds a m p l e d2 4hl a t e r t h ef o l l o w i n gp a r a m e t e r si nm i c ew e r et e s t e d ：s o da c t i v i t y , g s h - p xa c t i v i t ya n dm d ac o n t a n ti ns k e l e t a lm u s c l e ，c a r d i a cm u s c l e ，t h y m u s , s p l e e n s , k i d n e y , l i v e rm i t o c h o n d r i aa n dc r y t h r o c y t e s ；m u s c l eg l y c o g e nc o n t e n t ；h e p a t i cg l y c o g e nc o n t e n t ；b l o o ds u g a rc o n c e n t r a t i o n ；b l o o du g e an i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n ；c a z +c o n t e n ti nf i v e rm i t o c h o n d r i a ；d e a t hr a t e ；t h y m u si n d e xa n ds p l e e n si n d e x ；l e u k o c y t ec o u n t sa n dl e u k o c y t es u b s e t s ；p h a g o c y t i z ec a p a c i t yo fp e r i t o n e a lm a c r o p h a g e ；p r o l i f e r a t i o nr e s p o n s e si ns p l e n o c y t e s ；t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o nr e s v c r a t r o lo np r o l i f e r a t i o nr e s p o n s e si ns p l e n o c y t c s ；p e r c e n t a g eo ftl y m p h o c y t es u b s e t s ( c d 3 + c d 4 + ，c d 3 + c = d 8 + ) i nw h o l eb l o o da n dt h er a t i oo fc d 3 + c d 4 + c d 3 + c d 8 + ；i l - 2 ，s l l - 2 ra n di g gc o n c e n t r a t i o ni ns e r u m ；h b ，r b c , r d 、7 l lm c h ，m c v , h c ta n dm c h ci nb l o o d , a n da d h e s i v ea b i l i t yo f r e db l o o dc e l l t h er e s u l t sw e r ep r e s e n t e da sf o l l o w i n g ：( 1 ) t h ea c t i v i t i e so fs o di nq u a d r i c e p sf c m o r i s , s p l e e n sa n di nl i v e rm i t o c h o n d r i a , a n do fg s h p xi nq u a d r i c e p sf e m o r i sa n dc a r d i a cm u s c l ei n c r e a s e d , w h i l em d ac o n t e n ti nq u a d r i c e p sf e m o r i s ，t h y m u s , f i v e rm i t o c h o n d r i aa n de r y t h r o c y t e so ft h ee n d u r a n c ee x e r c i s em i c et r e a t e dw i t hr e s v c r a t r o id e c r e a s e da sc o m p a r d e dw i t he n d u r a n c ee x e r c i s em i c e ( 2 ) r c s v e m t m lt r e a t m e n td i dn o tr e s u l ti ns i g n i f i c a n tc h a n g e si nt h y m u si n d e xa n ds p l e e n si n d e x h o w e v e r , i nt h ee n d u r a n c ee x e r c i s em i c ew i t hr e s v e r a t r o lt r e a t m e n t ，t h ed e a t hr a t es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d , a n dt h ed e m e s n e si nl y m p h o c y t e ，m o n o c y t e ，l e u k o c y t ec o u n t s ,a n dt h ew o p o r t i o nm a l a d j u s t m e n to fl e u k o c y t es u b s e t st h a tc a u s c db ye n d u r a n c ee x c r c i s c ,mw e r ep r e v e n t e dr e s p e c t i v e l y m o r e o v e r , r e s v e r a t r o lt r e a t m e n tr e s u l t e di ni n h i b i t i n gt h ed e c r e a s ea n dr e s t o r a t i o nd e l a yo fc d 3 + c d 8 + ，m a i n t a i n i n gc d 3 + c d 4 + c d 3 + c d 8 + r a t i oi nn o r m a ls c o p e ，a n de n h a n c i n gt h ep h a g o c y t i z ei n d e x e sa n dp h a g o c y t i z er a t eo fp e r i t o n e a lm a c r o p h a g e , a n dp r e v e n t i n gt h ed e c r e a s ei np r o l i f e r a t i o nr e s p o n s e si ns p l e n o c y t e s d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fr e s v e r a t r o la l s oa c c e l e r a t e dp r o l i f e r a t i o nr e s p o n s e si ns p l e n o c y t e s ( i nv i t r o ) i na d d i t i o n , i nt h ee n d u r a n c ee x e r c i s em i c et r e a t e dw i t hr e s v e r a t r o lt h ei l - 2a n di g gc o n c e n t r a t i o ni ns c m m ，h c b ，h b ，h c t ，a n dt h ea d h e s i v ea b i l i t yo fr e db l o o dc e l l ，i n c r e a s e dr e s p e c t i v e l y ，w h i l et h er d wa n dm c hm a i n t a i n e da tn o r m a ls c o p e t h ed a m a g eo fr e db l o o dc e l l sf u n c t i o na n ds h a p ec a u s e db ye n d u r a n c ee x e r c i s ew a sa l s oa l l e v i a t e db yr e s v e r a t r o lt r e a t m e m ( 3 ) i nt h ee n d u r a n c ee x e r c i s em i c et r e a t e dw i t hr c s v e r a t r o l , t h eh e p a t i cg l y c o g e nc o n t e n ti n c e a s e d , a n dt h eb l o o du r e an i t r o g e nc o n c e n t r a t i o nd e c r e a e d h o w e v e r , r e s v e r a t r o lt r e a t m e n td i dn o td p c r e a s et h el a c t a t ec o n c e n t r a t i o ni nb l o o da n dr e c o v e rb l o o ds u g a rc o n c e n t r a t i o n f u r t h e r n l o 代r e s v c r a t r o lt r e a t m e n tc a u s e dt h ed e c r e a s ei nc a 2 + c o n t e n ti nl i v e rm i t o c h o n d r i aa n dt h ei n h i b i t i o nt oc a 2 + o v e r - l o a di nm i t o c h o n d r i a , w h i c hw o u l dc o n t r i b u t e dt or e g u l a t i n gt h es t a b l es t a t eo fc a 2 + i nm i t o c h o n d r i a c o n c l u s i o n ：t h ee f f e c t so fr e s v e r a t r o li nd e c r e a s i n gl i p i dp e r o x i d a t i o nl e v e la n de n h a n c i n ga n t i o x i d a t i o na n di m m u n i t yi nt h ee n d u r a n c ee x e r c i s em i c et h r o u g hd i f f e r e n tp a t hs u c ha sc e l ln u m b e r ，s h a p e ，f u n c t i o na n dc y t o k i n ec o u l di m p r o v et h ec a p a c i t yo fe x e r c i s ea n do fe l i m i n a t i n ge x e r c i s e - i n d u c e df a t i g u e ，a n dt h ee f f e c ti nr e g u l a t i n gs t a b l es t a t eo fc a 2 + i nm i t o c h o n d r i a e m c dt ob ea l li m p o r t a n tc o n t r i b u t o rt oe l i m i n a t i n ge x e r c i s e - i n d u c e df a t i g u e t h e r e f o r e ，r e s v e r a t r o lc o u l db ec o n s i d e r e da sa ne f f e c t i v en u t r i t i o n a ls u p p l e m e n tt ob ea v a i l a b l ef o re l i m i n a t i n ge x e r c i s e - i n d u c e df a t i g u e k e yw o r d s ：r e s v c r a t r o l ；e n d u r a n c ee x e r c i s e ；m i c e ；a n t i o x i d a t i o n ；i m m u n i t yf u n c t i o n ；e x e r c i s e i n d u c e df a t i g u e1 v缩写词中英文对照表英语缩写英文名称中文全称b u nb l o o du r e an i t r o g e n血尿素氮c a te a t a l 蛳过氧化氢酶c dc l u s t c ro f d i f f e r e n t i a t i o n分化群c i cc i r c u l a t i n gi m m u n ec o m p l e x循环免疫复合物c o n ac o n c a n v a l i na刀豆蛋白d t n b5 ，5 - d i t h i o b i s n i t r o b e n z o i ca c i d二硫代二硝基苯甲酸e d t ae t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸e u s ae n g y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附测定f c mf l o wc y t o m e t r y流式细胞术g s h p xg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e谷光甘肽过氧化物酶h bh e m o g l o b i n血红蛋白h c th a e m a t o c r i t红细胞压积i gi m m u n o g l o b l i n免疫球蛋白i li n t e r l e u k i n白细胞介素m c hm e a nc e l lh e m o g l o b i n平均红细朐向打蛋白m c h cm e a nc e l lh e m o g l o b i nc o n c e n t r a t i o n红细胞平均血红蛋白浓度m c vm e a nc o r p u s c u l a rv o l u m e平均红细胞体积m d am a l e i cd i a l d e h y d e丙二醛m - i t3 - ( 4 ，5d i m e t h y l t h i a z a l z y l ) 2 ，5噻唑蓝d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d ep b sp h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液r b cr e db l o o dc e n红细胞计数r b c c 3 b r rr o s e t t ef o r m i n gr b c - c 3 br e c e p t o r红细胞c 3 b 受体花环率r a t er b c i c rr o s e t t ef o r m i n gr b c - i cr a t e红细胞免疫复合物花环率r d wr e db l o o dc e l ld i s t r i b u t i o nw i d t h红细胞体积分布宽度s o ds u p e r o x i d ed i s m u t a s e超氧化物歧化酶s i l 2 rs o l u b l ei n t e r l e u k i n - 2r e c e p t o r可溶性白细胞介素2 受体1 r hh e l p e rtc e l l辅助性t 细胞t b at h m a b i t u r i ca c i d硫代巴t e 妥酸v湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。论文作者签名：剖聿i 色日期：沙7 年量月彩日学位论文使用授权说明本学位论文作者完全了解学校有关保留，使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定)日期：2 哆；f 同z 占日日期：1 前言1 前言1 1 研究背景国内外研究己证明，需氧生物体内微量氧自由基( o x y g e nf r e er a d i c a l ，o v r ) 是生命活动之需，但超过剩用浓度的o f r 则对机体产生危害。近年来，运动医学领域的研究结果认为，运动、大强度训练或力竭运动造成体内o r f 代谢增强，即运动中内源性自由基生成增加，己为许多研究所证实i “2 1 。o f r 的活性很强，容易与生物大分子反应，攻击细胞膜和亚细胞膜脂质分子形成脂质过氧自由基，脂质过氧自由基与0 2 反应，又形成脂质过氧自由基，脂质过氧自由基又再攻击其它脂质分子而发生一系列过氧化链式反应，使体内脂质过氧化物大量堆积。脂质过氧化物代谢后可生成丙二醛( m a l o n d i a l d e h y d e ，m d a ) ，m d a n - - 以进入血液循环与各组织器官的蛋白质、核酸、氨基磷脂交联形成西夫氏碱，使膜的基本特性如变构、离子转运、酶的活性发生改变，使机体抗氧化能力下降，最终必然影响器官的功能及整体的运动能力，导致运动性疲劳的发生。同时，长期大强度训练或运动可因营养物质的耗竭、机体神经内分泌功能的改变及自由基对免疫细胞膜的攻击等原因致使机体免疫功能受到抑制，例如，p a h l a v a n i j f 究发现长期的强化训练抑制了免疫功能，包括减少循环血液中淋巴细胞数量，改变淋巴细胞亚型，抑制淋巴细胞增殖，n k 细胞( n a t u r a l k 豇l e t 。n k ) 、l k 细胞( 1 y m p h o k i n ea c t i v a t e d k i l l e r c e l l s ，l a 硒的细胞毒活性，减少白细胞介素2 ( i n t e r l e u k i n 2 ，i l - 2 )和粘膜分泌型i g a( 1 m m u n o g l o b u l i na ，l g a ) 的分泌等。金其贯【3 l 的研究表明大强度负荷训练后，大鼠血清l l 2 含量，淋巴细胞转化率以及谷氨酰胺、精氨酸含量、血清总抗氧化能力均显著降低，而血清可溶性白细胞介素2 受体( s o l u b l e i m e r l e u k i n 2r e c e p t o r ，s l l 2 r ) 含量和淋巴细胞凋亡率却显著升高。机体免疫功能的下降，导致机体对疾病的抵抗力下降，机体免疫能力下降迸一步促进运动性疲劳的发生。运动性疲劳的发生是制约运动训练水平的重要因素如何延缓运动性疲劳的发生和消除运动性疲劳己成为提高运动能力的关键。为了尽快的消除疲劳，提高身体的抗疲劳能力和运动成绩，各种抗疲劳的营养补剂的研究开发在世界范围内方兴未艾，使得各种营养补剂如：维生素c 、维生素e 、谷氨酰胺、番茄红素、螺旋藻、各种中药补剂等层出不穷。并且科研人员还在不断的进行这方面的研究探索工作，希望能为提高运动员机体的抗氧化能力、尽快消除疲劳以及提高运动水平找到更好的、无毒安全而有效的抗疲劳营养补剂白藜芦醇( r e s v e r a t r 0 1 ) 化学名为3 ，4 ，5 - 三羟基1 ，2 - 二苯乙烯( 3 ，4 ，5 -湖北大学硕士学位论文t r i h y d r o l y s t i l b e n c e ) ，属芪类结构的非黄酮类多酚化合物，分子式c 1 4 1 1 1 2 0 3 ，分子量2 2 8 2 5 ，是一类主要存在葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化合物。目前，至少已经在2 1 个科3 1 个属的7 2 种植物中发现了白藜芦醇及其苷。人们对白藜芦醇的作用研究在近几年来取得了很大的进展。目前研究发现白藜芦醇具有多种药理活性，包括抗氧化活性、生长抑制活性、免疫调节作用、诱导细胞凋亡、抗肿瘤活性以及化学预防作用等。鉴于其分子中有三个酚羟基，人们推测它可能是一种氧自由基清除剂，通过抗氧化效应实现其保护作用。现已证明白藜芦醇能明显抑制大鼠红细胞的自氧化溶血和由h 2 0 2 g i 起的氧化溶血，对大鼠心、肝、脑、肾等脏器的体外过氧化脂质的产生有明显的抑制作用；对f c n t o n反应产生的羟自由基和由黄嘌呤黄嘌呤氧化酶自由基发生系统产生的超氧阴离子有明显的抑制作用，而且能以剂量依赖的形式抑制由拂波酯诱导的h l 印( h u m a nl e u c o c y t el o c u s6 0 ，人白细胞6 0 位点) 细胞株产生的自由基。o l a s 等【4 】报道白藜芦醇对o n o o 一引起的血浆蛋白的氧化、硝化损伤有保护作用，b r i t o 等【5 1 报道白藜芦醇对o n 0 0 一引起的低密度脂蛋白的氧化有保护作用。f a u c o n n e a u 发现自藜芦醇可阻断微粒体及低密度脂蛋白中金属离子诱导的脂质过氧化，认为其二苯乙烯类物质分子结构中b 环上的4 - 羟基和a环上的问位羟基结构是其抗氧化活性所必需的除了强大的抗氧化作用外，白藜芦醇同时具有免疫调节作用。动物体外实验中，白藜芦醇在1 1 0 0 p m 浓度范围中，呈剂量依赖性的抑制腹腔巨噬细胞产生活性氧中间物和活性氮中间物的功能；在1 0 i m 以上浓度能抑制腹腔巨噬细胞的噬酵母菌和呼吸爆发的功能【6 】。白藜芦醇( 4m gk g 1 ) 灌胃给药能对抗乙醇( 1 6 ，w n ) 对小鼠迟发型超敏反应的抑制作用对脾脏淋巴细胞亚群无明显改变，但能逆转乙醇对脾游巴细胞中巨嘻细胞数量和主要组织相容性复合体1 1 分子( m a j o rh i s t o - c o m p a t m i l i t yc o m p l e x ，m i - i c )表达的下调作用，说明白藜芦醇促进t h l ( h e l p e rtc e l l ，t h ，辅助性t 细胞) 细胞因子产生及影响巨嗜细胞功能是其促进小鼠细胞介导的免疫反应的机制i 一。m e i s h i a n y 等的研究也表明从葡萄皮中提取的白藜芦醇能增强免疫功能低下或缺陷小鼠t 辅助细胞活性。b r o w n 的研究表日j j 2 5 1 0 m gk g 1 的白藜芦醇灌胃能增强免疫抑制模型鼠的体液免疫功能。并且研究已表明白藜芦醇是一种安全无毒的营养补剂四2 0 0 0 年1 0 月在美国拉斯维加斯举行的国际健康食物增补剂会议上，白藜芦醇被列为健康食物增补剂目前，白藜芦醇被广泛运用于药物学、临床医学、营养学中的研究，已成为这些研究领域中的热点，但在运动医学领域尚处于研究空白点。基于上述白藜芦醇强大的抗氧化作用和免疫调节作用，我们推测白藜芦醇能影响大强度运动训练后机体的抗氧化功能21 前言和免疫功能，从而起到抗运动性疲劳的作用，因此进一步研究探讨白藜芦醇对大强度运动训练后机体的抗氧化和免疫功能的影响具有十分重要的意义。1 2 研究目的本课题选用s i g m a 公司的纯度为9 9 的自藜芦醇，通过6 周耐力训练小鼠模型，运用免疫脏器指数、免疫细胞功能、白细胞计数及分类、淋巴细胞亚群、细胞因子以及红细胞抗氧化功能，各组织抗氧化功能等指标检测白藜芦醇对耐力训练小鼠的抗氧化功能和免疫功能的影响，为白藜芦醇在抗运动性疲劳中的实际应用提供理论依据，并为白藜芦醇作为运动营养补剂的研究开发奠定基础。湖北大学硕士学位论文2 文献综述2 1 白藜芦醇的抗氧化作用活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 不但包括羟自由基( o h ) ，超氧自由基( 0 2 f ) ，还包括过氧化氢( h 2 0 2 ) 。现已证明众多疾病的发生发展都与r o s 氧化反应的参与有关【9 - 1 0 ，而自由基是氧化反应的发起者【1 1 1 ，是许多疾病的发展过程中的关键因素，因此白藜芦醇所具有的抗氧化，诱除自由基及影响花生四烯酸的作用尤为引人注意。研究者对白藜芦醇的抗氧化功能研究目前主要集中在对癌细胞，心血管疾病，神经系统以及对缺血性再灌注损伤等方面的作用。2 1 1 对癌细胞的作用氧化和自由基损伤被公认是引起细胞d n a 损伤进而导致细胞恶变的重要机制之一1 1 2 l 。1 9 9 7 年j a n g j l 3 】系统的报道了白藜芦醇的抗肿瘤作用，认为白藜芦醇对肿瘤的起始、促进、发展三阶段均有抑制作用：能够抗突变，抗氧化，抑制自由基并诱导u 期药代酶( 抗起始活性) ，还能抑制环氧化酶和过氧化氢酶的活性，并能诱导人早幼粒细胞性白血病细胞株h l - 6 0 的分化。从此，人们对其抗肿瘤活性的研究逐渐成为白藜芦醇的研究热点。但迄今为止，学术界对其抗肿瘤活性的具体机制尚未达成一致。s t e p h e n 1 4 l 等人的研究证明，白藜芦醇能抑制r o s g i 起的细胞膜脂质过氧化反应和d n a 损伤，而且通过对n f - k b 信号活化抑制而对对金属铬诱导产生的自由基有显著的抑制作用。自藜芦醇还可以通过阻止核转录因子加的活化抑制脂多糖诱导n o s 合成的系列反应，而n f - t b 在调控细胞增殖、凋亡及肿瘤的发生起着关键作用，因此推测其在对调控细胞增殖、凋亡及抗肿瘤等方面具有一定的作用。o b e r e y 报道了白藜芦醇能使h e l a 细胞内源性o z 量减少，从而使细胞增殖受到抑制，这可能是白藜芦醇改变了h e l e 细胞内部的氧化还原态而引发细胞分化。而朱振勤等人的研究证实了白藜芦醇能提高h e l e 细胞内源超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 的活性及g s h 的含量，但可使过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t )的活性显著下降，提示白藜芦醇能显著改变细胞内部的氧化还原态。象大多数多酚类抗氧化物一样，白藜芦醇在体外能促使氧化的d n a 降解，特别是在某些金属离子如铜的存在下，白藜芦醇与铜离子鏊合具有促氧化作用【1 5 1 。迸一步研究，r e t e t 【1 6 1 等人认为，白藜芦醇所具有的抗氧化作用或促氧化作用主要取决于细胞自身的氧化还原态，当细胞内自由基浓度较高时，白藜芦醇能显著减少自由基的水平及由丁盐酸和曲古柳菌素a 诱导的细胞死亡，而当细胞内自由基浓度很低时，白藜芦醇能提高细胞内的自由基浓度，这可42 文献综述能是由于白藜芦醇的结构使得它通过对不同的感受器的作用而对细胞具有选择性作用。由此可推测，白藜芦醇可通过抗氧化而具有抗动脉粥样硬化的作用，通过促氧化而具有抗肿瘤的作用2 1 - 2 对神经系统的作用r o s 既可以参与脂质过氧化、d n a 断裂、蛋白质修饰变性及影响细胞内信号转导和基因表达，又可以引起神经细胞几组织能量代谢系统障碍，又可促发细胞内c a 2 + 内流，使c a 2 + 超载，且使c a ：+ - a t p 酶失活，可导致神经变性坏死。s u n l l 7 】等报道白藜芦醇可通过抑制自由基反应保护嗜酒患者脑损伤后神经细胞功能体内外实验均发现白藜芦醇可以有效保护细胞中遗传物质d n a 等免受氧化反应的侵害，从而保证细胞的增殖与分化及维持功能正常【1 引。造成中枢神经细胞氧化应激的另一重要物质是活性氮，如n o 自由基【1 9 1 n o 是一种小分子气体，有较高的脂溶性，并与f p 有很高的亲和力；同时，它的分子结构中含有不配对电子，所以它理化性质非常活泼，本身就可作为一种自由基参与自由基反应。所以它能快速通过细胞膜，因而在包括神经细胞在内的许多细胞之间起着非常广泛的作用。在各种中枢神经系统病理学中造成大量n o 产生的途径之一是由于在各种刺激下小神经胶质细胞和吞噬细胞产生过多的诱导性n o 合酶( i n d u c t i b a l 硫r i co x i d es y n t h a s e ，i n o s ) 闭。激活的小神经胶质细胞不仅产生n o ，还产生r o s 、促炎症细胞因子如白介素1 b 等细胞毒性分子，伤害周围的神经组织1 2 ”。在体外实验中，高浓度的白藜芦醇( 1 0 0 u m ) 能有效清除n o 及抑制由y 干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n y1 诱导的n 9 细胞的i n o s的表达【1 们，i n o s 信号传导途中的核因子n f - k b 能产生信号级联反应而增加i n o s 的表达。而白藜芦醇能抑制n f 二肥的产生从而抑制n o 的产生l 。但也有人报道白藜芦醇和1 ，2 二苯乙烯的派生物对小鼠巨噬细胞中的i n o s 活性只有微弱的作用i 矧。实验结果的不同也许是由于用药浓度和实验方法相异所致。2 1 3 对心血管的保护作用研究表明，白藜芦醇能从多方面多环节对心血管产生保护作用。r o s 被认为是心血管组织中的一种重要信号分子。r o s 产生过多可使促有丝分裂因子的合成增多，从而促使血管平滑肌细胞过度增生和血管内斑块的形成，导致动脉粥样硬化的发生【2 4 】。r o s 还可以作为第二信使调节细胞间的各种信号级联反应及各种转录因子如活化蛋白1 的活性1 2 5 1 ，以及调节心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞中内皮素1 的产生删。白藜芦醇能湖北大学硕士学位论文通过减少r o s 的产生而抑制血管紧张素2 诱导的细胞增殖，调节信号调节激酶的磷酸化作用，及抑制内皮素1 基因的表达以及各种平滑肌细胞的增生【2 7 l 。体内外实验都表明【2 8 l ，红葡萄酒中的多酚化合物能抑制两种促血管生成因子即血管内皮素生长因子和距阵金属蛋白2 的表达，阻止内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖，从而产生抗血管生成的作用。多酚类化合物的这种作用除了与其抗氧化有关，还与其预防r o s 的形成和显著降低h 2 0 2诱导的血管平滑肌细胞中血管内皮素生长因子的释放有关。因此，白藜芦醇的抗血管生成作用合理的解释了长期进食适量的红葡萄酒能有效的降低冠心病的发生率和癌症的死亡率的原因。用l o m g k g d 能j 藜芦醇给胰岛素耐受模型大鼠灌胃4 5 天能通过提高血管和心肌中的e n o s 的活性有效的防止大鼠血压升高，心脏过度肥大，抑制脂质过氧化物的产生而发挥其心血管保护作用1 2 9 j 文献报道( z o u 等，2 0 0 0 ；f r e m o n t 等，1 9 9 9 ) ，白藜芦醇可升高h d l ，调节l d l 中胆固醇的比例，抑制l d l 的氧化，其抑制u ) l 氧化的作用要比维生素e 强( f r a n k e l 等，1 9 9 3 ) w a n g 等在离体和在体试验发现，白藜芦醇还可降低由胶原、凝血酶诱导的血小板聚集率【蚓。对缺血后再灌注损伤的心肌组织，白藜芦醇通过刺激n 0 的产生和非n o 途径起到其减少心肌梗死面积、降低血浆乳酸脱氢酶和肌酸激酶的水平等保护作用p 1 1 2 2 白藜芦醇的免疫调节作用研究表明，白藜芦醇对机体特异性免疫和非特异性免疫都具有调节作用1 6 , 7 , 3 2 1 白藜芦醇体外能减少细胞毒性啉巴细胞和h 细胞数，降低c d 4 + 和c d 8 1 琳巴细胞产生的细胞因子浓度 3 2 1 。f e n g l 7 j 等的研究显示，白藜芦醇( o 7 5 - 6 l lm o f l ) 剂量依赖性的促进小鼠t 淋巴细胞的增殖和i l - 2 的生成。同时抑制i l - 1 0 的产生及促进脾脏淋巴细胞i f n y 和i l - 1 2 的生成。白细胞一内皮细胞的黏附交互作用对于同种异体移植术的成功与否具有非常重要的作用，白藜芦醇通过改善白细胞一内皮细胞的黏附交互作用减轻同种异体移植物的排斥反应，从而延长移植动物的成活掣3 3 1 。白藜芦醇的抗肿瘤作用己被众多研究证呼13 1 ”6 1 ，探究其作用机理，s h a r m a 等认为，白藜芦醇通过降低c d 2 8 和c d 8 0 的表达而显著抑制淋巴细胞的增殖、抗体的生成以及淋巴细胞因子的分泌从而抑制1 琳巴细胞、b淋巴细胞和巨嗜细胞的功能，发挥其抗肿瘤的作用l 蚓。j e a n f r a n c o i s 等则认为白藜芦醇的免疫调节作用在促炎性细胞因子( 几石，i l - 11 3 ，n - 肿) 致病的疾病中具有重要治疗前景f 蜘。进一步研究白藜芦醇的免疫功能与剂量的关系，r o b e r t o 3 2 】等人认为，白藜芦醇在62 文献综述体外实验中对免疫功能的调节是双向的，低浓度( 0 6 2 5 2 5ug m 1 ) 的白藜芦醇能提高( m 和n k 细胞的功能，而高浓度( 1 0 ug m d 的白藜芦醇抑制c 1 1 和n k 细胞的功能，其作用主要与白藜芦醇作用于c d 4 + 和c d 8 * t 淋巴细胞产生的细胞因子有关。但g 【蚓等人的研究发现，白藜芦醇的体外和体内免疫调节作用有明显的差异，虽然体外实验中自藜芦醇能显著性抑制抗原或抗体诱导的饼巴细胞增殖和细胞毒性t 淋巴细胞的产生，但给小鼠白藜芦醇( 2 m g d ) 灌胃4 星期后，发现白藜芦醇只能轻度的降低t 淋巴细胞介导的免疫反应，作者认为要导致体内免疫功能的显著抑制作用可能需要长时间的摄入白藜芦醇。白藜芦醇是否对机体免疫产生作用以及是促进还是抑制作用可能与给药剂量、途径及时间等因素有关。7湖北大学硕士学位论文3 材料与方法3 1 实验材料：白藜芦醇，购自s i g m a 公司，纯度9 9 ，分子量2 2 8 2 ；昆明小鼠7 2 只，s p f 级，雄性，4 周龄，体重( 2 2 2 9 ) ，购于广东医学院实验动物中心( 粤监证字：2 0 0 5 a 0 2 4 号) 。3 2 实验动物分组、耐力训练及其力竭游泳运动3 2 1 实验动物分组：实验小鼠常规饲养3 天，适应性游泳三天后，按体重随机平均分为三组，每组2 4只：a 组( 安静对照组) ，b 组( 耐力训练组) ，c 组( 耐力训练+ 白藜芦醇组) 。小鼠自由进水和迸食，国家标准啮齿类动物饲料分笼饲养。c 组小鼠每