（细胞生物学专业论文）iqgap蛋白在极化上皮细胞中的功能研究.pdf

中国科学技术大学博士学位论文 摘要 肌动蛋白骨架在上皮细胞极化形成中起着重要作用，r h og t p a s e 家族的成员c d c 4 2 通过i q g a p s 等下游底物调节着肌动蛋白骨架动力 学。胃壁细胞是一种典型的极化上皮细胞，其酸分泌过程为研究 c a m p 介导的胞吐过程及顶膜肌动蛋白骨架动力学提供了一个极佳 的模式系统。我们早先的研究表明，肌动蛋白的两种亚型在胃壁细胞 中呈极化分布，同时肌动蛋白骨架的完整性对胃酸分泌非常重要。为 探索肌动蛋白骨架在上皮细胞极化形成过程中的分子机理，我们利用 亲和树脂结合质谱分析发现胃壁细胞含有两种i q g a p 亚型( i q g a p l 和i q g a p 2 ) 。进一步的激光共聚焦显微镜分析发现：c d c 4 2 主要定 位于壁细胞的项膜，同时c d c 4 2 的两个底物i q g a p l 和i q g a p 2 也 在胃壁细胞中呈极化分布，其中i q g a p l 主要定位于胃壁细胞的底 膜，i q g a p 2 主要定位于胃壁细胞的顶膜。人工合成的i q g a p 来源 的与c d c 4 2 相互作用的小肽段可以竞争型的结合c d c 4 2 ，通过破坏 i q g a p s 、c d c 4 2 和肌动蛋白骨架的相互作用，阻止刺激所引起顶膜 肌动蛋白骨架重排从而达到抑制壁细胞酸分泌的作用。我们认为： i q g a p 2 可以把c d c 4 2 与项膜肌动蛋白骨架联系起来从而保证了胃壁 细胞极化酸分泌的顺利进行。目前我们正利用生物光谱学技术手段来 探寻“项膜信号复合体”的蛋白质作用网络在实时胃酸分泌过程中的 时空调控规律。相信在不久的将来，借助于“顶膜信号复合体”联结 的蛋白质作用网络，我们可以描绘出胃酸分泌的系统生物学模型。 i i i 中国科学技术大学博士学位论文 a bs t r a c t a c t i nc y t o s k e l e t o np l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ee s t a b l i s h m e n ta n d m a i n t e n a n c eo fe p i t h e l i a lc e l lp o l a r i t y c d c 4 2 ，am e m b e ro fr h og t p a s e f a m i l y , m o d u l a t e sa c t i nd y n a m i c sv i ai t sr e g u l a t o r s ，s u c ha si q g a p p r o t e i n s g a s t r i cp a r i e t a lc e l l sa r ep o l a r i z e de p i t h e l i a lc e l l si nw h i c h r e g u l a t e da c i ds e c r e t i o no c c u r si nt h ea p i c a lm e m b r a n eu p o ns t i m u l a t i o n p r e v i o u ss t u d i e ss h o ws h o w nt h a ta c t i ni s o f o r m sa r ep o l a r i z e dt od i f f e r e n t m e m b r a n ed o m a i n sa n dt h a tt h ei n t e g r i t yo ft h ea c t i nc y t o s k e l e t o ni s e s s e n t i a l f o ra c i ds e c r e t i o n t od i s s e r tt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m s u n d e r l y i n gp o l a r i z e da c t i nc y t o s k e l e t o nn e t w o r kb e t w e e na p i c a la n d b a s o l a t e r a lm e m b r a n e s ，ih a v ec a r r i e do u ta n t i b o d ys c r e e nt o i d e n t i f y a c t i nc y t o s k e l e t a lr e g u l a t o r st h a ta r ep o l a r i z e dt oa p i c a lm e m b r a n eo ft h e g a s t r i cp a r i e t a lc e l l s m ys t u d yh a dr e v e a l e dt h a tc d c 4 2i sp r e f e r e n t i a l l y d i s t r i b u t e dt ot h ea p i c a lm e m b r a n eo fg a s t r i cp a r i e t a lc e l l s i na d d i t i o n ， t w oc d c 4 2r e g u l a t o r s ，i q g a p1a n di q g a p 2 ，a r ep r e s e n ti n g a s t r i c p a r i e t a lc e l l s i n t e r e s t i n g l y , i q g a p 2i sp o l a r i z e dt ot h ea p i c a lm e m b r a n e o ft h ep a r i e t a lc e l l sw h i l ei q g a p1i sm a i n l yd i s t r i b u t e dt ot h eb a s o l a t e r a l m e m b r a n e a ni q g a pp e p t i d et h a tc o m p e t e sw i t hf u l l l e n g t hi q g a p p r o t e i n sf o rc d c 4 2 一b i n d i n gi nv i t r oa l s oi n h i b i t sa c i ds e c r e t i o ni ns l o p e r m e a b i l i z e dg a s t r i cg l a n d s f u r t h e r m o r e ，t h i sp e p t i d ed i s r u p t st h e a s s o c i a t i o no fi q g a pa n dc d c 4 2w i t ht h ea p i c a la c t i nc y t o s k e l e t o na n d p r e v e n t st h ea p i c a lm e m b r a n er e m o d e l i n gu p o ns t i m u l a t i o n w ep r o p o s e i v 中国科学技术大学博士学位论文 t h a ti q g a p 2f o r m sal i n kw h i c ha s s o c i a t e sc d c 4 2w i t ht h e a p i c a l c y t o s k e l e t o na n dt h u sa l l o w sf o ra c t i v a t i o no fp o l a r i z e ds e c r e t i o ni n g a s t r i cp a r i e t a lc e l l s c u r r e n t l y , w ea r eu s i n gb i o p h o t o n i ct e c h n i q u et o i l l u s t r a t et h ef u n c t i o no fp r o t e i n p r o t e i ni n t e r a c t i o nn e t w o r ko f a p i c a l s i g n a l i n gc o m p l e x ”i nt h es p a t i o t e m p o r a lr e g u l a t i o no fg a s t r i ca c i d s e c r e t i o np r o c e d u r e w eb e l i e v et h a tw ew i l ld e p i c tt h es y s t e mb i o l o g yo f g a s t r i c a c i ds e c r e t i o n b yi l l u s t r a t i n g t h eo r c h e s t r a t i o no ft h e p r o t e i n p r o t e i nn e t w o r ko ft h e “a p i c a ls i g n a l i n gc o m p l e x i nt h en e a r f u t u r e w eh o p et oa p p l ys u c hi n f o r m a t i o nt ob e t t e ru n d e r s t a n dd i g e s t i v e p h y s i o l o g ya n dp a t h o p h y s i o l o g ys u c ha sh e l i c o b a c t e rp y l o r ii n f e c t i o n v 中国科学技术大学博士学位论文 p k a p k c m e c k 嫩 s l 0 p i t p l i m c l i c 【a p k c c k v i p t v s n s f k n q l a tb e r k 匝k1 2 c l i p 一1 7 0 缩略词表 _ a m i n o p _ y r i n e p r o t e i nk i n a s ea p r o t e i nk i n a s ec m _ y o s i nl i g h tc h a i n k i n a s e a d e n o s i n e _ r i b o s y l a t i o nf a c t o r s _ t r e p t o l v s i nq p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l _ _ t r a n s f e r p r o t e i n l i n l1 ，i s l 一1a n d m e c 一3 c h l o r i d ei n t r a c e l l u l a rc h a n n e l s m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n _ k _ k i n a s e c h o l e c _ v s t o k i n i n v a s o a c t i v e i n t e s t i n a lp e p t i d e t u b u l o v e s i c l e s n e t h y l m a l e i m i d es e n s i t i v e f a c t o r v e s i c l e 。a s s o c i a t e dm e m b r a n ep r o t e i n l a t r u n c u l i nb e x t r a - c e l l u l a rs i g n a lr e g u l a t e dk i n a s e2 m i t o g e n a c t i v a t e do r e x t r a c e l l u l a rs i g n a l r e g u l a t e dp r o t e i nk i n a s e1 2 c _ _ y t o p l a s m i cl i n k e r p r o t i e n 一17 0 中国科学技术大学博士学位论文 m t o c g s k 一3 p a p c g e f s t p a h g f e m t r h 0g d i s g a p s c a m s a p k c h d c a m a l d i t o f m i c r o m b u l eo r g a n i z i n gc e n t e r g l y c o g e n _ s _ y n t h a s ek i n a s e 一3b a d e n o m a t o u s p o l y p o s i sc o l i g u a n i n en u c l e o t i d ee x c h a n g e rf a c t o r s 2 0 一t e t r a d e c a n o y l l 2 h o r b o l 一13 一a c e t a t e h e p a t o c y t eg r o w t h f a c t o r e p i t h e l i a lm e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n i 池0g d pd i s s o c i a t i o ni n h i b i t o r s g t p a s e - a c t i v a t i n gp r o t e i n s c a l m o d u l i n s t r e s s a c t i v a t e d p r o t e i n _ k _ i n a s e ，s a p k c a l p o n i nh o m o l o g yd o m a i n c o n t i n u o u s l ya c t i v e d o m i n a n tn e g a t i v e m a t r i x 一一a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o n i n o i z a t i o n 一一t i m e o ff l i g h t i i 中国科学技术大学博士学位论文 第一部分文献综述 第一章胃酸分泌的细胞生物学 泌酸细胞是胃腺中几种上皮细胞中的一种，因其周围的突起触及腺壁，故名 壁细胞。胃酸分泌是由结合在基侧质膜的配体受体引发的一个精细调控的过 程，结果是h + ，c 卜和水分子透过壁细胞的顶膜分泌到胃腔内。胃酸分泌生理学上 的刺激信号包括组胺，乙酰胆碱以及胃泌素。酸分泌的活化涉及到一系列生理学 过程，首先是胞内c a m p 及钙离子水平的提高，然后是c a m p 依赖的蛋白激酶 级联通路的活化，h + ，k + a t p a s e 从管状囊泡膜上转位到壁细胞的顶膜，最后是 顶膜肌动蛋白骨架面积的极大扩张 y a oe ta 1 ，2 0 0 3 。 第一节胃酸分泌的精细结构基础 壁细胞作为一种特化的上皮细胞，具有与其功能相关的显著的形态学特征。 顶膜是由一系列小的微管形成的独特结构形式，这些小的微管由整个细胞的表面 及表面突起收缩形成，并且小管之间存在连接。在静息期的胃壁细胞中，这些顶 膜囊泡内衬短而粗的微绒毛，它们由大量的肌动蛋白微丝以及一些肌动蛋白结合 蛋白支撑着。细胞质中充满着富含h + ，k + 一a t p a s e 的膜结构，形态学上它们主要 以囊泡、小管和潴泡的形式存在，所以通常称之为富含h + , k + - a t p a s e 的管状囊 泡。 壁细胞一旦被激活分泌胃酸，将发生一系列形态学上的变化( 如图1 1 ) 。早 期由于光学显微镜的限制，胃酸分泌的细胞生物学研究进展一直很缓慢，十九世 纪晚期高尔基体的超细组织学研究发现分泌状态时的壁细胞微管膨大。电子显微 镜图像清晰地表明了最大程度刺激时，壁细胞的微管空间扩张，同时具有伸长的 微绒毛的顶膜面积明显膨大，而胞质管状囊泡的数量却显著减少。已有的大量数 据都支持膜循环理论。这一理论认为：壁细胞酸分泌的激活将导致h + ，k + a t p a s e 通过管状囊泡膜和顶膜的融合而转位到顶膜 - f o r t ee ta 1 ，1 9 9 6 。但是还有一种 中国科学技术大学博士学位论文 观点认为在静息与刺激状态下，富含h + , k + - a t p a s e 的膜与顶膜毗邻，因此否定 了基于融合的招募过程 p e t t i t te ta 1 ，1 9 9 5 ；p e t t i t te ta 1 ，1 9 9 6 。2 0 0 2 年，研究 图1 1 壁细胞酸分泌过程中的顶膜骨架重排示意图 者利用高压快速冷冻技术制备胃壁细胞并结合电子显微镜观察来分析其三维结 构，最终澄清了此前关于胃壁细胞活化过程中形态学变化的争论e d u m a ne ta 1 ， 2 0 0 2 。高压电子显微镜的观察结果清晰地证实了管状囊泡膜会从质膜中分离， 同时还进一步证实了早期化学固定技术研究的结果。壁细胞超微结构以及壁细胞 激活需要蛋白的招募和融合有力地支持了壁细胞活化的循环招募模型。此外，利 用这种新的固定方法发现壁细胞中大量的线粒体在胞质内形成了一个广泛错综 的结构网络。因为已有实验表明胃酸分泌过程和氧化代谢之间存在紧密联系，所 以阐明线粒体动力学与胃酸分泌过程是否存在联系以及联系的紧密程度将是十 分有意义的工作。 第二节胃酸分泌的信号传导 壁细胞中胃酸分泌的激活受旁分泌、内分泌以及神经刺激的调节。b e r g l i n d h 中国科学技术大学博士学位论文 以及6 b r i n k 的胃腺分离技术以及在体外利用氨基比林a p ( a m i n o p _ y r i n e ) 这种小 分子弱碱监测胃酸分泌的方法的发展大大推动了胃酸分泌过程的细胞生物学研 究 b e r g l i n d he ta 1 ，1 9 7 6 - 。c h e w 及其同事在胃酸分泌这一领域做出了先驱性 工作 - c h e we ta 1 ，1 9 9 4 ；c h e we ta 1 ，1 9 8 9 ，他们发展的壁细胞原代培养技术对 壁细胞酸分泌过程中相关蛋白的定位以及相关生物学事件的确定具有重要意义。 正是通过壁细胞原代培养，现在已经确定参与壁细胞活化的多个胞内信号传导通 路，涉及p k a ( p r o t e i nk i n a s ea ) ，p k c ( p r o t e i nk i n a s ec ) ，钙调蛋白( c a m ) 激酶i i ，磷脂酰肌醇3 一激酶( p 1 3k i n a s e ) 以及几个其它的下游激酶。胃酸分泌 的体外刺激信号中，组胺刺激是最有潜力的一条活化通路。虽然体外实验中发现 胆碱及胃泌素亦可刺激胃酸分泌，但是对于许多物种来说，这种刺激的体内实验 强度大大减小，可能的原因是体内的壁细胞与释放组胺的肠嗜铬细胞样细胞 ( e n t e r o c h r o m a f f i n 1 i k ec e l l ) 联系紧密 p r i n ze ta 1 ，1 9 9 9 。但狗的壁细胞是一 个例外，其对胆碱能的刺激比对组胺的刺激更为敏感。 1 胃酸分泌过程中p k a 的活化是一条主要的信号通路 大约在5 0 年前，r o t h 与i v y 证实了c a m p 作为胞内信使参与调节胃中h c l 的分泌。c h e w 等利用分离的胃腺发现组胺可提高胞p 勺c a m p 水平，同时可以导 致p k a 的活化，尤其是依赖于c a m p 的蛋白激酶i 型的活化。活化的p k a 可以 通过激活其下游效应物而引发一系列磷酸化事件。这些磷酸化事件最终导致了壁 细胞中细胞膜和细胞骨架的重组，并增加了胃表皮细胞膜处的电子传递 c h e w ， 1 9 8 3 ；c h e w ，1 9 8 5 。二十世纪八十年代，几个研究小组相继报道了刺激相关的 壁细胞中一些蛋白的磷酸化，这些蛋白大多数只是通过分子量的不同而被分离鉴 定出来。在寻找组胺刺激过程中产生的磷酸化蛋白时，u r u s h i d a n i 等分离出了一 个8 0 k d a 的外周膜蛋白，后来被鉴定为细胞膜和细胞骨架的联结蛋白一e z r i n - u r u s h i d a n ie ta 1 ，1 9 8 9 ；h a n z e le ta 1 ，1 9 8 9 ；h a n z e le ta 1 ，1 9 9 1 。随后，他们又 分离到了一个参与c l _ 和水分子运输的蛋白，这一蛋白现在称为p a r c h o r i n 。此外， c h e w 及其同事根据分子量的大小，也分离到了几个和刺激有关的磷酸化蛋白， 包括4 0 一k d a 的l a s p 1 ，6 6 一k d a 的c o r o n i n s e 以及2 8 k d a 的c s p p 2 8 。其中 c s p p 2 8 是一个钙敏感的磷酸化蛋白 c h e w ，1 9 8 7 ；b r o w ne ta l1 9 8 9 ；p a r e n t ee t 中国科学技术大学博士学位论文 a 1 ，1 9 9 6 ；p a r e n t ee ta 1 ，1 9 9 9 。 早期对酸分泌相关的信号传导过程的研究是在完整的胃腺中进行的。细胞质 膜作为一道屏障将胞内环境与胞外环境分开，所以可穿透的壁细胞模型的建立非 常重要，利用它可更直接地对细胞质进行操作。早期几种可穿透的壁细胞模型都 是利用电穿孔以及洋地黄皂苷( d i g i t o n i n ) 来穿透胃腺。这些模型提供了许多有 用信息，但是这些壁细胞穿透模型不能通过添加促分泌素或者c a m p 将壁细胞 从静息状态转化为刺激状态。直至l j y a o 等利用一种从葡萄球菌中分离出的a 毒 素作为穿透剂，这一问题才得以解决 y a 0e ta 1 ，1 9 9 6 - 1 。在仪一毒素穿透的胃腺 模型中可以通过c a m p 引发壁细胞从静息期到刺激期的转化以及刺激伴随的许 多蛋白质的磷酸化。o 【毒素在壁细胞上产生的孔径约为3n l t l ，只允许象核苷酸 一样的小分子通过。因此0 【毒素模型在代谢过程研究以及刺激相关的蛋白质磷 酸化研究中非常有用，但是大分子的进入依然需要活化的壁细胞完成一系列生化 重组过程。为了使分子量较大的肽段及蛋白质分子能进入壁细胞，同时在添加 c a m p 时，壁细胞还可从静息期转化为刺激期，研究者又建立了一些新的穿透 模型。其中一个穿透模型就是利用了变性剂1 3 - e s c i n ，研究者利用该模型检验了 许多蛋白激酶如p i c a 、p k c 、肌球蛋白轻链激酶m l c k ( m _ _ y o s i nl i g h tc _ h a i n k i n a s e ) 以及c a m 激酶的抑制肽 a k a g ie ta 1 ，1 9 9 9 ，并确定了壁细胞分泌过 程中p k a 与m l c k 的作用，但没有证实c a m 激酶与p k c 的作用。另外，抑制 a r f ( a d e n o s i n er i b o s y l a t i o nf a c t o r ) 进入b e s c i n 通透性腺体的小肽可以减弱 c a m p 刺激对壁细胞的活化效应，表明a r f 蛋白对壁细胞的酸分泌过程也有一 定的调控作用。 另一个穿透模型是利用链状球菌毒素溶血素s l o ( s t r e p t o _ l y s i n0 ) 来穿透胃 腺。a m m a r 等证明s l o 穿透的胃腺中加入的荧光标记的肌动蛋白可整合到内源 性的f a c t i n 中。他们还检验了几$ 中s y n t a x i n 蛋白家族成员在c a m p 活化的分泌 过程中的作用l a m i n a r e ta 1 ，2 0 0 2 。还有一些穿透模型是以耗竭系统为基础的， 如洋地黄皂苷穿透模型等。为了寻找在c a m p 介导的壁细胞活化过程中起根本 作用的物质，a k a g i 等将脑细胞质及纯化的相应组分加入洋地黄皂苷穿透的胃腺 中进行重组实验 a k a g ie ta 1 ，2 0 0 1 。他们根据氨基比林吸收实验证实脑细胞 质对壁细胞有活化作用，进而他们又发现这种活化作用是磷脂酰肌醇转移蛋白 4 中国科学技术大学博士学位论文 p i t p ( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l t r a n s f e rp r o t e i n ) 起作用的结果。虽然p i t p 是酸分泌 的刺激因子，但是它和依赖于c a m p 的信号传导通路没有联系。这种重组模型 对于进一步鉴定壁细胞活化所必需的关键成分以及寻找p k a 激酶的效应物非常 重要。 l a s p 一1 是从壁细胞中分离出来的和c a m p 介导的酸分泌活化相关的一个4 0 k d a 的磷酸化蛋白质。l a s p 1 是作为一个信号分子被分离的，一旦胰腺、小肠 以及胃粘膜内的c a m p i 水平提高，该蛋白将被磷酸化，并且l a s p 1 可以在表皮 组织内的离子运输细胞( 如胰腺及唾液腺导管的皮层细胞，远曲小管及收集小管 中某些富含f a c t i n 的细胞) 中选择性表达 y a oe ta 1 ，1 9 9 6 ；r o n ge ta 1 ，1 9 9 8 。 l a s p 1 是l i m ( l i n 11 ，! s 1 a n d m e c 3 ) 蛋白超家族一个新成员，其n 端为l i m d o m a i n ，c 端为s h 3d o m a i n ，且还有两个内在的n e b u l i n 重复序列。l a s p 1 很 可能是作为一个接头分子把上游信号传导到下游效应物 c h e we ta 1 ，1 9 9 8 。生 化实验证实l a s p 一1 以磷酸化依赖的方式结合到非肌肉型肌动蛋白微丝，而不是 单体的肌动蛋白。细菌中表达的h i s l a s p l 与f a c t i n 结合的表观k d 为2i x m ，饱 和化学计量关系约为1 ：7 。重组的l a s p 1 被p k a 磷酸化增加t l a s p 1 和f a c t i n 结合的k d ，但降低了b m a x 。兔的l a s p 1 的p k a 磷酸化主要位点在$ 9 9 与s 1 4 6 。 c a m p 刺激依赖的胃腺的免疫荧光结果表明，一旦给予刺激，l a s p 1 将从底膜 转移到顶膜l - c h e we ta 1 ，2 0 0 1 。如果在胃粘膜的纤维原细胞中加入p k c 的活 化齐i j p m a ，将诱导纤维原细胞形成延伸的片状伪足和含有l a s p 1 与f a c t i n 的粘 着斑复合物。在富含f a c t i n 的表皮细胞q b l a s p 1 的磷酸化依赖的调控以及 l a s p 一1 被招募到和动态a c t i n 翻转相关的细胞区域表明这个蛋白在基于细胞骨 架一膜的细胞生物学活性调控过程中起着特定的整合作用。 p a r c h o r i n 最初是通过s d s p a g e 分离的一个和组胺c a m p 刺激引发的胃 酸分泌过程相关的磷酸化蛋白 u m s h i d a n ie ta 1 ，1 9 8 7 - 1 ，p a r c h o r i n 的c d n a 序 列已经被克隆，其分子量为6 5 k d a n i s h i z a w ae ta 1 ，2 0 0 0 - 1 。因为含有异常高比 例的酸性氨基酸，p a r c h o r i n 会在s d s p a g e 胶上出现条带的迁移。p a r c h o r i n 和 氯化物胞内通道c l i c ( 9 1 0 r i d e i n t r a c e l l u l a rc h a n n e l s ) 蛋白家族高度同源，定位 于许多主动运输盐和水分子的表皮组织中，除壁细胞外，p a r c h o r i n 主要分布于 脉络膜丛，唾液腺以及泪腺中。内源性的p a r c h o r i n 主要位于壁细胞的细胞质中， 中国科学技术大学博士学位论文 一旦受到组胺刺激，它又重新定位到顶膜，非常类似于h + ，k + a t p a s e 对刺激的 反应。g f p p a r c h o r i n 在肾细胞中也主要定位于细胞质中，而当c l 一被引发从细胞 质中流出时，g f p p a r c h o r i n 又重新定位到质膜 - u r u s h i d a n ie ta 1 ，1 9 9 9 。 众所周知，组胺是酸分泌级联反应的主要刺激剂，它可以刺激壁细胞中的h 2 受体从而活化和腺苷酸耦联的g s ，诱导c a m p 的产生，进而激活p k a 。两种不 同类型的p k a ( i 型与i i 型) 具有不同的调节亚基( ri 与ri i ) 。i 型p k a 主 要存在于胞质，而i i 型p k a 主要和细胞骨架以及细胞膜相联系。1 9 8 5 年，c h e w 报道了组胺刺激活化的壁细胞中的p k ai 型激酶可以被选择性地激活。随后的研 究揭示r i i 的去磷酸化将导致催化亚基释放，这一生化反应发生在c a m p 通路所 引起的刺激过程中。这表明i i 型p k a 对胃酸分泌也有调节作用。在经常使用的 兔的壁细胞模型中，p k a 是一个主要的活化因子，因为当胞内c a m p 水平增加 到最大程度时，用1 4 c 氨基比林吸收实验发现这时的胃腺或壁细胞的刺激程度达 到了最大。来自实验室以及临床资料也表明h 2 受体抑制剂对胃酸分泌的抑制作 用比胃泌素抑制剂更有效。 2 p k c 信号传导通路在胃酸分泌中的作用 目前关于p k c 在胃酸分泌过程中生理作用的报道意见不一。早期研究认为 佛波酯特异性活化的p k c 可以抑制胃酸分泌 - m u a l l e me ta 1 ，1 9 8 6 - 1 。但在后来 的一些研究中，科学家们发现佛波酯象卡巴可( c a r b a c h 0 1 ) 一样具有微弱的刺 激胃酸分泌的作用 c h e we ta 1 ，1 9 9 7 ；b r o w ne ta 1 ，1 9 8 6 ；c h i b ae ta 1 ，1 9 8 9 ，且 具有d b c a m p 类似的潜在的刺激效果 - b r o w ne ta 1 ，1 9 8 6 - 1 。大量的资料表明在 p k a 活化之前，p k c 的活化对胃酸分泌有抑制作用。佛波酯活化的p k c 减弱 了壁细胞对受体调节的激动剂以及f o r s k o l i n 的反应 b r o w ne ta 1 ，1 9 8 6 ；m u a l l e m e ta 1 ，1 9 8 6 ，但并没有减弱壁细胞对d b c a m p 的反应 b r o w ne ta 1 ，1 9 8 6 ；n a n d i e ta 1 ，1 9 9 4 - 1 。当用药物如h 7 以及r 0 3 1 - - 8 2 2 0 直接抑制p k c 或者用非胆固醇 抗炎药物间接抑n p k c 时，胃酸分泌水平提高。虽然这些实验中可能有从d 细 胞释放的生长激素抑制素参与调控，但p k c 活化的受体下调看来是受体介导的 胃酸分泌抑制最可能的机制。p k c 磷酸化引起受体脱敏并下调的实验结果进一 步支持了上述假说。佛波酯抑锘t j f o r s k o l i n 诱导的酸分泌表明除了腺苷酸环化酶 6 中国科学技术大学博士学位论文 介导外还存在其他的作用位点。磷酸化对腺苷酸环化酶介导活性的调节是一个复 杂的过程。据报道p k c 对腺苷酸环化酶介导的磷酸化的刺激或抑制作用取决于 酶的亚型。可能p k c 的作用位点不是c a m p ，因为c a m p 刺激的反应可被p k c 的抑制剂h 7 增强，u r u s h i d a n i 等还发现结合磷酸化蛋白磷酸化酶抑制剂，佛波 酯可抑制胃酸分泌 u r u s h i d a n ie ta 1 ，1 9 9 6 。 3 胆碱能通路的活化 胆碱能制剂可以作用于毒蕈碱性m 3 受体，提高胞内钙离子水平从而活化壁 细胞。用c a 2 + 敏感的荧光素探针对分离的胃腺进行分析表明，当添加m 3 受体的 激动剂卡巴可后，在4 6s 内胞内钙离子水平会出现一个峰值，达到o 1 5 一o 5g m ， 接下来腺体处于持续泌酸的活化过程，胞内钙离子将会以一个较低的速度持续提 高 c h e we ta 1 ，1 9 8 6 ；c h e w ，1 9 8 6 。促分泌所依赖的胞内钙离子变化源自胞内 的钙离子储备，而是胞外的钙离子，除非胞内钙离子一开始就处于耗竭状态。钙 离子螯合剂b a p t a 可缓冲胞内钙离子的上升，从而阻止卡巴可引发的酸分泌， 但并不影响随后组胺或f o r s k o l i n 对胃壁细胞的刺激。在无钙培养基中，虽然可 通过l a 3 + 敏感通路从胞外对胞内钙离子储备进行补充，但是胞内钙离子储备容 易被胆碱能刺激所耗竭 n e g u l e s c ue ta 1 ，1 9 8 9 。 卡巴可刺激的胞内钙离子水平的上升与壁细胞f f 日i p 3 水平的上升相关 c h e w e ta 1 ，1 9 8 6 - 1 ，因此可认为i p 3 是从m 3 受体到胞内钙离子储备的一个信使。p k c 在胆碱能通路中的作用非常矛盾，尤其在使用p k c 的活化剂如佛波酯时，发现 其对卡巴可或组胺刺激的酸分泌有抑制或活化作用。c h e w 等测量了壁细胞中 p k c 的表达水平，以及胃腺对不同p k c 抑制剂的反应。免疫细胞化学实验表明 壁细胞内p k c 与肌动蛋白微丝的定位相似 c h e we ta 1 ，1 9 9 7 。p k c 活性抑制 剂如r o3 1 - 8 2 2 0 可以加强卡巴可与组胺介导的酸分泌，也可导致细胞骨架相关 蛋f 刍e z r i n 及p p 6 6 ( 后来被鉴定为c o r o n i n s e ) 磷酸化程度的减少。这些数据表明 p k c 在酸分泌过程中有负调节作用，虽然还有一些特殊的p k c 异构酶的作用与 此结论相悖。 t s u n o d a 等的研究结果证明了钙调蛋白激酶在基于胆碱能通路的壁细胞活 化过程的中的作用 t s u n o d ae ta 1 ，1 9 9 2 ，他们发现钙调蛋白激酶i i 的药物学抑 中国科学技术大学博士学位论文 制剂k n 6 2 抑制卡巴可介导的酸分泌，但并不改变由卡巴可引起的细胞质中钙 离子水平的上升。k n 一6 2 不影响组胺或者f o r s k o l i n 对胃壁细胞的刺激反应 m a m i y a e ta 1 ，1 9 9 3 。酶学分析实验证实了胃壁细胞中存在钙调蛋白激酶i i t s u n o d ae ta 1 ，1 9 9 2 。 c s p p 2 8 是一个2 8 k o a 的对钙离子敏感的磷酸化蛋白，该蛋白最初的分离 鉴定是基于它和胆碱能刺激相联系的磷酸化 p a r e n t ee ta 1 ，1 9 9 6 。在完整的壁 细胞中胆碱能活化剂卡巴可及钙离子载体i o n o m y c i n 可快速磷酸化c s p p 2 8 。后 来的实验证实重组的c s p p 2 8 能以钙钙调蛋白依赖的方式被壁细胞匀浆液或者 纯化的钙调蛋白激酶i i 磷酸化 m a i i n o w s k ae ta 1 ，1 9 8 1 。尽管c s p p 2 8 与钙调 节的磷酸化紧密相关，但阐明钙调蛋白激酶介导的对c s p p 2 8 磷酸化的分子机理 并确定c s p p 2 8 磷酸化修饰在壁细胞活化过程中的功能有着十分重要的意义。 早期的研究证实在狗的壁细胞中卡巴可通过钙离子及依赖于p k c 的通路诱 导i k b 的激酶活性。i k b 激酶是活化n f 1 ( b ( n f k b 是一个重要的转录因子，也 是调节炎症反应的一个主要调节蛋白) 的信号级联反应中的一个关键成分 d i d o n a t oe ta 1 ，1 9 9 7 ；m e r c u r i oe ta 1 ，1 9 9 7 。卡巴可也是几个蛋白激酶家族的 主要诱导剂，这些激酶包括有丝分裂原活化的蛋白激酶m a p k ( m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ) 、胞外信号调节的蛋白激酶e r k s 和c j u n 的n 端蛋白激酶 ( k s ) 。这些激酶都是细胞调控生长、分化以及分泌功能的基本信号成分 c o b b e t a l ，1 9 9 5 ；d a v i se ta 1 ，1 9 9 3 ；t r e i s m a nr ，1 9 9 5 ，但是这些激酶在酸分泌过程中 的作用还不清楚，因为不同激酶的特异性抑制剂可能同时具有抑制或增强效应。 例如，m a p k 蛋白激酶家族的一个成员p 3 8 对卡巴可的刺激反应有明显的上调 作用，其抑$ | j 齐u s b 2 0 3 5 8 0 却可以抑制这种作用。但是在完整的狗壁细胞中，卡 巴可诱导的氨基比林吸收可以被s b 2 0 3 5 8 0 增强好几倍，这暗示p 3 8 激酶活性对 酸分泌具有抑制作用 p a u s a w a s d ie ta 1 ，2 0 0 0 。总之这些数据证实了胃壁细胞 中活化毒蕈碱性m 3 受体的信号成分之间的相互关系。至于哪一种成分直接参与 壁细胞的活化过程，哪些成分具有调节作用，哪些成分具有活化作用，以及哪些 是下游效应蛋白还有待于进一步研究。 中国科学技术大学博士学位论文 4 e g f 与t g f 仅的调节作用 为了揭示e g f 与t g f a 对胃酸分泌影响的基本机制，c h e w 等研究了这两 个生长因子对直接分离的壁细胞以及原代培养的壁细胞的影响，他们将其分为两 类：一类对组胺以及卡巴可介导的酸分泌有急性抑制作用；另一类可以增强酸分 泌 c h e we ta 1 ，1 9 9 4 。因为发现这两种生长因子对酪氨酸激酶抑制剂有急性反 应与慢性反应两种效果，他们认为e g f 与t g f q 通过多重信号传导通路来调控 壁细胞的功能，并推断一种可溶性的酪氨酸激酶参与调节e g f 的慢性效应，而 通过某种酪氨酸激酶抑制剂介导的组胺刺激导致的胃酸分泌，其急性反应可能不 受酪氨酸激酶相联系的受体调节。这些研究者在进一步研究中发现e g f 通过两 个阶段激活调节胞外信号的蛋白激酶一e r k1 与e r k2 ，第一个峰出现在e g f 刺激后的大约5 分钟，紧接着出现的一个峰持续活化约两个小时 n a k a m u r ae ta 1 ， 1 9 9 6 。与e g f 的作用相反，p k c 的激活剂t p a 诱导e r k1 与e r k2 持续活 化至少两个小时。卡巴可也可以活化e r k1 与e r k2 ，但是反应较弱，而且是单 阶段的。然而，e r k 信号级联通路的调节并不通过胞内自由的钙离子或c a m p 浓度的升高来完成。 t a k e u c h i 等证实了e g f 对分离的狗的壁细胞存在双阶段效应，并验证了 e r k 是胃酸分泌的一个可能的信号调节因子 t a k e u c h ie ta 1 ，1 9 9 7 ；t a k e u c h ie t a 1 ，1 9 9 9 。他们的研究发现卡巴可导致狗壁细胞抽提物e r k2 激酶活性的明显 提高，胃泌素可以中等程度的提高e r k2 激酶活性，而组胺则没有影响。这些 作者得出了与c h e w 研究小组相反的结论，发现对卡巴可刺激的反应依赖于胞内 钙离子水平的提高，并且e r k 的特异性抑制剂p d 9 8 0 5 9 可终止这种刺激反应。 在完整的壁细胞中添加e r k 抑制剂，将导致卡巴可或其它促分泌素刺激的氨基 比林吸收水平的提高，因此e r k 通路在直接激活胃酸分泌这一生理反应中作用 较小。进一步的研究工作认为通过e g f 刺激造成的e r k 活性的提高与h + ，k + 一a t p a s ec c 亚基的表达相偶联，这可解释e r k 的活化将使分泌活性稍微提高， 也可以解释e g f 的长效刺激效应的。而在狗的壁细胞中丝氨酸苏氨酸蛋白激 酶a k t 通过e g f 的活化级联信号通路导致h + , k + - a t p a s e 的表达水平提高可能 是通过另外一种途径起作用 t o d i s c oe ta 1 ，2 0 0 1 。 t s u n o d a 等利用酪氨酸激酶化学抑$ 1 j 齐l j g e n i s t e i n 与e r b s t a t i n 证实它们可将 9 中国科学技术大学博士学位论文 壁细胞从e g f t g f 仪对酸分泌的抑制作用中释放出来 t s u n o d ae