（基础兽医学专业论文）AVM诱导王鸽脑神经细胞凋亡的线粒体通路研究.pdf

摘要摘要阿维菌素( a v e r m e c t i n ，a v m ) 是农业和畜牧业中大量应用的具有潜在环境毒性的农畜两用杀虫剂，目前已被认为是抗蠕虫药物中环境毒性最为严重的药物之一。以往研究表明a v m 能引起中毒动物运动失调，脑组织出血和水肿以及脑神经细胞凋亡等变化，但尚未见到深入系统的研究，对于神经细胞凋亡途径的研究也较少，a v m 诱导体外培养神经细胞线粒体凋亡途径的研究尚未见报道。鉴于鸽子为环境监测推荐的试验动物，本课题以体外培养王鸽脑神经细胞为研究对象，进行2 5 1 t t g l 1 、5 1 t g l 、1 0 9 9 l 1 三种不同剂量a v m 的染毒处理，通过对王鸽脑神经细胞的存活率、细胞的形态学变化、生化特征变化、l d h 漏出率、n o 产生量；线粒体活性、线粒体膜电位、线粒体氧化应激、细胞内游离钙离子浓度及细胞内c a mm r n a 表达、细胞内c a s p a s e 酶活性以及c a s p a s e 3m r n a 表达等凋亡影响因素的观察，探讨了a v m 对神经细胞毒性作用的剂量效应关系，以阐述a v m 对神经细胞影响的线粒体机制。研究结果表明：1 应用a o e b 双荧光染色、h e 染色、透射电镜以及t u n e l 法，观察培养液中添加三种不同剂量a v m 对神经细胞毒性作用，从形态学角度证实a v m 能够引发神经细胞凋亡，且神经细胞凋亡指数与培养液中添加a v m 的剂量呈正相关。2 应用琼脂糖凝胶电泳、酶标仪、流式细胞术等方法，观察培养液中添加三种不同剂量a v m 对神经细胞的d n a 损伤以及磷脂酰丝氨酸( p s ) 的影响情况，从生化特征角度证实了a v m 能够引发神经细胞凋亡，神经细胞的膜对称性消失，且影响程度与培养液中添加a v m剂量有关。3 通过检测神经细胞的l d h 漏出率和n o 产生量，证实a v m 能引起神经细胞的膜通透性增加，n o 产生量减少。4 采用四唑盐比色法( m 盯法) 观察a v m 对神经细胞的线粒体活性的影响，结果表明培养液中添；0 n - - 种不同剂量a v m 均能使神经细胞线粒体活性降低，且神经细胞线粒体活性变化与培养液中添加a v m 的剂量呈正相关，证实a v m 能损伤神经细胞的线粒体。5 应用流式细胞术观察线粒体膜电位和细胞内活性氧( r o s ) 的产生情况，结果显示培养液中添加三种不同剂量a v m 均能引起神经细胞氧化应激，线粒体膜电位下降，证实a v m通过氧化应激损伤线粒体介导细胞凋亡。6 应用半定量r t - p c r 法和比色法检测c a s p a s e 3m r n a 表达水平和c a s p a s e 3 、8 、9 活性，结果显示a v m 能够引起细胞内c a s p a s e 3m r n a 表达水平上升，c a s p a s e 3 活性增加，c a s p a s e 一9 活性也增加，c a s p a s e 一8 在a v m 浓度为2 5 斗g l 1 时活性增强，其它剂量组变化不明显，证实a v m 可通过线粒体途径激活c a s p a s e 酶系统导致神经细胞凋亡。7 应用半定量r t - p c r 法和荧光探针法检测细胞内c a mm r n a 表达水平和游离钙离子浓度，结果表明a v m 能够引起鸽神经细胞内c a mm r n a 表达水平下降，游离钙离子浓度升高，干扰细胞钙离子的转运，导致细胞钙稳态失衡，证实a v m 能通过影响细胞内钙稳态损伤线粒体介导细胞凋亡。东北农业大学农学硕士学位论文j i i ii,本试验从细胞毒性、细胞凋亡、氧化应激、线粒体膜电位、线粒体活性、钙稳态以及凋亡蛋白酶等角度入手，在细胞形态，生化特征和分子水平上阐明了a v m 毒性作用的线粒体机制，为揭示a v m 孛毒静发病机帝提供新静思路和见解，在充实a v m 生态毒理学资料的同时，也为进一步深入研究a v m 对生物影响提供有价值的线索，并为保护生态环境和合理应震阿维菌素类药物提供科学依据。关键词阿维菌素；王鸽脑神经细胞；细胞凋亡；线粒体凋亡通路i ia b s t r a c tt h er e s e a r c ho nm i t o c h o n d r i o np a t h w a ya n da p o p t o t i c，111m e c n a n l s mo tc u l t u r e d1 9 1 r e o nn e u r o n si n d u c e c id ya v e r m e c t i na b s t r a c ta sap e s t i c i d ew i d e l yu s e di na g r i c u l t u r ea n da n i m a lh m b a n d r y ，a v e r m e c t i n ( a v m ) h a sb e e nc o n s i d e r e do n eo ft h em o s tt o x i ca n t i w o r md m g sf o rt h ee n v i r o n m e n t p r e v i o u ss t u d i e ss h o w e dt h a ta v mc o u l dc a u s ea t a x i a , c e r e b r a lh e m o r r h a g e ，e d e m a , a p o p t o s i so fn e u r o n sa n ds oo n ，b u ts t u d i e so nt h em e c h a n i s mo fa v m i n d u c e da p o p t o s i so fn e u r o n sh a sb e e nl e s ss t u d i e d f o rp i g e o ni sr e c o m m e n d e da n i m a lf o re n v i r o m e n t a lm o n i t o r i n gt e s t s ，w ec h o o s ek i n gp i g e o na se x p e r i m e n t a la n i m a l n e u r o n si nk i n gp i g e o nw e r ei n f e c t e dw i t ha v ma tf i n a lc o n c e n t r a t i o n so f2 5 9 9 l ，5 9 9 l 1a n d10 p , g l 1r e s p e c t i v e l yi nv i t r of o rs t u d ys u b j e c t s a f t e r2 4h sc u l t u r e ，c e l ls u r v i v a lr a t e ，c h a n g e so f c e l lm o r p h o l o g ya n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，l d hl e a l ( a g er a t e ，n op r o d u c t i o n ，m i t o c h o n d r i a la c t i v i t y ，m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ，m i t o c h o n d r i a lo x i d a t i v es t r e s s ，i n t r a c e l l u l a rf r e ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o n , i n t r a c e l l u l a rc a mm r n ae x p r e s s i o n , c a s p a s ea c t i v i t yo fc e l l sa n dc a s p a s e 一3m r n ae x p r e s s i o nl e v e lw e r ed e t e c t e dt os t u d yd o s e r e s p o n s er e l a t i o n s h i po fa v ma n dn e u r o n a lt o x i c i t y ，a n df u r t h e r m o r ee x p l o r et h em i t o c h o n d r i a lm e c h a n i s mo fn e u r o n a lt o x i c i t yo fa v m 1 t h er e s u l t so fa o - e bd u a l - f l u o r e s c e n c es t a i n i n g , h es t a i n i n g ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ya n dt u n e ls h o w e dt h a ta v mc a ni n d u c en e u r o n a la p o p t o s i sf r o mm o r p h o l o g ) ，p e r s p e c t i v e ，a n dt h ea p o p t o s i si n d e xi nt h em e d i u ma n dt h ea v md o s ew a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e d 2 d n ad a m a g es i t u a t i o na n dp h o s p h a t i d y l s e r i n e ( p s ) o fn e r v ec e l l sw e r ed e t e c t e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，m i c r o p l a t er e a d e r , a n df l o wc y t o m e t r y t h er e s u l t sc o n f i r m e dt h a ta v mc a ni n d u c ea p o p t o s i so fn e u r o n sa n dc a u s em e m b r a n es y m m e t r yd i s a p p e a rf r o mb i o c h e m i s t r yp e r s p e c t i v e ，a n dt h i sp h e n o m e n o nw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ha v md o s e 3 b yd e t e c t i n gt h el e a k a g er a t eo fl d ha n dt h ep r o d u c t i o no fn oi nn e u r o n s ，w ef o u n dt h a ta v mc o u l di n d u c ei n c r e a s em e m b r a n ep e r m e a b i l i t yo fn e r v ec e l la n dr e d u c ep r o d u c t i o no fn o 4 m i t o c h o n d r i a la c t i v i t yw a sa s s e s s e db ym t tm e t h o d ，t h er e s u l t si n d i c a t e da v mc o u l ds i g n i f i c a n t l yd e c r e a s em i t o c h o n d r i a la c t i v i t yi nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r , r e s u l t i n gi nm i t o c h o n d r i a li n j u r y 5 m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a la n dc e l lr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) w e r eo b s e r v e db yf l o wc y t o m e t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta v mc o u l di n d u c ee x c e s s i v er o si nn e u r o n s ，r e d u c ei i i东北农业大学农学硕十学位论文j p j ,ii 烹i ! ! ! ! ! 皇鼍攀篡皇暑詈詈詈詈墨燃曼! ! 曼! ! 兰蟛麓皇皇詈皇置量墨燃型曼m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l t h o s ec o m f i r e dt h a ta v mc o u l di n d u c en e u r o n a la p o p t o s i sb ym i t o c h o n d r i a lo x i d a t i v es t r e s s 6 t h ec a s p a s e - 3m r n ae x p r e s s i o nl e v e la n dt h ea c t i v i 移o fc a s p a s e - 3 ，8 ，9w e r ed e t e c t e db ys e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c ra n dc o l o r i m e t r y w i t ht h ei n c r e a s eo fa v mc o n c e n t r a t i o n ，t h ea c t i v i t yo fc a s p a s e - 3a n dc a s p a s e 一9 ，a n dt h em r n ae x p r e s s i o no fc a s p a s e - 3i nn e u r o n si n c r e a s e dg r a d u a l l y t h ea c t i v i t yo fc a s p a s e - 8i n c r e a s e di nn e u r o n si n2 5 1 x g 。l _ 1e o n t r a t i o n ，n od i f f e r e n c e sw a sf o u n di no t h e re x p e r i m e n t a lg r o u p s 。i ts h o w e dt h a ta v mc o u l di n d u c en e u r o n a la p o p t o s i st h r o u g hm i t o c h o n d r i a lp a t h w a yb ya c t i v a t ec a s p a s ee n z y m es y s t e m 7 c a mm r n ae x p r e s s i o nl e v e lo fi n t r a c e l l u l a ra n dc a l c i u mi o nc o n c e n t r a t i o nw e r ed e t e c t e db ys e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c ra n df l u o r e s c e n tp r o b e t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta v mc o u l dd e c r e a s ec a mm r n ae x p r e s s i o nl e v e l ，i n c r e a s ef r e ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o n ，d i s r u p tt r a n s p o r to fc a l c i u mi o n s ，a n dr e s u l t i n gi m b a l a n c eo fc a l c i u mh o m e o s t a s i s i ts h o w e dt h a ta v mi n d u c en e u r o n a la p o p t o s i sb ya f f e c ti n t r a c e l l u l a rc a l c i u mh o m e o s t a s i s f r o mt h ep e r s p e c t i v e so fc y t o t o x i c i t y ，a p o p t o s i s , o x i d a t i v es t r e s s ，d n ad a m a g e ，m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ，a c t i v i t yo fm i t o c h o n d r i a le n z y m e ，c a l c i u mh o m e o s t a s i s ，a p o p t o s i sp r o t e a s e ，t h em i t o c h o n d r i a lm e c h a n i s mo fa v mt o x i c i t yw a se l u c i d a t e di n c e l lm o r p h o l o g y 。b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dm o l e c u l a rl e v e l 硅i sr e s e a r c hc a np r o v i d en e wi d e a sa n dv i e w sf o rr e v e a l i n gt h ep o i s o n i n gm e c h a n i s mo fa v m ，r e p l e n i s ha v me c o t o x i c o l o g i c a ld a t a ,p r o v i d ev a l u a b l ec l u e sf o rf u r t h e rs t u d yo nb i o l o g i c a le f f e c t so fa v m , a n dp r o v i d eas c i e n t i f i cb a s i st op r o t e c te c o l o g i c a le n v i r o n m e n ta n da p p l y a v e r m e c t i n t y p ed r u g sr e a s o n a b l y k e yw o r d s ：a v m , n e u r o n so f k i n gp i g e o n ，p i g e o n , m i t o c h o n d r i o np a t h w a yo f a p o p t o s i si vc a n d i d a t e ：c u iy a l is p e c i a l i t y ：b a s i cv e t e r i n a r ym e d i c i n es u p e r v i s o r ：p r o f l i s h u研究生学位论文独创声明和使用授权书研究生学位论文独创声明和使用授权书独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得( 逵! 翅逡直墓丝盂薹挂别主明的：奎拦豆窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：御码日期：舻月拥学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：挪多日期：嬲年月狮导师签名：鸯年日期：碲钼潮引言l 引言随着农业和畜牧业的发展，许多生物农兽药达到了“高效、低毒、低残留和无污染”的新药开发要求，但并非天然源的产品都是安全的，部分生物农兽药及其制剂是高毒或中毒品种，a v m 就是其中之一。a v m 作为一种新型高效生物源驱虫药物，虽属生物源农畜两用杀虫剂，却对人、畜、蜜蜂和家蚕高毒( 孙建析，2 0 0 7 ) ，目前a v m 在我国畜牧业及农业生产中广泛应用。2 0 0 5 年我国a v m 生产能力超过8 0 0 吨，涉及a v m 生产的4 0 0 家企业累计登记产品多达1 3 0 0 个。随着a v m 使用量的不断上升，在促进了农业和畜牧发展的同时，也对人类的健康和生态环境产生影响。例如：a v m 作为农药，直接喷洒在人类食用的各种作物、蔬菜和果树上，残余的农药将危及人体健康，如果喷洒的农药随大气或直接进入土壤、水中，会对生态环境造成影响；a v m 作为兽药，应用时有多种给药途径，但不论通过何种给药途径，大部分药物通过粪便以原型排除，其余的通过尿液和泌乳动物的乳汁排出( 扈洪波等，2 0 0 0 ) ，而且a v m s 药物在用药动物粪便中的降解速率较在未用药动物粪便中的降解速率要慢，因此a v m 造成的对环境的潜在影响引起了人们的关注( 扈洪波等，2 0 0 0 ) 。1 1 阿维菌素的概述a v m 是目前兽医临床上使用最多的抗体内外寄生虫药物，也是农业生产上广泛使用的一种农业杀虫剂。此种药物是1 9 7 9 年美国、日本科学家将土壤中的一株放线菌( s t r e p t o m y c e sa v e r m y c t i n s ) 发酵培养后得到的( 蒋才武等，1 9 9 9 ) 。1 9 8 1 年由美国m e r c k 公司对其实现产业化，自此开始在世界范围内被大规模推广使用( e g e r t o ne t a l ，1 9 7 9 ) 。在我国，a v m 是1 9 9 3年由原北京农业大学微生物工程工业试验基地首次成功研制并生产，伊维菌素、多拉菌素是后来发展起来的a v m 同类产品( 蒋金书等，1 9 9 5 ) 。a v m 是一种十六元大环内酯类抗生素，其上连接有三个主要基团：六氢化苯丙呋喃( c 2到c 8 ) ，二糖基( c 1 3 ) 和螺酮缩醇系统( c 1 7 到c 2 8 ) 。阿维菌素类( a 、仆嗄s ) 混合物根据取代基不同，可分为8 个组分，其中4 个主要组分为a l a 、a 2 a 、b l a 、b 2 a ；4 个次要组分为a l b 、a 2 b 、b l b 、b 2 b 。这8 种成分都具有抗虫活性，其中b 组分的约效较a 组分要强，而b 1 组分药效比b 2 组分略强。每个组分的结构均通过c 1 3 一烃基连着大环内酯。a v m 具有脂溶性，可溶于许多有机溶剂中，如氯仿、甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙脂、环己烷、二氧甲烷、二甲基亚砜等。a v m s 药物在水中的溶解度是6 1 0 岭l - 1 。此外，该类化合物对光敏感，如用紫外线照射，则可导致其结构中的8 、9 和1 0 、1 1 之间的双键异构化，从而失去药物活性。其主要成份a v m b l a 光解产物毒性比其母体a v m b l a 小得多，a v m b l a极性代谢终产物的毒性比母体a v m b i a 大约低1 6 0 倍( w i s l o c k i ，1 9 8 9 ) 。a v m b i a 在土壤中缺乏流动性，在土壤中可以通过土壤微生物进行生物降解，a v m b l a 在土壤中的有氧降解半衰期为2 8 周。v i n c e n t ( 1 9 8 3 ) 的试验结果表明，a v m b 2 a 施入土壤后，在土壤微生物作用东j 农澎大学农学硕 学像论文下c 2 3 像o h 被戴纯成c = o ，使箕杀绫虫、选下害虫鹃麓力和持效皴反丽离予母体a v m b 2 a ，因| l 鹾：，药性爱强。营罴信( 1 9 9 5 ) 就瞥报道，a v m 能通过土壤微生物分解成鼷有更高活性酶衍生物，来杀死植物线虫。1 2 阿维菌素的毒性作用近年来a v m7 t 起动物中霉酶瘸掰屡屠壤邋，牛、狻、犬、骡鞫等a v m 中毒 隧床均表瑰明显的神经瘢状和神经器官的损伤。目前认为熟毒性作用机制是由于a v m 作为y 一氨基丁酸( g a b a ) 懿激动裁，可以导致毒g a b a 奔导豹中枢神经爱神缓一腿肉闽健导受阻。嚏乳动物外周神经传导递质为乙酰腮碱，以g a b a 僚传导递质的神经仪存在于中枢牢串缀系统，在正常使- 用剂量下，由于哺乳动物的血脑屏障作用，药物在中枢神经系统的分布浓度很低，不足熬孳l 慧g a b a 魏大鬣释藏，辫丽对嗡戮囊耪荠不产生骥翌不嶷影旗。餐在大裁薹傻鲻漪，药物进入中枢神经系统的数髓达到或超过作为g a b a 激动荆的阈值时，即可引起动物中懑。某些幼畜，壹予其纛脑孱障漏泰发育健金，较戏年动物要敏感；一些患有躺部疾病的动物，其盘瓣羼障功栽发生障褥，一量蕤物避囊帮可引发中毒。最近研究发现，在小鼠翁矗脑辫障孛有一种p 糖缀自起着运输泵的作用，它可以阻捷a v m 在哺乳动物中枢神经系统中的蓄积( m c k e l l a r ，1 9 9 7 ) 。这一发现可对嚣瑟溶往稷强的a v m 在中枢耱经系统中分凑数董很少律是了合理解释。一般来说，无脊椎动物对a v m 魄较敏感。甄翡l 对a v m b l a 的l d 5 0 为2 8 m g k 9 1( 2 8 d 试验) 。张跃华等( 2 0 0 2 ) 掇邋，a v m 在浓度为1 2 5 m g k 9 1 以主时才袅对主壤中缀落、放线菌、真菌生长速率有明显的抑制作用，而且对不同麓属酶搀制浓度有差异。a v m 对农业害康和动物体内外的寄生虫毒性较大，动物用蓊后，在粪便中残罄镌a v m 及其代谢产物对粪酝昆虫有影响，一般来说，a v m 对粪区昆虫的毒性与馘虫的种属有关，苍蝇和粪甲斑的幼虫地残虫敏感。此外a v m 澍蜜蜂的毒性较强，l d 5 0 必0 0 0 9 t x g 只，美溯鹌鹁和努鸦的露粮l d s o 分嬲为3 1 0 2 m g k 9 1 、3 8 3 m g - k g ，王鸽为5 3 7 。0 3 m g - k g - 1 ( 攀术等，2 0 0 3 ) 。环境中的a v m 不但对土壤微生物、蚯蚓，及水生生物鱼、藻类、兹类等非靶动物产生影穗，嚣且进入垂环境孛熬药褥哥在熏辏俸内富集，在整个生态系统孛，药物邂过不断躺生物富集与食物链的传递而逐级浓缩，人类处于食物链的最高位，受害最为严重( 陈杖榴等，2 0 0 1 ；c e m i g l i ae ta l ，1 9 9 9 ) ，因此a v m 豹生态毒理学越来越引起人类关注，有必要对a v m及其下游产潞进行毒理学安全性译稔。按w h o 五缀分类标礁，a v m s 蓊物属纛毒纯合物，其药代动力学数据表明，a v m 在动物体内残留的时间较长，属于毒性较大，休药期长的药物。在傻孀不当豹情况下，动物组织中会残警过羹的a v m s 楚物，熟果人类食矧这样憨动物食燕会对健康造成严霆危害，黢藏动物缀织中a v m s 药物豁残留受到极大关注。荚霹、欧缢、食品法典委员会( c a c ) 和中翱等均到宠了a v m s 药物的最麓残蟹限鬟。但翻前图内澎来就a v m对环境生态毒性影嫡进行全疆深入的研究。2引言1 3 阿维菌素与细胞凋亡a v m s 药物可以经消化道和皮肤吸收，其急性毒作用的靶器官是神经系统( 张晓峰，2 0 0 5 ) 。动物a v m s 药物中毒时，无论在中枢神经还是周围神经，都可以发现神经系统的病理组织学改变，主要表现为小脑实质出血和水肿( 李术，2 0 0 3 ) ，大脑皮质弥漫性改变，神经细胞水肿、变性、核固缩、坏死，神经胶质细胞增生，神经毡崩解，病变程度随染毒剂量增加和染毒后观察时间延长逐渐加重( 张晓峰，2 0 0 5 ) 。神经细胞病变大多属于神经的轴突变性，一般来说，在同样的损伤条件下，动物的中枢神经系统的轴突变性不可修复，而周围神经系统的轴突变性可逐步恢复；但若反复接触神经毒物，也可导致顽固性的轴变性，且可进行性发展为类似于多发性硬化症的病变( 吴强恩，2 0 0 3 ) 。李术( 2 0 0 3 ) 通过原位末端标记法检测，发现日粮中过量添加a v m 可引起王鸽肝、肾、大脑、小脑组织发生细胞凋亡，大脑、小脑细胞凋亡现象尤为明显，且发现随着染a v m 剂量的升高，凋亡细胞的数量亦增加，在2 0 0 7 年王敏试验中又发现，a v m 能使体外培养的王鸽脑神经细胞凋亡，凋亡严重程度存在时效性，但其凋亡机制未见报道。a v m 能使细胞内c a 2 + 水平上升( 王敏，2 0 0 7 ) ，c a 2 + 增加有可能激活了细胞信号转导途径，引起细胞凋亡，李涛( 2 0 0 2 ) 通过溴氰菊酯致神经细胞毒性试验对胞内c a 2 + 增加可能会引起细胞凋亡这一可能性做过报道，但是a v m 引起神经细胞内c a 2 + 增加的机制并不清楚。程广东研究表明a v m 能够使王鸽脑神经细胞膜上的g a b a a受体m r n a 的表达水平增高。由于g a b a 会降低细胞外c a 2 + 水平，但c a 2 + 的去向不明，如果进入细胞则会引起胞内c a 2 + 升高，这可能是a v m 诱导脑组织细胞发生凋亡的原冈之一；又通过对王鸽脑组织超微结构的观察，发现a v m 可引起脑细胞中线粒体、内质网等组织超微结构损伤( 程广东，2 0 0 5 ) 。线粒体被称为决定细胞生死的开关，线粒体在凋亡中的中心地位已经确立，但线粒体调控机制是否在a v m 诱导王鸽脑神经细胞凋亡中发挥作用还不甚清楚。1 4 细胞凋亡线粒体调控机制的研究进展细胞凋亡现象广泛存在于多细胞生物体中，是多细胞生物体一种重要的自我稳定机制，与细胞的增殖、发育和分化具有同等重要的生理学或病理学意义。因此，有关细胞凋亡的研究日益受到重视，涉及的学科和研究领域也更加广泛。自l9 7 2 年病理学家k e r r 等在c a n c e r杂志上首次提出了细胞凋亡的概念以来，细胞凋亡的研究迅速发展。目前，细胞凋亡已成为分子生物学、细胞学、免疫学、肿瘤学以及病毒学等诸多领域的研究热点。细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程，与机体清除受损细胞的另一种细胞死亡方式坏死相比，细胞凋亡有其自身的形态学及生化特征。细胞凋亡的形态学变化是多阶段的( m c c o n k e y ，1 9 9 4 1沈忠英，2 0 0 0 ；薛占永，2 0 0 3 ) ，首先细胞体积缩小、变圆，细胞骨架解体，与周围细胞的联系失去，胞浆浓缩，内质网变疏松并与胞膜融合，核糖体、线粒体等聚集，但结构无明显改变，核染色质逐渐凝聚成新月状附着在核膜周边，嗜碱性增强，核同缩成均一致密物进而断3东毙农、蓝大学农学硕二l 二学便论文裂，核仁消失，胞膜仍究蹩。随感髓膜表露起泡，核破裂，碎片分散在照浆中，照膜迅速内黧将细胞分割成多个大小不等的由膜包裹的不连续凋亡小体( a p o p t o s i sb o d i e s ) 。最终獭亡小体被周围舆有番曦功能瓣细胞如臣噬细胞、上皮绸臆等细胞吞噬降解，全遵程仅需数小时。露一组织中，不同缨脆发生凋亡的过程著不霹步。穰亡细胞魂发生生物化学特性改变，如魏膜内磷脂醌丝氮酸外翻，d n a 片段讫，细胞骨架勰离，细施内功能蛋融被爨自酶与核酸簿降解等( k e r r ，1 9 7 2 ) ，导致细胞在近乎正常的细胞质膜内趋向死亡，这与坏死时细胞质膜早期破坏不孺( 琶薅ee t a l ，2 0 0 0 ) 。随着细胞凋亡研究的深入，人们发现某些和丽亡有关的蒸因产物( 簧囱质或酶) 均可定位于线粒体，k r o e m e r 等甚至提出了细胞凋亡以细胞核为中心到以线粒体为中心的观点( b r e n n e r e t a ，t 9 9 8 ) 。轶褥使线粒体与细胞凋亡之间耀关链酶研究成为当今生命科学领蠛的前沿课题( d rg r e e ne ta l ，1 9 9 8 ) 。线粒体是一个双层貘凄成魏囊状结构，外膜与内麒阍魏空腔称为辨室，由内膜潮成麴腔称为内室或线辍体基质。线粒体具骞氧纯磷酸化、抟递电予、贮存c 矿、畿量代谢、抗活性氧化等重要生理作用，它为细胞的各种生命活动提供基础能餐。研究发现，线粒体内也包含一些与细胞蠲亡套密切关系熬物簸，如缨照色素c 、凋亡诱嚣糊子( a i f ) 、c a 2 + 帮r o s 等。在凋亡信号的刺激下，线粒体膜邋透性增加，由此产生一系列关键性变化，包括细胞色素c的释敞、线粒体跨膜电德( a 攀m ) 的一f 降、纲戆内氯纯还原状态的改变、b c l 基因家族戏员熬分入等。不飚信号的镥学最终集中到线狡体上激灞或瓣意l 这些事件的发懋，褥经相应戆信号传导通路调控凋亡( g r e e n ，1 9 9 8 ) 。因此，线粒体在细胞凋亡的发生中越着踅要作髑，被形象地称为细胞凋亡的“燃烧室”。目前的研究将凋亡酌调节归纳为两条主要途径：外源性途经( 域称湾死亡受俸途经) 帮内源性途径( 或称燕线辍体途径) ( d a n i a l ，2 0 0 4 ) 。本婿究重点讨论奔学细胞蘸亡的线粒体途经的楣关因素。1 4 薹线粒体通透性转换孔( 御职) 与细胞凋亡m p t p 是线粒律蠹暌与乡 膜交接楚静一种复合臻构，被称茭 维脆生死开关，由电鲣藏蓑性阴离子孔道( v o l t a g e d e p e n d e n ta n i o nc h a n n e l ，v d a c ) 、腺苷酸移位酶( a d e n i n en u c l e o t i d et r a n s l o c a t o r ，a n t ) 、亲索环d 和苯并二氮受体构成。m p t p 能被多种因素激活，激瓣蜃导致线粒体簇阍隙爱自霞予释放入麓震中。线粒体膜走蠢隙蛋宣麓具体释放枫露嵩不清楚，嚣蘸有很多不同的研究报道。在应激状态下( 如死亡信号) ，m p t p 开放并允许分子量小予l 。5 k d熬物质遥避，包括矮子和承分子，矮子霹导致线粒体膜内外熬矮子檬度和魄势撵度溺溃，导致解髑联昀氧纯磷酸纯作阁，水分子的渗入霹使线戳体肿胀藕原来迂黼酶线粒体内膜 审震。尽管线粒体内膜拥宥足够的表葱积来适应这魑膨胀作蒯两自身不会破裂，但线粒体孙膜魑抗膨胀能力疑有限的。因此线粒体内膜盼膨胀导致线粒体外膜的破裂，麸霞嚣致细脆色索e 和其他致凋亡蛋囱释放到细胞质中。簸终，m p t p 的拜放，一方面使得线粒钵内的死亡健进因予( d e a t h e p r o m o t i n g f a c t o r ，d p f ) 释教出来，促进凋亡酶进行；另一方谣，又使得细稳瑟进入线越体基矮，出此孳| 起膜魇子的转运异常，导致线粒体处予麓渗状态，线糠傣基质扩张，缨4引言胞骨架蛋白受压，直接导致细胞凋亡。因此，可以说线粒体通透性转换孔( m p t p ) 是细胞凋亡的线粒体途径的枢纽。z a m z a m i o 也证实i v i p t p 是细胞凋亡早期的决定性变化( r i e k oe ta l ，2 0 0 2 ) 。1 4 2 线粒体膜电位( a 、= f m ) 与细胞凋亡a h o m 是由电子传递链的化学和电子组分形成的，膜电位的变化能反应细胞内代谢，细胞活力和凋亡情况( d e l o g ue t a l ，2 0 0 1 ) 。研究表明在几乎所有的细胞凋亡中均有ak o m 的下降，且这种改变发生在细胞凋亡的形态学改变之前，提示v m 下降发生于凋亡的早期阶段。通过抑制av m 的下降可以阻止凋亡的发生，证实细胞k t t m 变化为凋亡的特异性改变( 蔡循等，2 0 0 1 ) 。凋亡细胞的ak u m 下降源于线粒体膜通透性( p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n ，p t ) 的改变，ak v m 是反映线粒体内膜通透性的最佳指标之一。p t 的改变受m p t p 调控，m p t p 的开放使线粒体基质和胞浆内的离子得以平衡的流动，使原来的线粒体内膜跨膜电位被驱散，影响呼吸链正常运转。观察游离的线粒体表明低a t p 、胞质c a 2 + 升高及r o s 的增加可以使a n t的构向改变，进而引起m p t p 的开放，m p t p 的持续开放则使av m 及p h 崩解，呼吸链解偶联，线粒体基质渗透压升高，内膜肿胀，同时伴有线粒体膜间隙的细胞色素c 、a i f 和c a s p a s e 酶原等物质的释放，通过凋亡的级链反应引起细胞凋亡。1 4 3 线粒体细胞色素c 与细胞凋亡细胞色素c 是线粒体呼吸链的重要组成部分，它是由两个无活性的前体分子合成的：前细胞色素c ( 该蛋白质由细胞核基因编码，然后被转运至线粒体) 和亚铁血红素( 由线粒体合成) 。由于细胞色素c 具有亚铁血红素基团，它可以在呼吸链复合酶( 细胞色素还原酶) 和i v ( 细胞色素氧化酶) 之间传递电子。细胞色素c 缺乏时，电子传递链被阻断，将导致两方面的后果：a t p 合成减少及不完全氧化造成的r o s 过度生成，其中r o s 是诱导凋亡的重要因素。近年来对细胞色素c 的认识已经从其对能量代谢的控制而发展为对其参与凋亡过程的研究。在凋亡过程中起重要作用的不只是线粒体呼吸活性的丧失，更重要的是细胞色素c 从线粒体的释放。正常情况下细胞色素c 是一个定位于线粒体膜间隙的水溶性蛋白质，稳定结合于线粒体内膜，且不能通过外膜。凋亡过程中细胞色素c 通过线粒体外膜释放，在a t p d a t p的参与下，能与凋亡蛋白酶活化因子l ( a p o p t o s i sp r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o rl ，a p a 仁1 ) 结合( y o s h i d a ，1 9 9 8 ) ，使其形成多聚体，并促使c a s p a s e 9 与其结合形成凋亡体( a p o p t o s o m e ) ，结果c a s p a s e 9 被激活，激活的c a s p a s e 9 能够激活其他的c a s p a s e 如c a s p a s e 一3 等，从而诱导凋亡。哺乳动物的c a s p a s e 9 和它的激活物a p a b l 被认为是线粒体途径诱导凋亡所必需的，因为缺乏两者中任何一者的小鼠，都表现为神经元异常增生，淋巴细胞和成纤维细胞对一定的凋亡刺激表现出抵抗等( l ij i ae ta l ，2 0 0 1 ) 。在人的细胞中已发现三种a p a f s ，研究表明5东托农泣人学农学硕七学谴论文i i , , l , , i , h i ii,i!,i,i1 1t 1 i i i!a p a f - 2 就是维貔色素c ，a p a f - 1 需要线粒俸缨胞色素e 的存在才能潘优c a s p a s e - 9 ( v u s 毽娩e ta l ，2 0 0 2 ) 。实验表鞠线粒体细胞色素c 从线粒体释放憝细胞凋亡的关键步骤( 方希敏，2 0 0 5 ) 。张琴丽等( 2 0 0 5 ) 的研究缔粱也提示，在铝诱导的大飘海骂神经细腕捅亡作用桃制孛细耱色素e 由线粒体释放入胞震与细骢孺亡懿寝动豢着密切熬关系。甲基苯嚣胺诱导神经缨胞德亡过程孛慝榉发现了细胞色素c 的参与( 王雪等，2 0 0 5 ) 。可燕缨旎色素c 在线粒体凋亡途径中发挥关键作用。1 4 4 线粒体s m a c 因子与细胞凋亡线粒体凋亡在神经元凋亡中发挥着重要作用。线粒体源c a s p a s o 的第二个激活因子( t h es e c o n dm i t o c h o n d r i a la c t i v a t o ro f c a s p a s e ，s m a e ) ，又称d i a b l o ( d i r e c tl a pb i n d i n gp r o t e i n ) ，是线耱体的一种键诵亡蛋自，警缨稳疆亡霹被释藏委稳震中，促迸缨麓色素c a p a f 谈赖酶c a s p a s e 活性。它的前体是e l j2 3 6 氨撼酸组成的蛋白质，氨基末端的5 5 个氨熬酸作为锚定序舞，在转入线粒棼嚣雩被切除。s m a c 熬藏体n 米溃带脊线粒钵鞋良黪裂，被裂解基产生成熟昀二聚体随细麓包索c 的释放两释放入胞浆，与糯亡蛋自抑制因子中秆状病毒i a p 重蠹结构域有高裘和力。三维结构发现，s m a c 的前体与c a s p a s e 穆相同，其n 端也有l a p 的结合模体，通过氢键翱疏水键与渔p s 的b i r 2 秽b i r 3 结构域缝合，发挥诞凋亡终用。吴勉等( 2 0 0 3 ) 研究发现l a p 家族成员s u r v i v i n 与s m a e d i a b l o 在紫衫酚诱导的细胞满亡幸荧系密切。在紫衫醚作爝下，s m 鑫c d i a b l o 铁线粒体释放入麓质，露辩缨胞色索c释放增多，下游的c 鑫s p a s e 豢族凝亡扇动子翻效魔予均有显著增加，伴有撼亡现象。m c n e i s