（运动人体科学专业论文）运动性失眠大鼠建模初探.pdf

曲阜师范大学研究生学位论文原创性说明 （根据学位论文类型相应地在“”划“”） 本人郑重声明：此处所提交的博士/硕士论文运动性失眠大鼠建模 初探 ，是本人在导师指导下，在曲阜师范大学攻读博士/硕士学位期间 独立进行研究工作所取得的成果。论文中除注明部分外不包含他人已经发表 或撰写的研究成果。对本文的研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中以明确的方式注明。本声明的法律结果将完全由本人承担。 作者签名： 日期： 曲阜师范大学研究生学位论文使用授权书 （根据学位论文类型相应地在“”划“”） 运动性失眠大鼠建模初探系本人在曲阜师范大学攻读博士/硕士 学位期间，在导师指导下完成的博士/硕士学位论文。本论文的研究成果 归曲阜师范大学所有，本论文的研究内容不得以其他单位的名义发表。本人 完全了解曲阜师范大学关于保存、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 有关部门送交论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅。本人授权 曲阜师范大学，可以采用影印或其他复制手段保存论文，可以公开发表论文 的全部或部分内容。 作者签名： 日期： 导师签名： 日期： 摘要 1 研究目的 通过对不同方法建模进行比较，建立一个相对完整的运动性失眠大鼠的模型，为研究 运动性失眠的机制和治愈奠定重要的基础。 2 研究方法 本实验选取健康雌性 wistar 大鼠 85 只，将大鼠随机分为 7 组：正常组、3%运动负荷 注射 pcpa 组、5%运动负荷注射 pcpa 组、7%运动负荷组、7%运动负荷注射 pcpa 组、y 型迷 宫训练组、y 型迷宫训练注射 pcpa 组，每组 10 只。除正常组不做任何处理之外，3%运动 负荷注射 pcpa 组、5%运动负荷注射 pcpa 组、7%运动负荷注射 pcpa 组以 5 周 3%、5%和 7% 负重游泳训练+腹腔注射 pcpa；7%运动负荷组以 5 周 7%负重游泳训练；y 型迷宫训练注射 pcpa 组以 5 周 y 型迷宫训练+腹腔注射 pcpa；y 型迷宫训练组以 5 周 y 型迷宫训练。各组 大鼠摘眼球取血，加肝素抗凝待测。通过高效液相色谱-荧光检测法测定血浆单胺类神经 递质的含量。所有数据采用 spss17.0 统计软件进行统计学处理。 3 实验结果 3.1 大鼠体表特征的变化 y 迷组、7%组出现昼出夜伏的现象，但对外界感应能力、口唇颜色、体形、皮毛及抓取 时反抗强烈程度表现与 7%+pcpa 组大鼠体表特征差别很大；5%+pcpa 组大鼠虽活动频繁， 一系列体表特征均与 7%+pcpa 组大鼠有明显差别； y+pcpa 组和 3%+pcpa 组大鼠活动规律表 现的不明显，且一系列体表特征均与 7%+pcpa 组大鼠体表特征有较大差别。 3.2 各组大鼠体重变化 (1)各组大鼠组内第 3 周和第 4 周体重相比较，7%组差异非常显著（p0.01）体重急剧下 降，5%+pcpa 组差异显著（p0.05） ，体重呈下降趋势；各组大鼠组内第 4 周和第 5 周体重 相比较，7%+pcpa 组差异显著(p0.05)，体重呈下降趋势。 (2)第 5 周各组大鼠体重与 7%+pcpa 组相比，正常组差异非常显著（p0.01） ，正常组呈增 长趋势，其它各组差异显著（p0.05） ，呈下降趋势。 3.3 各组大鼠摄食量的变化 (1)各组大鼠第 3 周和第 4 周摄食量变化相比较：7%+pcpa 大鼠变化非常显著（p0.01） ， 呈急剧下降趋势，5%+pcpa 组大鼠变化显著（p0.05） ，呈下降趋势，其它各组无明显变化； 各组大鼠第 4 周和第 5 周摄食量变化相比较：7%+pcpa、y 迷组大鼠变化显著（p0.05） ， 呈下降趋势，5%+pcpa、y+pcpa 组大鼠变化非常显著（p0.01） ，呈急剧下降趋势。 (2)第 5 周各组大鼠摄食量与 7%+pcpa 相比：正常组大鼠变化非常显著（p0.01)，呈急剧 下降趋势，7%组、5%+pcpa 组、3%+pcpa 组和 y+pcpa 组大鼠变化显著（p0.05） ，呈下降 趋势。 3.4 各组大鼠血浆 ne、da 含量的变化 （1） 大鼠血浆 ne 含量， 与正常组相比， 7%+pcpa 组、 7%组极显著升高， （p0.001） ， 3%+pcpa 组显著升高 （p0.05） ； 与 7%+pcpa 组相比， 7%组、 5%+pcpa 组、 3%+pcpa 组、 y 迷组和 y+pcpa 组含量极显著低于 7%+pcpa 组（p0.001)；7%组显著低于 3%+pcpa 组（p0.05）和非常明 显低于 5%+pcpa 组、y 迷组（p0.01)；5%+pcpa 组非常显著高于 y+pcpa 组（p0.01） ；y 迷组显著高于 y+pcpa 组 (p0.05)。 (2)大鼠血浆 da 含量，与正常组相比，7%+pcpa 组极显著高于正常组（p0.001） ，7%组非 常显著高于正常组 （p0.01） ； 与 7%+pcpa 组相比， 5%+pcpa 组、 3%+pcpa 组、 y 迷组、 y+pcpa 组非常显著低于 7%+pcpa 组（p0.01） ，7%组显著低于 7%+pcpa 组（p0.05） ；与 7%组相比， 5%+pcpa 组、y 迷组、y+pcpa 组极显著低于 7%组(p0.001),3%+pcpa 组显著低于 7%组 (p0.05)。 4 结论 本实验研究采用大负荷游泳训练(运动时间：90 分钟，运动负荷：自身体重的 7%)+腹 腔注射 pcpa 所致的失眠大鼠模型，从大鼠外部体表特征、体重、食量和血浆单胺类神经 递质 ne 和 da 含量的变化特征分析，符合中医虚劳失眠症候，表明应用该方法建立失眠大 鼠模型可行性较强，可广泛应用于运动失眠和临床方面的失眠基础研究。 关键词：运动性失眠；血浆；体重；食量；单胺类神经递质 abstract 1 objective: through the comparison of different modeling methods, establish a relatively complete the movement of the insomnia rats model for the study of the mechanism and cure exercise-induced insomnia lay the foundation of the important. 2 method: this experiment selection female wistar rats health only 85, will rats randomly divided into seven groups: normal group, 3% movement pcpa group, 5% load injection sports load pcpa injection group, 7% load group, 7% movement sports load pcpa injection group, y maze training group, y maze training injection pcpa groups, and only 10. besides the normal group will not do anything besides, 3% movement pcpa group, 5% load injection sports load pcpa injection group, 7% pcpa groups to exercise load injection 5 weeks 3%, 5% and 7% weight loading swimming training + intraperitoneal injection of pcpa; 7% of sports load 5 weeks 7% weight loading swimming training; y maze pcpa groups to training injection 5 weeks y maze training + intraperitoneal injection of pcpa; y maze training group to 5 weeks y maze training. the rat pick eye take blood, add heparin for the administration. through the high performance liquid chromatography (hplc) method of plasma fluorescence determination of monoamine transmitters in content. all the data spss17.0 statistics software statistics processing. 3 result: 3.1 the change of the body surface characteristics of rats y fan group, 7% in the days and nights v of the phenomenon, but to the outside world, lip color induction ability, shape, fur and grabbed a strong resistance level performance and 7% + pcpa rats, great difference in the body surface characteristics; 5% + pcpa rats, although frequent activity, a series of surface characteristics are 7% and + pcpa rats have obvious difference; y + pcpa group and 3% + pcpa rats, activity rules performance is not obvious, and a series of surface characteristics are 7% and + pcpa rats, surface characteristics are quite different. 3.2 each rat weight change (1) the rats within the group week 3 and 4 weeks compared weight, 7% group difference is very significant (p 0.01) weight fell sharply, 5% + pcpa group significant difference (p 0.05), weight to drop; the rats in the group 4 weeks and 5 weeks compared weight, 7% + pcpa group significant difference (p 0.05), weight to drop. (2) the fifth week each rat weight and 7% + pcpa group, compared to the normal group difference is very significant (p 0.01), normal group and a growing trend, other each significant difference (p 0.05), to drop. 3.3 each rat food intake of change the rat week 3 and 4 weeks food intake change compared: 7% + pcpa rats change very significant (p 0.01), is a sharp decline, 5% + pcpa rats, change significantly (p 0.05), the decline of other group no change; the rat 4 weeks and fifth week food intake change compared: 7% + pcpa, y fan rats, change significantly (p 0.05), the decline of 5% + pcpa, y + pcpa rats, change very significant (p 0.01), is a sharp decline. 5 weeks each rat food intake and 7% + pcpa compared: normal rats, change very significant (p 0.01), is a sharp decline of 5%, 7%, 3% + + pcpa group, pcpa group and y + pcpa rats, change significantly (p 0.05), to drop. 3.4 each rat plasma ne, da content changes (1) rats plasma ne content, compared with the normal group, 7% + pcpa group, the 7% rise very significant group, (p 0.001), 3% + pcpa group (p 0.05); and 7% + pcpa group, compared to 7%, 5% + pcpa group group, 3% + pcpa group, y fan group and y + pcpa group significantly lower than 7% + content pcpa group (p 0.001); significantly lower than 3% + 7% group pcpa group (p 0.05) and very significantly lower than 5% + pcpa group, y fan group (p 0.01); 5% + pcpa group very significantly higher than y + pcpa group (p 0.01); y fan group significantly higher than y + pcpa group (p 0.05). (2) rats plasma da content, compared with the normal group, 7% + pcpa group significant higher than normal group (p 0.001), 7% very significantly higher than normal group group (p 0.01); and 7% + pcpa group, compared to 5% + pcpa group, 3% + pcpa group, y fan group, y + pcpa group very significantly lower than 7% + pcpa group (p 0.01), 7% were lower than 7% + pcpa group group (p 0.05); compared with 7% group, 5% + pcpa group, y fan group, y + pcpa significantly less than 7% of group (p 0.001), 3% + pcpa group significantly lower than 7% group (p 0.05). 4 conclusion: this experiment with large load swimming training (sports time: 90 minutes, exercise load: 7% of their body weight) + pcpa intraperitoneal injection of rats caused insomnia models, from external surface characteristics, rats weight, food intake and plasma monoamine neural transmitter ne and da changes of the contents of the feature, accord with chinese medicine virtual fatigue symptoms of insomnia, that the use of this method to establish insomnia rat model feasibility strong, can be widely used in sports and clinical aspects of insomnia insomnia basic research. key word: athletic insomnia; plasma; weight; food intake; monoamine neural transmitter. 目录 1.前言 .1 1.2 文献综述 . 1 2.实验研究 .6 2.1 实验对象与方法 . 6 2.2.1 实验对象 . 6 2.2.2 实验分组 . 6 2.3 实验试剂药品和仪器设备 . 7 2.3.1 实验试剂药品 . 7 2.3.2 实验仪器设备 . 8 2.3.3 色谱条件 . 8 2.3.4 标准溶液配制 . 8 2.3.5 实验指标测定 . 8 2.3.6 取材方法 . 8 2.3.7 血浆样本处理 . 8 2.3.8 标准曲线的制备 . 8 2.3.9 神经递质含量的测定 . 9 2.4 实验数据的统计处理方法 . 10 3 实验结果 . 10 3.1 大鼠体表特征的变化（表 3） . 10 3.2 各组大鼠体重的变化（表 4） . 11 3.3 各组大鼠摄食量的变化（表 5） . 11 3.4 各组大鼠血浆 ne、da 含量的变化（表 6） . 12 4.分析与讨论 . 13 4.1 不同干预对各组大鼠体表特征的影响 . 13 4.2 不同干预对各大鼠体重、摄食量的影响(图 4、图 5) . 14 4.3 不同干预对大鼠血浆 ne 含量的影响 . 15 4.4 不同干预对大鼠血浆 da 含量的影响 . 16 5.结论 . 18 6.参考文献 . 19 缩略词表 . 24 在校期间的研究成果及发表的学术论文 . 25 致谢 . 26 1 运动性失眠大鼠建模初探运动性失眠大鼠建模初探 1.前言前言 1.1 选题依据选题依据 睡眠是人类基本的生理需求,良好的睡眠可以促进机体迅速恢复体力和脑力,维持正 常的生命节律。大强度的运动负荷对运动员来讲,是一种不良的刺激,运动员在训练和比赛 过程中经常会出现失眠现象,称为运动性失眠。它是由运动训练或体育竞赛等相关因素所 导致的失眠,引起运动员睡眠的时间缩短。它是导致运动性疲劳的主要原因,从而严重影响 运动员的训练质量和运动成绩,还可能导致严重的运动损伤,并对运动员的身心健康造成 很大影响 1。 运动性失眠是失眠的一种特殊的类型。对运动员来说是一种不良的刺激，特别运动 员在激烈紧张的比赛和大强度运动训练后，而运动性失眠的治疗又是运动员疲劳恢复中的 瓶颈问题。失眠会局限运动员竞技水平的发挥和运动能力的发展，甚至出现运动损伤，从 而对运动员的身心健康带来不利影响。引起运动性失眠的原因主要包括：心理性因素和生 理性因素。有关研究证实运动性失眠的主要原因是情绪紧张、焦虑、剧烈的思想活动等心 理性因素所致。然而运动员剧烈运动后，血压、脉搏、呼吸等一些生理指标的变化，同时 在一定程度上对心理因素产生影响，共同导致运动性失眠 7。 目前有很多研究证明，运动性失眠的发生跟运动项目、性别、强度、等级以及年龄没 有直接关系，从事运动训练就有可能导致运动性失眠的产生。石幼琪等人的研究表明,运 动性失眠的发生率为 60.5%，高于普通人群，且优秀运动员失眠持续的时间和频率很大程 度上高于普通运动员，且就占比例来说，属于暂时性的心理生理失眠为 95%，属于持久性 心理生理失眠为 5% 8。就目前日趋激烈竞技比赛的来说，一方面对运动性疲劳的预防与恢 复的瓶颈问题成为人们研究的焦点；另一方面也为运动员、教练员及运动医学工作者对运 动性失眠的预防与治疗提供了参考。 目前为止，对动物失眠模型的研究比较多，常见的有：限制活动、水上平台法、电刺 激法、强迫运动睡眠剥夺法和 pcpa 法等。但对于动物运动性失眠模型建立的研究较少， 还没有建立一个完整的运动性失眠的动物模型，从而研究导致运动性失眠发生的生理生化 机制、运动性失眠的各因素之间的相互联系和各个生化指标之间的相互影响。 综上所述，我们在以往研究运动性失眠大鼠的基础上，通过对不同方法建模进行比较， 建立一个相对完整的运动性失眠大鼠的模型，这对以后运动性失眠建模将具有十分重要的 意义。 1.2 文献综述文献综述 1.2.11.2.1 运动疲劳与恢复的研究现状运动疲劳与恢复的研究现状 2 如何能尽快消除的运动疲劳，使竞技能力有所提高，是现在运动医学和运动训练学领 域中最为重要的，也是一直在探索改进的问题。就运动疲劳的研究来说，因认识和研究的 方法不同，研究结果往往具有多种结论且各具特点 33。 1.2.1.1 运动疲劳产生的原因 运动疲劳是指机体运动至一定时候,工作能力下降,经过休息后又能恢复的状态。 究其 原因主要有生理生化和心理两方面原因。一方面来说，生理生化原因可以概括为:能源的 消耗,肝糖原等过量消耗,血糖下降；疲劳物质在体内积累,乳酸和蛋白质分解物大量存留 在体内；体内环境的变化,包括体液的酸碱平衡、离子分布、渗透压平衡等的变化或破坏； 不能完全适应各种应激反应。另一方面，锻炼动机的丧失、体育锻炼与比赛的复杂性和紧 张性、锻炼内容的单调性和恢复措施的局限性等是导致体育锻炼中心理疲劳的主要因素 34-38。 另外，外周疲劳和中枢疲劳两大机制是公认的运动疲劳产生的主要机制。近年来冯炜 权的研究发现应该对神经、免疫和内分泌细胞及各运动器官细胞的表面存在的细胞因子、 激素、神经递质和神经肽类的受体进行深入研究 39。 1.2.1.2 运动疲劳恢复的手段 针对现在运动疲劳出现的形式，我们主要从生理、心理、辅助治疗和营养进行运动后 疲劳的恢复。 在生理方面，首先采取合适的休息方式非常重要，充足的睡眠是对机体最好的放松方 式之一。进入睡眠时,意识消失、机体感觉减退、全身肌肉处于放松状态。有不少专家和 学者研究证明，睡眠不仅是消除疲劳的良好药方，更是机体一个重要的恢复过程。由此可 见,运动员的睡眠问题不容忽视。特别是青少年每天必须保证 10 小时的睡眠，成年运动员 每天最少保证 8-9 小时的睡眠。在大运动量训练或比赛期间,睡眠时间应适当延长；在训 练或比赛之间还可采取小强度或其它活动练习来进行间歇的恢复，能在一定程度上抑制运 动中枢的兴奋,从而加速肌肉清除代谢物质，提高氧气及营养物质的供应率,提高能源物质 的再合成的速率,快速消除疲劳 47。 在心理方面，心理学恢复方法：放松训练、呼吸调整、催眠暗示、心理调节等。目前 为止，常用的两种方法有：催眠暗示和催眠休息。这两种方法的优势在于：能在相对短的 时间内消除疲劳或过度紧张,从而使机体得到充分的恢复。很多研究表明，运动后采用催 眠暗示或休息的恢复过程快于一般休息方法,且运动能力指标的高于一般休息的 2-3 倍 48。 在辅助治疗方面，按摩可以加速疲劳消除。按摩不仅能促进大脑皮层兴奋与抑制的转 换,使因疲劳导致的神经调节紊乱消失,且还可加速血液、淋巴的循环速率。从而加强血液 局部供应,有利于代谢产物的排出,达到加速疲劳消失的效果。现在常用的按摩方法有两大 类:机械按摩和人工按摩。机械按摩又可以分为：震动按摩、气压按摩和水按摩。根据运 动项目所涉及到的肌肉群的不同的疲劳程度的情况而进行不同的按摩方式,我们一般以按 摩运动负荷最大的部位为准。另外，训练和比赛之后,进行沐浴时可采用蒸气浴、盐水浴 3 等来加速人体血液循环,使毛细血管开放数目增多,加快代谢废物的清除,还能更好地改善 神经肌肉的营养状况，达到加速疲劳消除的目的。且沐浴应在训练结束后 30 分钟进行,否 则将不利于代谢产物的清除。 适量运用药物疗法也被现在所提倡， 在排除兴奋剂的前提下, 尽可能使用维生素或天然提取的专用药物。目前来说，用的药物有:维生素 b1、维生素 b2、 维生素 b12、维生素 c、维生素 e 等 49-51。 在营养方面，体内营养素的大量消耗,是造成运动性疲劳的重要原因之一。机体恢复 最根本的方法是科学地补充由于运动消耗的物质,且进行合理的营养搭配,使机体在短时 间内补充所消耗的营养素及能量。在提高身体的抗疲劳能力的同时,又加快消除了运动后 的疲劳 50。 1.2.21.2.2 运动性失眠的发病原因运动性失眠的发病原因 就运动员的发病原因来说，主要从心理因素、生理因素和中医学观点这三方面研究进 展来看： 1.2.2.1 生理方面的因素 当运动员有强烈情绪反应时,某些生理机能要发生改变,如呼吸、脉搏、血压、皮肤电 阻等,同时这些因素的改变,一定程度上说明了心理负担的加重 72。还有人提出:额叶皮层 在协调来自边缘系统信号和“认知脑”即大部分新皮层的活动中可能起一定作用 73。在动 物实验中发现:大鼠中脑腹侧被盖区(vta)的多巴胺(da)神经元在睡眠觉醒调节中起重 要作用,对维持皮层白天兴奋性具有紧张性作用。在脑电图和肌电图三个时相的改变为:慢 波睡眠脑电图高幅慢波或梭形,肌电图明显减少或消失;异相睡眠脑电图呈现有规律的波 幅较一致的快波,肌电图完全消失或抽动;觉醒脑电图为低幅快波,肌电图有明显肌电 74。 还发现,黄连解毒汤有使小鼠睡眠延长的作用,是苯并二氮样的作用 75。另有报导电刺激家 兔印堂、太阳穴时,对其总睡眠期、慢波期能明显增加睡眠时间, t 检验 p0.01 76。 1.2.2.2 心理方面的因素 面对高度紧张、激烈的竞赛，及运动员的对竞技水平的更高追求，导致运动员精神压 力过大，从而失眠。情绪紧张、焦虑、剧烈的思想活动等导致运动性失眠 79.80，运动员的 上述心理性因素绝大部分都与训练和比赛有关,尽管身体躺在床上,但各种念头纷至沓来, 形成巨大的精神负担，从而影响训练和比赛的正常进行和发挥,比赛反过来加重心理负担, 形成恶性循环 81-83， 运动员心理障碍绝大部分受焦虑和身心的影响,是由于长期不正确的思 维方式造成的焦虑状态,情绪恶化,导致躯体生理功能障碍产生失眠 84-85。 1.2.2.3 中医学观点 中医学认为人是一个整体,自然界是一个整体,人与自然界也是一个整体,说明人与自 然和社会的密切关系 20。而五态七情是人体心理活动的表现，强调人体神(心理活动)形和 (生理活动)密不可分的相互关系 77。 4 由此可以看出，运动性失眠的发生与运动员的特殊情况分不开的，运动员日常训练量 大，精神压力大，加上一些不好的习惯都会导致失眠，影响训练和比赛成绩，甚至是运动 员的身心健康。 1.2.31.2.3 运动性失眠的诊断运动性失眠的诊断 有相关报道睡眠障碍与焦虑、抑郁等呈正相关；与精力旺盛、心理健康呈负相关 86。 我们认为艾森克个性问卷(epq),明尼苏达多相人格量表(mmpi) 89.90,症状自评量表 (scl-90) 87.88,心理健康测查(mmh)91和睡眠质量分析的七项因素等,都可从不同程度反映 失眠者的状态和个性的轨迹 92.93。可以针对不同项目、不同强度的运动，以及不同等级的 运动员采用测量,为心理学因素的检测提供依据。除了以上量化外,还可用“舒尔特表”测 定运动员的注意力。用焦虑量表(stai) 94、用力感辨别能力、时间估计准确性等测评运动 员的心理负荷量。 在生理因素方面，当人有强烈情绪反应时,脉搏加速、呼吸加深加快、皮肤电反应相 当紧张程度提高；皮肤电阻下降，动脉血压在紧张时升高。有报导:焦虑者测得 nk 细胞活 性明显降低 95，心理刺激可以通过影响交感神经系统和下丘脑垂体肾上腺轴(hpa 轴) 的活动来强化或抑制免疫系统,而免疫系统分泌 ili（流感样病例） 、il6（白细胞介素 6） 可影响 hpa 轴和交感神经 96。还有报导:失眠者睡眠脑电图改变、结构混乱、睡眠质量降 低 98。可在运动员睡眠时利用仪器连续记录多种生理机能,其中包括:脑电图、肌电图、眼 球运动、呼吸、心电图 99。以上所述测定指标,应根据不同训练强度,不同项目适当选用。 中医辨证论治来看，辨脏腑:不寐的主要病位在心。心神被扰或心神失养,神不守舍而 成不寐。其他脏腑如:肝、胆、脾、胃、肾的阴阳气血失调,也可扰动心神致不寐 100。辨虚 实:不寐的虚证属阴血不足,心失所养。实证为火盛扰心,表现为心烦易怒,口苦咽干,便泌 溲赤,多因心火亢盛、 肝郁化火所致。 一般认为运动性失眠主要为虚实夹杂症,宜疏肝解郁, 降火化痰,消导和中基础上益气养血、安神定志。再从肝论治从痰论治失眠症,平肝解郁, 活血安神治失眠,均取得较好的效果 101。 1.2.41.2.4 运动性失眠模型的研究现状运动性失眠模型的研究现状 运动性失眠是失眠的一种特殊的表现形式，是一种常发生在运动员身上的运动综合 症，多由于运动训练引起。目前对动物失眠模型的研究比较多，常见的有：限制活动、水 上平台法、电刺激法、强迫运动睡眠剥夺法和 pcpa 法等。通过查阅近些年的文献资料发 现，研究运动性失眠动物模型的实验并不多，其中有代表意义的有：王永涛等人通过长期 超负荷游泳建立阴虚内热动物模型，其方法是让实验大鼠游泳 6 周，1 周 5 天，1 天 1 次， 时间有 10min 逐渐增加至 120min，模型组实验大鼠体重明显下降，皮毛干枯无光泽，日游 泳训练结束后，惊恐不安，在笼内乱跳乱窜，表现为高度的惊恐兴奋，是建立失眠模型的 基础研究 9。给实验动物注射 pcpa 制造失眠模型是目前研究失眠的公认的方法，张林挺在 研究酸枣仁汤对虚劳失眠大鼠干预机理的实验中，采用了跑台力竭训练+y 型迷宫+pcpa 失 眠的动物模型，从运动所致身体疲劳和学习记忆所致中枢疲劳两个方面因素来共同建立失 5 眠模型 10。 运动性失眠是运动性疲劳常见的复杂证候之一，中医辨证认为其主要属于劳倦伤气， 并建立了阴虚内热证动物模型 22。汪泳涛等通过 6 周超负荷游泳训练建立动物模型，建模 后大鼠体重下降，肛温升高，海马区兴奋性氨基酸增多，抑制性氨基酸减少。这种动物运 动性失眠模型的建立方法， 在病因上接近于临床实践， 无人为直接干预动物机体生理过程， 有一定的研究意义 23。但是这种建模方法在一定程度上具有不确定性，因此建模成功率比 较低。 李裕和、张林挺等在研究针刺治疗对运动性失眠大鼠大脑 5-ht、ngf 水平、c-fos 和 c-jun 以及一氧化氮和谷氨酸含量等指标的影响时，采用 y 型迷宫测试和大鼠跑台训练使 其产生中枢疲劳和体力疲劳之后，再进行 pcpa 腹腔注射建立模型 25-27。这种采用复合刺激 建立运动失眠模型的方法新颖独特，加入了较大强度的运动训练，巧妙地结合中西、医理 论上的建模方法，基本符合运动性失眠的标准，有一定的研究价值。 长期超负荷的游泳训练属于中医疲劳模型中“过劳伤气”模型，通过超负荷的训练方 案使大鼠过度劳累。pcpa 失眠鼠模型是目前公认的，并广泛用于 5-ht 及其与其他递质之 间关系研究的经典动物模型 27，较多用于欧美国家对失眠动物的研究。pcpa 腹腔注射的方 法，造模时间短，相对成功率比较高，常用来制作失眠模型。本研究综合文献及失眠造模 成功的经验 56-59，在此基础上发现运动性失眠是由多方面的因素所造成的，通过对运动性 失眠模型的分析，发现各失眠模型均有长处和不足，由此得出可以改变由单因素制约的模 型建立，达到由多种因素复合制约的模型建立。 1.2.51.2.5 与睡眠觉醒相关的血浆单胺类神经递质的研究现状与睡眠觉醒相关的血浆单胺类神经递质的研究现状 单胺类神经递质分为兴奋性神经递质和抑制性神经递质两种， 兴奋性神经递质维持觉 醒，抑制性神经递质促进睡眠。现在对单胺类神经递质与睡眠觉醒机制的研究主要集中在 中枢神经系统，而对血浆单胺类神经递质的研究较少。有研究显示，在猫的血液交叉循环 实验中，电刺激它的睡眠中枢后使其睡眠，能够诱发另一只没有进行电刺激的猫出现睡眠 41。而在中枢神经系统内，5-ht 主要分布在中缝核，参与慢波睡眠的维持，属于抑制性神 经递质；5-hiaa 是 5-ht 的代谢产物，与其有同样的变化趋势；ne 和 da 是目前公认的参 与觉醒的神经递质，ne 主要参与脑电觉醒，da 主要参与行为觉醒。血液中单胺类神经递 质的改变在一定程度上能够反映中枢单胺类神经递质的改变 40。钟静瑜研究发现睡眠剥夺 影响体内神经递质的含量，使血浆中 ne、5-ht 水平明显升高，da 水平下降 43。李方杰研 究发现，腹腔注射 pcpa 所致失眠大鼠血中 5-ht 和 5-hiaa 含量明显上升，经针刺治疗后 大鼠血中 5-ht 和 5-hiaa 含量明显降低 42。由此推测，血液中也可能产生了与睡眠觉醒 周期有关的物质，血液中这些物质的含量变化都有可能引起睡眠-觉醒周期的改变。付乙 观察中医药对运动员失眠血中 ne 和 5-ht 含量的变化，结果显示，各组运动员血中 ne 降 低，5-ht 升高，il-2、nk 的活性有不同程度的增加，伴随失眠的症状消失 40。睡眠-觉醒 6 周期是个复杂的生理过程，其机制尚未阐述明确，血浆单胺类神经递质与睡眠-觉醒的关 系需要进一步研究和验证。 2.实验研究实验研究 通过在现有的限制活动、水上平台法、电刺激法、强迫运动睡眠剥夺法、y 迷宫和 pcpa 法的基础上进行比较分析，做相应的预实验研究，从而得出实验的 7 个分组，对这 7 组大 鼠进行相应的生理生化分析，最终建立相对完整的运动性失眠大鼠模型。 2.1 实验对象实验对象与与方法方法 神经递质的检测和检测方法国内外的报道有很多，主要有高效液相色谱电化学检测 法（hplc-ecd） 11,高效液相色谱荧光检测法（hplc-fld）12,柱前衍生液相色谱法13,荧 光分光光度计法 14,酶联免疫吸附法(elisa)15,气相色谱法(gc)16,气相色谱一质谱串联 法(gc-ms) 17,毛细管电泳法18,液相色谱-质谱串联(lc-ms)19等。 本实验所测单胺类神经递质都具有天然荧光的特性，无需进行衍生化 20，因此采用高 效液相色谱荧光检测法（hplc-fld）来测定。hplc-fld 法是近几年迅速发展起来的一种分 离分析法，操作简单快速，分离效率高，灵敏度高，检测限低，选择性好 20。测定时流速 为 1.0 ml/min，流速太低时，色谱峰出峰时间太长，流速太高时，又会影响各色谱峰的分 离。检测参数选择发射波长为 330 nm，激发波长为 280 nm ，这样单胺类神经递质的检测 灵敏度最高 12。 2.2.1 实验对象实验对象 本实验选取健康雌性 wistar 大鼠(由鲁抗集团动物饲养中心提供)85 只，8 周龄，体 重 230 g 左右。分笼饲养，每笼 5 只，标准啮齿类饲料喂养，自由饮水、活动。动物房内 保持安静，干燥，通风，室温 23-28，湿度 40%-65%。动物适应性喂养 1 周，记录体重。 2.2.2 实验分组实验分组 将大鼠随机分为 7 组：正常组、3%运动负荷（即负体重 3%的重量游泳，以下相同）注 射 pcpa 组(简称 3%+pcpa 组） 、5%运动负荷注射 pcpa 组(简称 5%+pcpa 组)、7%运动负荷组 (简称 7%组)、7%运动负荷注射 pcpa 组(简称 7%+pcpa)、y 型迷宫组(简称 y 迷宫组)，y 型 迷宫注射 pcpa 组(简称 y+pcpa 组） ，每组 10 只。 2.2.32.2.3 实验方法实验方法 对氯苯丙氨酸(pcpa)，由阿法埃莎（天津）化学有限公司生产，用量 300mg/kg，配成 10%的浓度(即 100mg/ml，大鼠用量 3ml/kg) 51。由于对氯苯丙氨酸在溶液中溶解度较低， 在弱碱性环境中溶解度增高。配成混悬液后，并滴注 5%的 naoh10ml，pcpa 的溶解度增加， 液体呈半透明状，4保存备用。大鼠适应性喂养期间，每天进行 20min 适应性游泳，共 6 天，休息一天开始正式实验。实验开始第 1 周，除正常组外，3%+pcpa 组、5%+pcpa 组、 7%+pcpa 和 7%组大鼠进行以下实验步骤。 7 2.2.3.1 大鼠游泳训练 训练环境为高 100cm、直径 70cm 的塑料圆桶，水深 60cm，水温 32-35。每天下午 1:30 开始训练，训练时大鼠尾部负重，重量为其本身体重的 3%、5%、7%，1 次/1 天，5 只 /桶，每周训练 5 天，休息 2 天，连续 5 周，游泳训练方法如表 1。 表 1 大鼠游泳训练安排 周数周数 训练日数训练日数/w/w 训练频率（次训练频率（次/d/d） 训练时间训练时间 (min/d)(min/d) 尾部负重尾部负重 1 5 1 30 3%、5%、7% 2 5 1 45 3%、5%、7% 3 5 1 60 3%、5%、7% 4 5 1 75 3%、5%、7% 5 5 1 90 3%、5%、7% 2.2.3.2y 型迷宫