（神经生物学专业论文）新生大鼠海马ca1区神经元牛磺酸诱导的电流及其调控.pdf

圈科学技术大学硕士学位论文 摘要 与牛磺酸简单结构形成鲜明对比的是其广泛的分布及复杂的生理功能。牛磺 酸在哺乳动物体内的分布存在一定的时空差异。而其在发育中的变化以中枢神经 系统( c n s ) 最为典型。牛磺酸在c n s 中含量丰富，而且浓度在出生初期达到 最大值，随后逐渐减小。特异性拮抗剂实验的结果提示牛磺酸可能通过结合并激 活g a b a a 受体和甘氨酸受体发挥其神经抑制作用。d e lo l m 等( 2 0 0 0 ) 研究了 成年大鼠海马神经元上牛磺酸的电生理性质。但神经递质受体( 如g a b a “受体、 甘氨酸受体) 表达分布在发育过程中的显著变化提示牛磺酸的生理功能在海马的 发育过程中可能会有相应的变化。我们采用膜片钳记录方法，以急性分离的2 周龄w i s t a r 大鼠海马c a l 神经元为研究对象，较系统地研究了牛磺酸诱导电流 的电生理学和药理学性质及其调控。 ，_ 结果：牛磺酸诱导电流( 七。) 的激活闽值约为o 1m m ，在o 1 。3 0m m 范 围内未观测到最大反应的平台。厄。的反转电位约为2 8m v ，接近于本实验条件 下c 1 平衡电位，提示厄。可能是c l 。电流。特异性拮抗剂实验表明中等浓度牛 磺酸( 流动的减少程度与 g a b a 释放的减少成比例。无c a 2 + 时，牛磺酸对g a b a 释放没效果。故牛磺酸 的作用可能是通过减少c a 2 + 内流实现的。荷包牡丹碱阻断牛磺酸对g a b a 释放 的抑制，这提示牛磺酸的作用可能是通过g a b a 自身受体( 如果我们认为荷包 牡丹碱是特异性的g a b a 拮抗剂) 或荷包牡丹碱敏感受体( 如果我们更谨慎一 点的话) 介导的( n a m i m a 等，1 9 8 3 ) 。 蝇蕈醇也可抑制g a b a 释放，且也面 l 瞄同样的判断。 另一方面，牛磺酸增强k + 、乌 本苷和藜芦定引起的去极化诱导 g a b a 释放( l e a c h ，1 9 7 9 ) 。 图1 - 2 为g a b a a 受体模式图。 牛磺酸非竞争性阻断g a b a 在突触 后结合位点的结合( 1 w a t a 等，1 9 8 4 ) 。 有项研究没有检测到牛磺酸的特异性 结合。作者推测牛磺酸是通过引起受 体复合物的变构来影响g a b a 的结 合的( m a l m i n e n 和k o n t r o ，1 9 8 7 ) ， 但是这也只能发生在牛磺酸结合后。 牛磺酸还可调控g a b a 的突触 后膜反应。g a b a 可在洗脱的，而不 图1 - 2g a b a 。受体模式图 ! 里型兰垫查查兰塑圭堂篁丝兰 在未洗脱的脑组织膜上刺激b e n z o d i a z e p i n e 的结合。牛磺酸在洗脱的膜上抑制 b e n z o d i a z e p i n ef l u n i t r a z e p a i n 的结合。但是在洗脱的膜上，牛磺酸轻微刺激 f l u n i t r a z e p a l r l 的结合，但对d i a z e p a m 的结合没有影响。牛磺酸可拮抗o a b a 对 b e n z o d i a z e p i n e 结合的刺激作用。但不同的研究小组报道的i c s 0 不同。由此可以 推测牛磺酸可作为g a b a b e n z o d i a z e p i n e 受体复合体的部分激动剂，影响g a b a 的识别位点，而不影响b e n z o d i a z e p i n e 的结合位点。牛磺酸的拮抗作用不能为增 加的g a b a 浓度抵消，提示这种拮抗作用是非竞争性的( 1 w a t a 等，1 9 8 4 ) 。戊 巴比妥存在时，牛磺酸可增加b e n z o d i a z e p i n e 的结合提示牛磺酸可作用于戊巴比 妥结合位点( 1 w a t a 等，1 9 8 4 ) 。 9 2 牛磺酸与甘氨酸 相比而言，牛磺酸与甘氨酸之间联系的研究就少多了。只不过相通的是， 这一研究也严重地依赖于士的宁作为甘氨酸受体拮抗剂的特异性。士的宁对牛磺 酸作用的阻断几乎无一例外的被解释为是通过甘氨酸受体介导的( h u x t a b l e ， 1 9 8 9 ) 。甘氨酸和牛磺酸都能减弱光刺激的乙酰胆碱释放，而这都可被士的宁阻 断( c u n n i n g h a m 和n e a l ，1 9 8 3 ) 。 而在其它实验中，这两种氨基酸的作用有明显差异。在蛙脊髓上，虽然甘 氨酸和牛磺酸的抑制作用都可被石斛碱和士的宁拮抗，但是0 1m m 士的宁可 阻断牛磺酸的超极化作用而对甘氨酸的无作用( k u d o 等，1 9 8 8 ) 。同样在蛙脊髓 上，t a g 阻断牛磺酸诱导的去极化，而对甘氨酸的类似效应无影响。在浦肯野 细胞上，t a g 阻断牛磺酸诱导的超极化，而对甘氨酸的无影响( y a r b r o u g h 等， 1 9 8 1 ) 。牛磺酸对g a b a 释放的抑制效应是特异性的，甘氨酸没有这种效应 ( n a r n i m a 等，1 9 8 2 ) 。 在脊髓腹侧施加甘氨酸或牛磺酸都可抑制心肺反应( g a t t i 等，1 9 8 5 ) 。士的 宁和t a g 可阻断以上效应，提示作用位点相似。但是士的宁在无牛磺酸和甘氨 酸存在时对心肺反应没有增强作用，而t a g 却有刺激作用，这提示不是同一作 用位点。甘氨酸和牛磺酸的浓度效应曲线斜率有显著差别，而如果作用同一受体 则不应出现这种情况。但是，有一研究小组没有观察到t a g 对牛磺酸抑制心肺 反应的拮抗作用( w e s s b e r g 等，1 9 8 3 ) 。 ! 里型堂垫查查堂堡主兰竺鲨兰 有众多实验结果显示士的宁和牛磺酸结合位点之间存在紧密的关系。牛磺 酸在脑干、脊髓和视网膜上竞争性减少士的宁的结合，而士的宁拮抗牛磺酸的结 合，在脑干上减少牛磺酸而不是g a b a 的抑制作用( h u x t a b l e ，1 9 8 9 ) 。 9 , 3 牛磺酸与多巴胺 4 一氨基吡啶阻断电压敏感k + 通道，从而延迟复极化，延长c a 2 + 通道开放。 因此它可以增加c a 2 + 依赖性神经递质释放。牛磺酸可以拮抗纹状体突触体上4 一 氨基吡啶对多巴胺释放的刺激作用，而g a b a 没有这种作用。 在更接近生理环境的条件下，牛磺酸和g a b a 都可增加纹状体多巴胺的释 放( 测量高香草酸的释放) 。多巴胺被摄取到突触囊泡中的过程是c l 依赖性的。 而牛磺酸可以增加c 1 。电导，其对多巴胺的作用可能是通过c 1 。调节的。牛磺酸还 可增强纹状体多巴胺的合成。将牛磺酸注射至纹状体，可引起大鼠的旋转运动， 这提示黑质纹状体通路的激活。g a b a 也可引起旋转运动，但选择性拮抗剂实 验表明这两种氨基酸是通过不同受体实现的。在大鼠黑质中注射牛磺酸可抑制 s p i n d l e 发放活性，而g a b a 没有这种作用。相似的是，6 一羟基多巴胺损毁尾状 核可削弱牛磺酸诱导的旋转行为，但对g a b a 引起的旋转行为没有影响。损毁 可以增加多巴胺的含量。以上结果提示牛磺酸诱导的旋转行为是通过黑质纹状体 一黑质下丘脑通路实现的，而g a b a 的不是这条通路。t a g 选择性阻断牛磺酸诱 导的旋转行为也提示两种氨基酸的作用通路不同。 s p i p e r o n e 是多巴胺和5 一羟色胺受体的配体。牛磺酸及其类似物t a l t r i m i d e 和m y l 0 3 减少s p i p e r o n e 在纹状体突触膜上的结合( 其中5 一羟色胺结合位点只 占1 5 ) 。对s p i p e r o n e 的结合，牛磺酸增加其亲和力，减少其结合容量( k o n t r o 和o j a ，1 9 8 6 ) 。 而纹状体中牛磺酸的释放似乎受多巴胺能系统的调节( k o n t r o 和o j a ， 1 9 8 8 ) 。 9 4 牛磺酸与肾上腺素 在外周，牛磺酸与交感神经系统之间存在一定的相互作用。在心脏中， 1 一 肾上腺素激动剂可刺激牛磺酸转运，同样，可刺激细胞c a m p 水平升高的试剂 中国科学技术大学坝：l 学位论文 也有类似效应( h u x t a b l e 和c h u b b ，1 9 7 7 ) 。研究表明这是高血压和充血性心力 衰竭引起心脏牛磺酸水平升高的机制。但是，在脑和松果腺上p 1 一肾上腺素能的 激活刺激牛磺酸的释放。肾上腺素能的激活刺激胶质细胞牛磺酸的释放，提示肾 上腺素能系统可以调节神经元一胶质细胞的相互作用。 单肾切除的，d o c a 一高血压大鼠去甲肾上腺素升高，但在饮水中添加1 牛 磺酸后，这种升高几乎被完全抑制。血压也降下来了。口服牛磺酸可降低高血压 患者的血压，同时削弱交感肾上腺素t o n e 外周施加牛磺酸也可阻断d o c a 盐高血压大鼠下丘脑中去甲肾上腺素的 升高。 在高血压和正常血压动物上，中枢施加( i c y ) 牛磺酸可降低血压、心率和 胶感神经活性。 在松果腺中，牛磺酸刺激n 一乙酰基转移酶活性，增加a c e t y l s e r o t o n i n 产量 4 0 倍，褪黑色素2 5 倍。这一效应似乎是由d 一肾上腺素能系统介导的，因为l 一 心得安可特异性阻断这一效应。在去神经支配的松果腺中牛磺酸也有类似效应， 但显然这不是由去甲肾上腺素释放引起的。 对于刺激诱导的去甲肾上腺素释放，牛磺酸具有刺激和抑制效应，这取决 于内源性牛磺酸的水平和所检测的组织。在额叶切片中观察到的是增强效应，而 在枕部切片中观察到的是抑制效应。另一研究表明，午磺酸可以增加中脑去甲肾 上腺素的水平，但减少下丘脑去甲肾上腺素的水平。这一效应可能是浓度依赖性 的，高浓度牛磺酸抑制释放。在清空牛磺酸的脑组织中这一效应更显著。牛磺酸 对k + 诱导释放的刺激效应可能是由突触前一肾上腺素受体介导的，同时与刺激 一分泌偶联所需c a 2 + 的增加有关。而在皮层和s u p e r i o rc e r v i c a lg a n g l i o n 上，牛磺 酸对刺激诱导的去甲肾上腺素释放有抑制作用，而对其自发释放没有影响。而且， 牛磺酸抑制突触体预先加载去甲肾上腺素的释放。 牛磺酸对运动行为和温度调节似乎是通过儿茶酚胺能系统介导的 ( a l d e g u n d e 等，1 9 8 3 ) 。 9 5 牛磺酸与5 羟色胺 牛磺酸与5 一羟色胺之问的相互作用研究较少。牛磺酸减少下丘脑5 - 羟色胺 中国科学技术大学预士学位论文 t u m o v e r ( a l d e g u n d e 等，19 8 3 ) 。p - c h l o r o p h e n y l a l a n i n e 处理可降低脑内5 - 羟色胺 含量，而这可以削弱牛磺酸诱导的体温降低。因此，牛磺酸诱导体温降低可能部 分通过5 一羟色胺能系统介导。同时有实验提示牛磺酸对泌乳刺激素分泌的刺激 效应可能是由5 一羟色胺能系统介导的。 9 6 牛磺酸与胆碱能 在蟑螂腹神经节、脑片、视网膜、肾上腺、s u p e r i o rc e r v i c a lg a n g l i o n 和大 脑皮层切片上，牛磺酸抑制乙酰胆碱释放( h u x t a b l e ，1 9 8 9 ) 。在第一种系统上， 牛磺酸的作用不受t a g 、高浓度c a 2 + 或4 - a r n i n o p y r i d i n e 影响，但可被t h e o p h y l l i n e 阻断，提示这种作用是通过c a m p 水平的改变实现的。运动神经元上c s a 脱羧 酶和胆碱乙酰转移酶的共存提示牛磺酸突触前作用。而且，牛磺酸非竞争性抑制 c a r b a m y l c h o l i n e 诱导的蛙腓肠肌收缩。 9 7 牛磺酸与谷氨酸 脑中牛磺酸和谷氨酸水平密切相关，提示他们在细胞结构上共存( h u x t a b l e 等，1 9 8 2 ) 。牛磺酸刺激遗传性癫痫大鼠谷氨酸脱羧酶活性。 在豚鼠小脑切片或大鼠小脑颗粒细胞上，牛磺酸对刺激诱导的谷氨酸释放 作用较小。在某些系统中，牛磺酸可以抑制谷氨酸诱导的去极化。牛磺酸对 n m d a 受体的效应最强。牛磺酸对谷氨酸反应的作用是非竞争性的，而且牛磺 酸对k a 的结合没有影响。 1 0 牛磺酸与c a m p 牛磺酸可以阻断脑片中c s a 诱导的c a m p 升高，但不阻断天门冬氨酸或谷 氨酸诱导的c a m p 升高( b a b a 等，1 9 8 2 ) 。而且，g a b a 和甘氨酸也可阻断c s a 诱导的c a m p 升高。 牛磺酸同样可以拮抗去甲肾上腺素、腺苷和组胺对海马c a m p 水平的影响。 而且，牛磺酸可以拮抗昆虫神经递质章鱼胺在蟑螂血细胞上诱导c a m p 升高 ( h a y a k a w a 等，1 9 8 7 ) 。牛磺酸同样可以抑制昆虫中枢神经系统章鱼胺的释放， 从而调节胺能系统。 、 ! 里型兰垫查叁兰堕兰兰垡堡兰一一 牛磺酸同样与嘌呤受体系统有关。在星状胶质细胞上，添加腺苷的孵育液 可引起c a m p 升高以及刺激牛磺酸释放。腺苷阻断剂i s o b u t y l m e t h y l x a n t h i n e 可以 阻断这种效应，而b 受体阻断剂心得安( p r o p r a n o l 0 1 ) 没有这种作用。其它研究 提示瞟呤a 2 受体参与这种效应。膘呤a l 受体激动剂增加牛磺酸释放，但对c a m p 水平没影响。 在视网膜色素皮层细胞上，c a m p 可以抑制吞噬作用，而牛磺酸可以拮抗 c a m p 的作用( o g i n o 等，1 9 8 3 ) 。控制吞噬作用对于维持视网膜的功能非常重 要。褪黑色素是停止吞噬作用的胞外信号，而c a m p 是胞内信号。实验显示c g m p 取消胞内“停止”信号，而牛磺酸取消胞外“停止”信号。因此，光感受细胞周 围牛磺酸：褪黑色素的比例控制着吞噬活性。 粘液菌上牛磺酸也有类似效应。它们有时以单细胞分散分布。而为了繁殖 的需要，它们聚集到一起。葡萄糖可以抑制这种聚集，牛磺酸通过调节胞内c a m p 水平可以清楚这种抑制作用。 牛磺酸提高小脑c g m p 水平，还可激活心脏鸟苷酸环化酶。 在心脏中，牛磺酸拮抗压力诱导的环核菅的含量，阻断p 受体可大大削弱其 对c a m p 的作用。牛磺酸减少心脏c a m p 含量可能是通过腺苷酸环化酶和磷酸 二酯酶实现的。 1 1 1 概述 1 1 牛磺酸与钙的相互作用 已有大量文献报道牛磺酸一钙相互作用：牛磺酸对c a ”结合和转运的作用及 对c a 2 + 依赖性刺激事件的调节。 首先简要介绍一些有关钙的基本知识。胞外c a ”的浓度在m m 数量级：其 中血浆中约为2 4m m ，组织间隙中约为1m m 。而胞内c a ”的浓度较胞外的低 3 - 6 个数量级。这提示c a 2 + 的高亲和力( 如u m ) 的结合和转运在生理条件下发 生在胞内，旨在将钙从胞浆转移至胞外或细胞器内：另一方面，低亲和力( 如 r a m ) 的过程一般发生在胞外。钙顺浓度梯度进入细胞，此过程是不需能量的； 而钙逆浓度梯度转移出细胞或进入细胞器，则需要直接或间接地消耗能量。钙迸 中国科学技术大学硕士学位论文 入细胞的途径包括：电压门控或配体门控离子通道，交换过程( 如n a + c a 2 + 交 换) 。将钙从胞浆移走的所需的c a 2 + 泵一般分布在线粒体、肌质网和质膜上。 钙在大分子的构造变化和水合作用中有显著作用。钙的作用如此强烈，以 至于细胞功能只能在近乎无钙的环境下才能平稳进行。因此质膜的一项主要功能 就是维持胞内外3 - 6 个数量级的浓度梯度。虽然高浓度的细胞钙对于生命活动是 不合适的，但是c a 2 + 对大分子构型显著改变的能力使得其可以在众多生物过程中 发挥有效的调节作用。对c a 2 + 浓度的精细调节可以可逆地改变分子构型，这可以 使c a 2 + 充当兴奋一收缩耦联和兴奋一分泌耦联的启动剂等。对c a ”进入细胞的调 节可以控制胞内c a = + 浓度的凋节。c a 2 + 内流的增加本身可以开启或关闭某些过 程，或触发胞内钙库释放c a ”。 牛磺酸在心脏、脑、视网膜和其它组织中可以调节众多c a ”依赖性过程。 其中大多数效应是双向的，受c j + 浓度和缓冲系统等因素的影响。 有关牛磺酸调节c a 2 + 内流的研究结果丰富而复杂。研究表明牛磺酸可以直 接改变组织c a 2 十外流的动力学。”c - n m r 研究表明这不是通过牛磺酸与c a 2 + 螯 合作用引起的，因此牛磺酸看来是间接调节c a 2 + 移动的。从而问题演变成了：牛 磺酸通过何种方法和在何种条件下改变膜结合和转运c a 2 + 。 在很多研究中，并没有严格区分c a 2 + 转运和结合，故下文中“摄取”一词 将用于相对模糊的结果中。 1 1 2 高亲和力胞内钙流动 在m m 范围的c a 2 + 存在时的钙摄取被认为是高亲和力摄取。研究发现牛磺 酸在a t p 、重碳酸盐和n a + 存在条件下刺激c a 2 + 的高亲和力摄取。在心肌 s a r c o l e m m a 中，o 1m mc 矿存在时无刺激效应，而低浓度时存在刺激效应。 这种a t p 依赖性刺激依赖于重碳酸盐的存在。在众多膜系统中，如心 s a r c o l e m m a 、视网膜视杆外段和d i s c 膜、脑突触体和线粒体，a t p 存在和重碳酸 盐不存在时牛磺酸没有刺激效应。唯一的例外是在脑微粒体上，同样的条件，牛 磺酸减少c a 2 + 摄取( 1 z u m i 等，1 9 7 7 ) 。但是当n a + 水平降低时这种抑制效应消失。 在视杆细胞外段，碳酸盐缓冲系统中，0 4n m o l m g 蛋白的本底摄取在a t p 存在时增至8 2n m o l m g 蛋白。这种摄取是耗能的，因为它是m 9 2 + 依赖性的， ! 里型兰垫查盔兰堡兰堂堡垒兰一 而且a t p 非水解类似物没有类似的效应。牛磺酸的进一步增强效应是否是由于 牛磺酸的膜稳定作用减弱膜裂解和随后的? k u o 和m i k i 在光感受器细胞d i s c 膜 上的研究结果提示其原因更为复杂，因为他们同时发现牛磺酸增强c a 2 + t u m o v e r 。 也就是说，在碳酸盐一a t p 缓冲系统中牛磺酸同时增强c a 2 + 的摄取和释放。这提 示牛磺酸不仅影响膜裂解，而且直接或间接影响c a 2 + 通道，或许是改变通道周围 脂环境。 视网膜突触体的c a 2 + 高亲和力摄取在线粒体代谢阻断剂存在时受到抑制。 这提示突触体中存在线粒体。 重碳酸盐显然不是纯粹的惰性缓冲试剂，它可以调节h 十含量。心脏浦肯野 纤维的电生理性质在重碳酸盐缓冲系统和h e p e s 缓冲系统中明显不同，这被认 为与膜重碳酸盐的通透有关。c o u r t n e y ( 1 9 8 1 ) 发现豚鼠乳突肌在重碳酸盐缓冲 系统中牛磺酸升高静息膜电位，缩短动作电位时程，及加快去极化速度。而骨骼 肌纤维中牛磺酸也有类似效应。无重碳酸盐溶液可显著延长抗心律不齐药剂作用 乳突肌的时间。重碳酸盐在c n s 中还可调节s e r o t o n i n 的结合，增强m n 2 + 依赖性 结合3 - 4 倍。这是通过增加高亲和力结合位点和诱导低亲和力位点实现的。重碳 酸盐还有众多其它的作用：调节g a b a 受体的结合，改变儿茶酚胺反应，参与 乙酰胆碱储存。 悬浮在重碳酸盐缓冲溶液中的s a r c o l e m m a l 囊泡较t r i s 中的通透性更强，这 部分说明了重碳酸盐的作用。囊泡中的c a 2 + 外流至含e d t a 溶液中的h a l ft i m e 在含重碳酸盐的k r e b s h e n s e l e i t 缓冲系统中为1 3 分钟，而在t r i s 缓冲系统中为 1 9 分钟。而且，在t r i s 缓冲系统中高亲和力c a 2 + 吸收在c a 2 + 离子载体a 2 3 1 8 7 中翻倍。有种解释是离子载体是通过增加膜上可结合面积来增加c a 2 + 通透性的。 而在k r e b s h e n s e l e i t 缓冲系统中a 2 3 1 8 7 对c a 2 + 吸收没有影响，提示囊泡的“内 侧”已经可以结合c a 2 + 了。无通透能力的阳离子镧离子，在k r e b s h e n s e l e i t 缓 冲系统中可以消除c a 2 + 的结合，提示镧离子可以穿透并结合至囊泡内c a 2 + 的结 合位点。但是，在t r i s 缓冲系统中约1 5 的c a 2 + 接合不受镧离子的影响。这些残 余的c a 2 + 结合可能是通过c a 2 + 离子通道或c a 2 + 转运体等进入囊泡的，残留在囊 泡中，不受镧离子影响。 显然在s a r c o l e m m a 中，重碳酸盐的影响决非局限在增加囊泡通透性上。 中国科学技术人学硕士学位论文 k r e b s h e n s e l e i t 缓冲系统中高亲和力c j + 吸收较t r i s 缓冲系统中的低。而低亲和 力的c a 2 + 吸收与重碳酸盐浓度相关。这种推理是由c a 2 + 吸收的b 。a x 改变大于i ( d 得来的。在含1 0m m 重碳酸盐的缓冲系统中( 含1 4 0m mn d ) ，b m a x 是1 6 4 l a m 0 1 m g 蛋白。而在2 5 m m 和5 0 m m 重碳酸盐时降为1 0 6 和7 4n m o l m g 蛋白。 在视网膜中牛磺酸刺激c d + 吸收时，同时也抑制 7 - ”p a t p 的蛋白磷酸化 作用。这两种现象看起来是有互联系的。可以排除牛磺酸影响a t p 酶或磷酸酶 活性的可能。牛磺酸的类似物a m i n o e t h y l h y d r o g e ns u l f a t e 同样刺激c a 2 + 吸收和抑 制磷酸化。a m i n o e t h y l h y d r o g e ns u l f a t e 同时是磷脂极性头部的结构类似物。这种 牛磺酸的相对普通而低亲和力作用，提示牛磺酸调节磷酸化过程所处的膜环境。 实际上，1 0 u mc a 2 + 存在时，在视网膜上2 0m m 牛磺酸将c a 2 + 吸收的过渡温度 从1 7 9 c 升至2 5 4 c ，同时降低活化能。刺激磷酸化和a t p 依赖的c a 2 + 吸收的 结构活性研究已有开展。牛磺酸类似物t r a n s 一2 一a m i n o c y c l o h e x a n es u l f o n a t e 抑制 吸收，增强磷酸化；而c i s 一2 一a m i n o c y c l o h e x a n es u l f o n a t e 作用相反。这两种类似 物体现了牛磺酸分子两种不同的l o c k e d 构型。 一般来说，在无a t p 和重碳酸盐存在的条件下，牛磺酸可以刺激c a 2 + 的高 亲和力吸收。这种刺激是n a + 依赖性的。例外，低n a + 条件下，牛磺酸轻微抑制 心脏s a r c o l e m m a2 u mc d + 的吸收。1 4 9 mc a ”时抑制效应消失，而0 0 8m m 或更高浓度c a 2 + 时有刺激作用。 牛磺酸对c d + 吸收的作用具极高特异性。其低级同源物磺酸氨基甲烷，在 a t p 和重碳酸盐存在时，抑制而非刺激高亲和力c d + 吸收。其高级同源物， a m i n o p r o p a n es u l f o n i ca c i d 却没有影响。其它同源物如甘氨酸、g a b a 、b 一丙氨 酸、谷氨酸和g e s 也没有影响。 1 1 3 低亲和力( 胞外) 钙流动 一般来说，低亲和力c a 2 + 吸收不受a t p 影响。重碳酸盐存在时牛磺酸抑制 c a 2 + 吸收。而无重碳酸盐时，牛磺酸一般对低亲和力c a 2 + 吸收无作用或抑制作用。 研究所才采用的方法对本研究有较大影响。如采用微孔过滤和平衡透析研 究牛磺酸对低亲和力c d + 吸收的影响会得出相反的的结果。牛磺酸存在时结合值 测得的结果相同，而微孔方法得出的对照值较其他方法的高( 如2 0 0n m o l m g ! 里型兰垫查叁兰堡主兰垡丝苎一 蛋白对3 5n m o l m g 蛋白) 。这些差异主要与缓冲系统的滞留能力有关。 在其它缓冲系统中，如i m i d a z o l e 和t r i s 缓冲系统中，牛磺酸显著地抑制视 网膜视杆细胞外段低亲和力c a 2 + 吸收。而在h e p e s 中没有作用。在心脏 s a r c o l e m m a 中牛磺酸的效应与c a 2 + 浓度有关。2 5m mc a 2 + 时，牛磺酸为刺激 作用，4 5m mc d + 时无效，7m mc d + 时为抑制作用。这是由于s a r c o l e m m a l 对c a 2 + 的亲和力有4 6 升至1 9m m 的同时牛磺酸引起最大结合由1 5 5 降至1 0 6 n r n o l m g 蛋白。大鼠突触体膜结构也观察到类似结果。至于高亲和力结合位点牛 磺酸也有类似效应。这一效应似乎是基于调节膜上酸性磷脂的c a 2 + 结合性质，因 为在纯的和混合的磷脂组成的人造小泡上牛磺酸也有类似效应。 n a + 浓度也是调节牛磺酸作用的重要因素。在无a t p 存在的情况下，牛磺酸 对c d + 吸收的影响有不同的报道。目前还没法对此给出合理解释。钠竞争c d + 的结合位点并通过n a + c a 2 + 交换体调节c d + 的流动。无n a + 时，交换体变成 c j + c a 2 + 同交换体h o m o e x c h a n g e r 。 a t p 存在而重碳酸盐和n a + 不存在时，牛磺酸刺激牛蛙和h a m s t e r s a r c o l e m m a 的c a 2 + 吸收。心肌症h a m s t e r 的s a r c o l e m m a 结构和生化性质都有很 大损伤，在这种动物上则没有刺激作用。这种刺激依赖于c a 2 + 浓度，通常为1m m 或更高浓度。 一般来说，a t p 存在时牛磺酸刺激低亲和力c d + 吸收，而重碳酸盐存在时 抑制吸收。 有种观点认为，牛磺酸对低亲和力c a ”吸收的抑制作用可保护脑免受缺氧 时( 可引起胞外牛磺酸浓度快速升高) c a ”内流造成的有毒害效应。 脑片中c d + 外流不受牛磺酸影响。但是，在发育中的小鼠脑中，牛磺酸可 阻止k + 一去极化诱导的c a 2 + 释放增加。c a 2 + 离子通道拮抗剂v e r a p a m i l 可消除这 效应，提示牛磺酸可能可以调节电压门控c d + 通道。也有报道认为牛磺酸与 c a 2 + 通道拮抗剂之间有相互作用。v e r a p a m i l 处理的h a m s t e r ，其心脏中牛磺酸水 平升高。而且，牛磺酸和c d + 通道拮抗剂n i f e d i p i n e 可保护分离的视网膜实干细 胞外段在无c d + 溶液中免于破裂。细胞膜破裂是n a + 内流及随后细胞发生肿胀的 结果。牛磺酸的保护作用则可能与其渗透压调节及减少n a + 内流有关。心脏中称 为钙p a r a d o x 中，牛磺酸发挥着类似的效应。 ! 里型兰垫查查兰堡! ：堂堡堡苎 n a + k + 一a t p 酶也被认为是牛磺酸的作用位点。刺激n a + k + - a t p 酶活性可 以减少低亲和力c a 2 吸收，这可能是因为n a + c a 2 十交换减弱了。这方面的研究 有较大分歧。有研究认为牛磺酸可以刺激n a + k 十一a t p 酶活性，k l 2 为3 9 m m 。 但是其他研究者即使在同样的条件下也没观察到这种刺激效应。有种可能是牛磺 酸如果不刺激n a + k + 一a t p 酶活性，也可保护其活性。重金属和c a 2 + 可以抑制 n a + k + - a t p 酶活性。后者的k i 约为2m m ，即与组织间隙中的浓度相近。牛磺 酸对膜结合c a 2 + 的作用可以调节n a + k + 一a t p 酶活性。猫视网膜分离的视杆细胞 外段和内段存在两种n a + k + 一a t p 酶，分别以高亲和力和低亲和力结合a t p 。但 是在牛磺酸缺失的动物中，却没有观察到高亲和力结合a t p 的n a + k + _ a t p 酶。 1 1 4 牛磺酸钙磷脂相互作用 牛磺酸对生物膜的低亲和力结合特性可以在人造磷脂小泡上重现：m m 亲 和力，正协同性，结构一活性必要条件，和阳离子拮抗作用。高亲和力结合发生 在中性磷脂，p h o s p h a t i d y l c h o 】i n e 和p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e 上。牛磺酸在酸性 磷脂p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 制备的小泡上没观察到结合。在脂质体中胆固醇( 影响 膜的流动性) 可以增加结合的亲和力。 在酸性磷脂制备的小泡上，或在混和磷脂( 包含酸性磷脂) 制备的小泡上， 可观察到c a 2 + 的高亲和力结合。中性磷脂对c a 2 十的结合较少。牛磺酸刺激c a 2 + 在磷脂小泡上的结合与在心脏s a r c o l e m m a 和脑突触体上的效应相似。值得注意 的是，含酸性和中性磷脂的小泡上的结合较预测的纯p h o s p h a t i d y l s e r i n e ( 酸性磷 脂) 小泡的高。因此，牛磺酸的效应是以下四步作用：牛磺酸主要以低亲和力结 合中性磷脂；c a 2 + 高亲和力结合酸性磷脂；牛磺酸的结合可以调节c a 2 + 的结合位 点，从而减少结合位点的数量，增加剩余位点的亲和力( s e b r i n g 和h u x t a b l e ， 1 9 8 5 ) 。顺磁性的阳离子结合磷脂小泡的”pn m r 研究支持牛磺酸一钙一磷脂相互 作用的存在。c a 2 + 浓度低于k d 时，牛磺酸增加c a 2 + 的结合；反之亦反。这种生 化变化模拟了牛磺酸作为c a 2 + 浓度函数的药理学效应，如心脏收缩。 胞内浓度的牛磺酸结合阳离子结合位点，从而c a 2 + 和n a + 也可与牛磺酸竞 争。因此，牛磺酸对c a 2 + 结合的作用，也可被c a 2 + 本身或去极化伴随的内流的 n a + 所拮抗。净效应是去极化和或内流的c a ”增加胞内c a 2 + 释放，复极化时增 生里型堂垫查查堂堡主堂篁堡塞 一一 加降低胞内c a 2 + 浓度的速度。可以预测的是，牛磺酸对磷脂膜的直接作用同样可 能会调节其它脂相关现象，如调节离子通道、调节膜结合酶和调节蛋白磷酸化过 程。 1 2 牛磺酸与锌 z n 2 + 是另一种与牛磺酸相互作用的重要的二价金属离子。锌缺乏可增加牛磺 酸的排泄( h s u 和a n t h o n y ，1 9 7 0 ) 。锌和牛磺酸都是膜稳定剂。硫酸亚铁损伤 蛙视网膜视杆细胞外段，引起细胞肿胀聚集，最终导致膜破裂。锌和牛磺酸共同 作用，可以保护细胞免受上述损害而不影响f e 2 + 对膜的过氧化损伤程度；但单独 作用没有这种保护效应( p a s a n t e s 和c r u z ，1 9 8 4 ) 。事实上，锌和牛磺酸可以阻 止过氧化造成的水和离子的过度的跨膜流动。当n a + 和c l 。被非通透性离子取代 时，损伤就不会发生。在保护培养的淋巴细胞的存活能力免受维生素a 损伤时， 锌和牛磺酸发挥着协同作用。锌和牛磺酸在阻止质膜脂类过氧化引起的渗透压紊 乱时，不影响过氧化程度。 眼后部的膜状层( t a p e t u m ) 将没被视网膜吸收的光线反射以获得再次吸收。 锌和牛磺酸对于膜状层视杆细胞周围膜的整合非常必需。猫狗中锌在膜状层中浓 度最高。牛磺酸缺乏可导致锌从膜上脱落，继而引起膜破裂和膜状层组织紊乱。 牛磺酸的抗癫痫作用与锌也有关系。而锌参与癫痫发生，同时在海人氨酸 诱导的中风模型中，锌的移动可引起神经元死亡( f r e d e r i c k s o n 等，1 9 8 9 ) 。 锌一牛磺酸复合体被认为参与了这些作用。只是它们的稳定常数对数很低， 仅为4 6 。而锌一甘氨酸复合物的为9 3 ( w r i g h t 等，1 9 8 6 ) 。 1 3 牛磺酸与发育 发育过程中很多组织中的牛磺酸含量都有较大变化。牛磺酸的含量随发育而 降低，成年动物中的浓度约为新生动物的1 3 。哺乳动物脑组织中的变化最大， 在新生哺乳动物脑中牛磺酸通常是含量最高的游离氨基酸，在随后的发育过程 中，亚磺酸半胱氨酸脱羧酶活性增强，同时牛磺酸含量降低( s t u r m a n ，1 9 9 3 ) 。 成熟脑组织中牛磺酸含量实际上还很高，只是已经被谷氨酸超过去了。人、猴、 兔、小鼠和大鼠中都是这一模式。昆虫中也是如此。例如蛾m a m e s t r ac o n f i g u r a t a 中国科学技术大学硕士学位论文 从蛹到变态过程中，牛磺酸浓度增长了2 0 倍。 出生初期是神经发育的关键时期，其它调节系统还未发育完全，脑内高浓度 的牛磺酸此时可能拥有调节电活动的功能。 由于猫自身合成牛磺酸的自邑力极低，人为控制其饮食可控制其体内牛磺酸浓 度。故猫成为研究牛磺酸在发育中的变化及功能的模式动物。研究表明，牛磺酸 清空可严重影响猫的生殖发育能力。牛磺酸被清空的猫有较高频率的胎儿再吞、 流产和死产，出生小猫体重轻、生长缓慢，而且生后的存活率较补充牛磺酸的小 猫低( s t u r m a r l 等，1 9 8 5 ) 。 小猫出生前一周清空母猫体内的牛磺酸会显著降低小猫出生率。出生后八周 小脑外颗粒细胞层的依然存在，说明小猫的神经发育也受到了损伤( 通常条件下， 这层细胞在出生后向内迁移) 。小脑神经元出生后形态和生化性质会发生显著变 化，其增殖、迁移、分化、突触形成和髓鞘形成都是精确而富有规律的。牛磺酸 的缺乏会影响这一过程。从这一角度看，牛磺酸的缺失又可被视为一类畸形生长 因素。牛磺酸对小脑发育的影响还可由以下研究结果支持，牛磺酸缺乏母猫所产 的小猫具有小脑功能失调相关的步态失常和其他神经学障碍( s t u r m a n 等，1 9 8 5 ) 。 这提示牛磺酸缺乏可延迟脑的发育。 断奶时，牛磺酸缺乏母猫所产小猫视网膜和绒毡层牛磺酸水平降低。这类小 猫有短而弯曲的视杆外段，及有缺陷的t a p e t u ml u c i d u m 。 用合成配方食品( 无牛磺酸) 喂养的婴儿测试得分较母乳( 含牛磺酸) 喂养 的低。从对素食社区小孩的研究来看，牛磺酸缺乏可产生普遍性的影响，甚至死 亡。 牛磺酸对于维持光感受器的整合和功能至关重要。在猫、猴和大鼠上，低浓 度的牛磺酸会导致其结构整合性的缺失及功能紊乱。喂食商品化狗食的家猫通常 会出现视网膜的退化。 恒河猴从出生至2 6 月喂食低牛磺酸含量的人类婴儿食品n u t r a m i g e n ( 蛋白 水解物，牛磺酸含量约为1g m o l 1 0 0m 1 ) ，也会出现视网膜退化。持续这种喂 养的猴子视网膜视锥细胞退化显著，视觉敏锐性降低。饮食中添加牛磺酸可防止 这些变化的发生( s t u r m a n 等，1 9 8 4 ) 。 牛磺酸对于维持t a p e t u ml u e i d u m 的结构整合至关重要。这一结构是多层的 中国科学技术人学硕士学位论文 反射表面，位于光感受器后，可将透射过的光发射供光感受器二次吸收。n - n 构对于夜视很重要。牛磺酸缺乏的猫t a p e t u ml u c i d u m 结构错乱且退化。 t a d e t u ml u c i d u m 由脉络膜细胞组成，这些细胞与细长的视网膜杆紧密联系 着。这些视网膜杆可作为光反射的衍射光栅。值得注意的是视网膜杆的组成有较 强的种属特异性：猫为核黄素，狗为z nc y s t e i n a t e ，牛为胶原质。 s t u h n a n 及其同事详尽总结了牛磺酸缺乏动物的研究( s t u r m a l l 等，1 9 8 4 ) 。 猫中，绒毡层视杆周围环绕着富含锌的膜。巯基化合物也存在于这层膜中。牛磺 酸参与z n 的保持，牛磺酸的缺失会导致绒毡层膜z n 的丢失，并伴随着膜的脱 落。结果是t a p e t u ml u c i d u m 受损。 在小猎犬中可以发现自然发生的绒毡层异常，这是可遗传的常染色体上的隐 性品质。具此性状的狗同时在绒毡层上有半胱氨酸的缺失。 g e s 或6 一丙氨酸引起的牛磺酸缺失也可导致视网膜结构和视网膜电活动的 严重破坏。g e s 处理可导致视杆外段的缩短和e r g 大小的减小。a - 波和b 一波幅 度的减小早于光感受器细胞的丢失。转运体拮抗剂对视网膜结构的影响提示这一 效应是牛磺酸缺失的后果，而不是清空剂本身。 中国科学技术大学硕士学位论文 第二章综述小结实验前言 牛磺酸是一种结构简单的有机小分子，其与众不同的生物学功能( 见表卜1 ) 是以其独特的理化性质为基础的：净电荷少( 跨膜转移不影响电荷分布) ，高电 离程度( 膜通透性差，利于维挣高跨膜浓度差) ，代谢惰性( 其浓度变化不会过 多影响细胞的代谢) 。 在牛磺酸的众多功能之中，渗透压调节和胆汁酸盐合成研究得较为透彻，其 神经元保护功能也得n t 公认。牛磺酸对离子通道的调控在心肌细胞中研究得较 为深入全面，相比而言在神经系统中的研究就少得多。牛磺酸对各种神经递质系 统似乎都有或多或少的作用，其中以g a b a 能和甘氨酸能系统中的研究最为引 人注目。根据特异性拮抗剂的实验结果，有学者提出牛磺酸可作为g a b a n 和甘 氨酸受体低亲和力配体。但是缺乏有力的证据完全证实之。牛磺酸还与一些胞内 信使有联系，如c a m p 和c a 2 + 等。牛磺酸可以负反馈调节 c a 2 + 】i ，尤其在心肌标 本上。 在哺乳动物中枢神经系统中，牛磺酸是含量最丰富的自由氨基酸之一，而且 在发育初期其浓度甚至超过了谷氨酸( s t u r m a n ，1 9 9 3 ) 。研究表明海马中丰富的 牛磺酸具有神经保护功能；保护神经元免受兴奋毒性( f r e n c h 等，1 9 8 6 ) ，促进 大脑缺氧后神经功能的恢复( s c h u r r 等，1 9 8 7 ) ，及拮抗钙超载( z h a o 等，1 9 9 9 ) 。 无论在成年的还是发育中的海马上，细胞损伤条件下( 如缺血、自由基损伤和代 谢毒素等) 牛磺酸的释放都有显著升高( s a r a n s a a r i 和o j a ，2 0 0 0 a b ) 。牛磺酸神 经元保护功能的机制很复杂，可能不但与其渗透压调节有关，而且与其神经抑制 有关。 对牛磺酸神经抑制活动的研究可以追溯到c u r t i s 和其同事上世纪六十年代的 发现( c u r t i s 和w a t k i n s ，1 9 6 0 ，1 9 6 5 ：c u r t i s 等，1 9 6 8 ) 。在海马中，牛磺酸增加 质膜氯离子电导，引起超极化，从而抑制锥体神经元的发放( t a b e r 等，1 9 8 6 ) 。 以拮抗剂实验为基础，c u r t i s 将神经抑制性氨基酸分为两大类，甘氨酸样和g a b a 样，而牛磺酸在不同的研究系统上可被划入不同的类别( c u r t i s 等，1 9 6 8 ，1 9 7 1 ) 。 最近，o l m o 等( 2 0 0 0 ) 报道在成年大鼠海马上牛磺酸激活g a b a a 受体，而m o r i 等( 2 0 0 2 ) 在培养大鼠海马片上观察到内源性牛磺酸可激活甘氨酸受体。 在海马的发育早期，牛磺酸浓度逐渐降低( s t u r m a n ，1 9 9 3 ) ，而且神经递质 巾困科学技术大学硕士学位论文 受体组成有显著变化( m a l o s i o 等，1 9 9 1 ：l a u r i e 等，1 9 9 2 ) 。因此可以预见，牛 磺酸的生理功能可能会随发育而改变。研究新生大鼠海马牛磺酸诱导的电流及其 调控对于全面了解牛磺酸而言是很有必要的。我们运用膜片钳记录方法，在急性 分离的2 周龄w i s t a r 大鼠海马c a l 神经元上较系统地研究了牛磺酸诱导电流的 电生理学和药理学性质及其调控。 圭里型兰垫查查兰堡主兰垡堡苎一 第三章实验研究方法 2 1 标本制备 标本制备参见徐天乐等( x u ，e ta 1 ，1 9 9 9 a ) 的方法。简单地说，两周龄w i s t a r 大鼠在腹腔内注射戊巴比妥钠5 0m g k g 的深麻醉下，快速取出脑组织。振动切 片机横切脑组织，制成4 0 0g m 厚的脑片，并在充9 5 0 2 5 c 0 2 饱和的孵育液 中孵育5 0m i n ( 2 2 2 5 。c ) 。然后，在酶p r o n a s e 和t h e r m o l y s i n 中分别消化2 0 - 3 0m i n ( 3 1 ) ，两酶均由充9 5 0 2 5 c 0 2 饱和的孵育液配制成，终浓度为0 2 m g m i 。 酶处理后，脊髓片在孵育液中继续孵育ih 。然后用电抛光的注射针头取出c a l 区，并移入充满标准细胞外液的培养皿中( f a l c o n ) 。使用热抛光的p a s t e u r 系列微 玻管( 直径1 0 0 7 0 0 a m ) 机械分离神经元，新鲜分离的神经元在2 0r a i n 内即可贴 壁( 图3 ，1 ) 。选取形态学特征保持完好的神经元( 如具有树突，胞体无肿胀等) ， 进行膜片钳记录。 图3 1 酶解分离得到的 海马c a l 神经元，有较 完整的突起。 3 国坍 为排除蛋白酶对神经元膜表面神经递质