克隆基因表达及基因干扰修.ppt

克隆基因的表达及基因干扰,北京协和医院检验科吴洁,1,克隆基因的表达及基因干扰,第一节外源基因的表达,第二节表达产物的分离、纯化与鉴定,第三节基因表达干扰技术,2,克隆基因的表达及基因干扰,第一节外源基因的表达,第二节表达产物的分离、纯化与鉴定,第三节基因表达干扰技术,3,第一节外源基因的表达,遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（centraldogma）。,基因表达,4,外源基因在宿主细胞中表达。,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,第一节外源基因的表达,克隆基因表达,5,第一节外源基因的表达,一、原核生物表达体系二、真核生物表达体系酵母，哺乳动物细胞,大肠杆菌,6,一、原核生物表达体系,（二）原核表达载体具有的特点,（四）包涵体,（一）对外源目的基因的要求,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,7,（一）对外源目的基因的要求1、不应具有5端非编码区以及内含子结构2、不能直接用真核基因组DNA.3、常以cDNA为模板，设计引物，PCR扩增目的基因.,一、原核生物表达体系,8,选择标志启动子：乳糖启动子lac，色氨酸启动子trp等翻译调控序列，如核糖体结合位点(SD序列)，及翻译起始点和终止序列多克隆位点(MCS),（二）原核表达载体具有的特点,一、原核生物表达体系,9,原核启动子,大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致序列：-35box和-10box（Pribnowbox）,TTGACA,10,consensussequences,11,核糖体结合位点（ribosomebindingsite,RBS）,Shine-Dalgarno（SD）sequence：,mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。,SD,mRNA5AGGAGGUAUG,16SrRNA3,UCCUCCA,S-D序列距离AUG的距离也影响翻译,12,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,1.非融合型表达蛋白,2.融合型表达蛋白,3.分泌型表达蛋白,一、原核生物表达体系,13,1.非融合型表达蛋白载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原等方面基本一致缺点：易被细菌蛋白酶破坏,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,一、原核生物表达体系,SD序列,ATG-外源基因-TAG,14,常用的非融合型表达蛋白原核表达载体pKK223-3抗氨苄青霉素基因tac启动子(trp-lac)SD序列AUG起始密码转录终止序列T1和T2,一、原核生物表达体系,15,2.融合型表达蛋白表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。优点：具有抗原性可作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏。便于融合蛋白的分离和纯化。,一、原核生物表达体系,16,融合型表达系统主要有GST系统His系统金黄色葡萄球菌蛋白A系统-半乳糖苷酶系统麦芽糖结合蛋白系统,一、原核生物表达体系,17,启动子：tac操纵基因：lacP调节基因：lacIS-D序列ori：pBR322ori融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,GST系统-pGEX系列,1、载体组成结构:,lacI,tac,lacO,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,18,GST融合蛋白用GlutathioneSepharose亲和层析柱分离纯化。,GST系统-pGEX系列,2、产物提纯:,3、产物分离:,用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。,19,His-tag（组氨酸标签）：,在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（6His）,His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被咪唑（或EDTA溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,His系统,20,21,3.分泌型表达蛋白载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞外。,一、原核生物表达体系,pINIII系列载体,pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,Ipp,lacP,lacO,S-D/ATG,ompa,插入位点,22,（四）包涵体(inclusionbody),一、原核生物表达体系,大肠杆菌高效表达外源基因时形成的膜包裹的高密度、不溶性和无活性的蛋白质颗粒。,23,（四）包涵体(inclusionbody),1.包涵体的形成2.包涵体的分离与纯化3.包涵体的复性,一、原核生物表达体系,24,1.包涵体的形成,表达产率过高，超出细菌蛋白水解能力，产物积聚，与目的蛋白中含硫氨基酸含量呈正相关。原核表达体系缺乏翻译后修饰酶类和辅助因子，中间产物易大量积聚。发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点,25,有利于目标蛋白的富集，使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞,以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性、复性操作才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。,缺点,优点,26,2.包涵体的分离与纯化,超声破碎菌体,离心,包涵体,溶解包涵体,强蛋白质变性剂：盐酸胍、尿素（5-8mmol/L）,3.包涵体的复性,逐步降低变性剂浓度，使表达蛋白恢复其天然构型,27,（一）酵母表达体系,（二）哺乳动物细胞表达体系,二、真核生物表达体系,真核或病毒启动子,MCS,PolyA信号,终止子,外源基因,28,（一）酵母表达体系,1.酵母表达载体,2.酵母表达外源性基因的形式,二、真核生物表达体系,DividingSaccharomycescerevisiae(bakersyeast)cells,29,1、酵母表达载体选择性标志大肠杆菌：Ampr、Tetr酵母：Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;复制子启动子上游活性序列转录起始点上游，可促进转录终止序列蛋白结构域如：信号肽序列、核定位序列,二、真核生物表达体系,（一）酵母表达体系,30,2.酵母表达外源性基因的形式非分泌型分泌型,二、真核生物表达体系,分泌信号序列,31,Leu-酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2、PEG,整合到染色体上或独立在酵母细胞内,转化,Leu营养缺陷型培养基筛选,转化子克隆生长,酵母载体,大肠杆菌,提取,插入外源基因,鉴定克隆,发酵表达,外源基因产物,分离、纯化,酵母转化和表达的一般过程,32,（二）哺乳动物细胞表达体系,1.哺乳动物细胞表达载体,2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式,3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统,二、真核生物表达体系,33,（二）哺乳动物细胞表达体系,1.哺乳动物细胞表达载体(1)原核DNA序列(2)启动子(3)增强子(4)剪接信号(5)遗传标记(6)终止信号和多聚腺苷化的信号,二、真核生物表达体系,34,2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式,二、真核生物表达体系,35,3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统（1）COS细胞瞬时表达系统（2）CHO细胞稳定表达系统,二、真核生物表达体系,36,用复制起点有缺陷的SV40病毒侵染的猴细胞株CV-1得到的。所以称COS（CV-1，Origin,SV40）,COS细胞,37,利用COS细胞表达外源基因,38,克隆基因的表达及基因干扰,第一节外源基因的表达,第二节表达产物的分离、纯化与鉴定,第三节基因表达干扰技术,39,第二节表达产物的分离、纯化与鉴定,二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化,三、表达产物的鉴定,一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化,40,一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化,1.粗制品的分离纯化,2.精制品的分离纯化,离心收集菌体,超声波破碎,离心收集上清,热处理变性,离心,上清用硫酸铵沉淀,凝胶层析、离子交换层析,41,二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化,1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化以-蛋白酶抑制剂的纯化为例：,2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化以酵母表达干扰素纯化为例：,收集酵母细胞,玻璃珠破碎,离心取上清,DEAESepharose柱层析,梯度洗脱,收集活性部分,浓缩,葡聚糖凝胶G75柱层析,收集、浓缩,SDS-PAGE纯度鉴定,发酵液用0.45m孔径滤膜过滤浓缩,DEAE-Trisacryl柱层析,梯度洗脱,收集干扰素部分,葡聚糖凝胶G75柱层析,洗脱,收集干扰素,稀释,层析聚焦缓冲液洗脱,电泳鉴定,42,三、表达产物的鉴定,Western印迹（Westernblotting）1.蛋白质样品的制备2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)3.蛋白质的电转移(胶膜),43,三、表达产物的鉴定,44,三、表达产物的鉴定,4.靶蛋白的免疫学检测封闭脱脂奶粉或BSA靶蛋白与第一抗体反应与第二抗体反应HRP标记显色,45,三、表达产物的鉴定,46,第七章克隆基因的表达及基因干扰,第一节外源基因的表达,第二节表达产物的分离、纯化与鉴定,第三节基因表达干扰技术,47,第三节基因表达干扰技术,二、核酶与脱氧核酶,三、小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA),四、微RNA(microRNA),一、反义核酸技术,48,一、反义核酸技术,（二）反义RNA技术,（三）反义核酸技术的应用,（一）反义寡核苷酸技术（反义DNA技术）,49,（一）反义寡核苷酸技术,1.反义寡核苷酸的作用机制,2.反义寡核苷酸的设计与合成,3.反义寡核苷酸的修饰,4.反义寡核苷酸的给药途径,一、反义核酸技术,50,（一）反义寡核苷酸技术1.反义寡核苷酸的作用机制(1)抑制mRNA的翻译(2)抑制复制或转录(3)抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达,一、反义核酸技术,51,2、反义寡核苷酸的设计与合成1）设计计算机软件预测RNA的二级结构利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计,一、反义核酸技术,52,2）合成长度一般为1525个核苷酸G-C含量为60%65%,一、反义核酸技术,53,3.反义寡核苷酸的修饰最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰（1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子（2）甲基修饰磷酸骨架（3）聚酰胺键代替磷酸骨架,一、反义核酸技术,54,4.反义寡核苷酸的给药途径（1）直接作用于培养细胞（2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞（3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径,一、反义核酸技术,55,（二）反义RNA技术,1.反义RNA的作用机制,2.反义RNA的设计,一、反义核酸技术,56,（二）反义RNA技术,1.反义RNA的作用机制(1)与引物RNA前体互补结合，抑制DNA复制(2)阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运(3)抑制mRNA翻译(4)使mRNA更易被核酸酶识别而降解,一、反义核酸技术,57,2.反义RNA的设计与ASON相比，反义RNA的设计较为简单,一、反义核酸技术,58,（三）反义核酸技术的应用,需要完善或解决的问题：防止被核酸酶降解需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合ASON是否会影响正常细胞的基因表达用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题,一、反义核酸技术,59,二、核酶与脱氧核酶,（一）核酶：能够催化RNA剪接的由RNA组成的酶。Cech与Altman分享了1989年诺贝尔化学奖。,（二）脱氧核酶：1994年Breaker发现具有催化功能的DNA分子。,60,（一）核酶,1.核酶的分类,2.核酶的结构,3.核酶的设计与修饰4.核酶转移方法5.核酶的应用,二、核酶与脱氧核酶,61,（一）核酶1.核酶的分类（1）大分子核酶：第类内含子、第类内含子、核糖核酸酶P（2）小分子核酶：锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和neurosporaVarkudsatellite核酶,二、核酶与脱氧核酶,62,2.核酶的结构（1）锤头状核酶：二级结构有三个螺旋环结构区和一个催化中心,二、核酶与脱氧核酶,H：除G以外的任一核苷酸,不可逆的自切割反应,63,（2）发夹形核酶：二级结构分成两个结构域，每个结构域由螺旋-环-螺旋组成,二、核酶与脱氧核酶,可逆的自切割反应,BNGUC,B：除A以外的任一核苷酸N：任意核苷酸,64,二、核酶与脱氧核酶,3.核酶的设计与修饰,设计三要素：高效、特异、稳定两方面：核酶核心与结合臂的设计在底物RNA中选择最佳剪切位点化学修饰主要是对核酶的磷酸二酯骨架的修饰、戊糖环的修饰和碱基的修饰。,65,二、核酶与脱氧核酶,外源性转移物理方法：裸露DNA直接注射、电脉冲介导、显微注射微粒轰击等。化学方法：磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖、脂质体等。内源性转移病毒载体（逆转录病毒或腺病毒载体）,4.核酶转移方法,66,二、核酶与脱氧核酶,5.核酶的应用,已利用组合筛选法得到抑制乙肝病毒复制的发夹核酶、抑制丙肝病毒复制的锤头核酶、能在体外抑制艾滋病毒复制的核酶。,为将核酶作为基因工程药物的开发奠定了基础。,67,（二）脱氧核酶,1.脱氧核酶的结构种类及特征,2.脱氧核酶的催化特性,3.设计合成脱氧核酶的原则,4.脱氧核酶的应用,二、核酶与脱氧核酶,68,（二）脱氧核酶1.脱氧核酶的结构种类及特征（1）10-23型脱氧核酶：,二、核酶与脱氧核酶,嘌呤-嘧啶连接处,69,（2）8-17型脱氧核酶：,二、核酶与脱氧核酶,70,2.脱氧核酶的催化特性（1）RNA切割活性（2）DNA连接酶活性（3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性（4）DNA切割活性（5）N-糖基化酶活性（6）DNA激酶活性（7）DNA戴帽活性,二、核酶与脱氧核酶,71,3.设计合成脱氧核酶的原则（1）总核苷酸数不超过50（2）催化效率不低于核酶（3）具有广泛的RNA切割功能（4）能通过碱基配对与底物结合（5）具有可重复性,二、核酶与脱氧核酶,72,4.脱氧核酶的应用为治疗RNA病毒感染的疾病提供了一条新途径,二、核酶与脱氧核酶,73,三、小干扰RNA(siRNA),（二）RNAi的作用机制,（三）siRNA的设计原则,（四）siRNA的制备方法,（六）RNAi沉默效果的检测,（一）一般研究路线,（七）RNAi的应用,（五）siRNA的导入,74,（一）一般研究路线,三、小干扰RNA,75,（二）RNAi的作用机制1.起始阶段2.效应阶段3.倍增阶段,三、小干扰RNA,76,三、小干扰RNA,77,（三）siRNA的设计原则1.siRNA中G+C碱基含量30%-70%，50%沉默效应较高。2.siRNA作用位点避免起始密码下游50-100碱基处、终止密码上游100bp处及5端非编码区。3.siRNA序列避免连续4个以上A及3个G/C，须经BLAST(hppt://BLAST)比对。,三、小干扰RNA,78,（三）siRNA的设计原则4.siRNA碱基数选择以A或G开始的21-23bp的目的mRNA。5.环碱基数一般为9个碱基，TTCAAGAGA6.对照系统将已设计siRNA碱基序列随机排列，且与其他基因无同源性。,三、小干扰RNA,79,（四）siRNA的制备方法1.化学合成法2.体外转录法3.RNase消化法4.siRNA表达载体法5.siRNA表达框架法,三、小干扰RNA,80,三、小干扰RNA,81,小发夹RNA(SmallhairpinRNA,shRNA),siRNA的合成方式及特点,三、小干扰RNA,（五）siRNA的导入1.脂质体或电穿孔2.病毒携带3.细胞穿透肽,三、小干扰RNA,83,（六）RNAi沉默效果的检测mRNA水平RT-PCR、realtimeRT-PCR、Northernblotting蛋白质水平Westernblotting、ELISA、免疫荧光、流式细胞,三、小干扰RNA,84,KumarPPetalNCB,2019,RT-PCR,85,stable14-foldCD8knockdownbylentivirussiRNAs,RubinsonetalNatureGenetics,2019,Westernblotting,86,（七）RNAi的应用1.基因功能的研究2.基因剔除3.基因治疗4.细胞信号传导途径分析