（高分子化学与物理专业论文）胰岛素口服缓释微球的制备与释放性能研究.pdf

a t h e s i s ( o rd i s s e r t a t i o n ) s u b m i t t e d t o s h a a n x iu n i v e r s i t yo fs c i e n c ea n d t e c h n o l o g y r e s i i lp 叭i a lf u l f i l l m e n to f t h er e q u i r e m e n tf o r t h ed e g r e eo f m a s t e rofsci。ence t h e s i s ( o rd i s s e r t a t i o n ) s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r m a y , 2 0 1 0 胰岛素口服缓释微球的制备与释药性能研究 摘要 注射用胰岛素作为治疗糖尿病药物，临床应用已有8 0 多年的历史。但长 期频繁的注射，给患者带来了诸多不便，因此，研究胰岛素的非注射制剂已 成为国内外医药界共同关注的热点。胰岛素粘膜给药制剂是一种很有前景的 胰岛素非注射给药途径，但目前还存在着酶降解和生物利用度不足的问题。 本实验对胰岛素口服缓释给药制剂进行研究，以期望有所突破。 以生物相容性好的新型可降解天然高分子材料丝蛋白羟丙基壳聚 糖复合物为载体，注射用胰岛素为模型药物，探索胰岛素口服缓释微球的制 备工艺、工艺参数与微球性能的关系。在此基础上研究丝蛋白羟丙基壳聚 糖载胰岛素微球在模拟人体介质中的药物释放规律和释放机制，为其应用提 供实验与理论指导。实验现已获得如下进展： ( 1 ) 采用羟丙基壳聚糖包覆胰岛素制备的微球，形态规整，粒径较小且 分布较窄，包埋率较高。根据微球的结构分析，微球的载体材料和目标药物 有一定的相互作用，但作用较弱。微球的稳定性考察结构表明，在室温放置 6 个月内，外形、粒径几乎没有发生变化；人工胃液中4 h 累计释药达到4 6 ， 人工肠液中释放2 4 h 后，释药几乎停止，说明药物释放较快，且不易全部释 放，可能因为羟丙基壳聚糖在体液中溶胀率较大，干燥后留下的孔洞较多， 内部的药物达不到包埋的效果。 ( 2 ) 丝蛋白所制备的微球包埋率较低，不能达到预期的目的。原因分析如 下：丝蛋白和目标药物胰岛素同属蛋白质类物质，混合时他们相互溶解，丝 蛋白不能将药物包裹其内，在微球分出时，外围胰岛素流逝；交联剂戊二醛 可以与丝蛋白交联，也可以与药物胰岛素发生交联，导致被交联的胰岛素变 性，不能被检测出；丝蛋白溶液不是强粘性的溶液，在与药物混合时不能及 时和药物黏在一起，加入交联剂后，散在的药物无法进入微球，也增加药物 的流逝。 ( 3 ) 以复合天然高分子材料丝素和羟丙基壳聚糖为载药材料，复凝聚法 制备了载药微球，所制得的微球表面光滑、密实、规整，平均粒径约2 2 4 岬， 接近正态分布。构成微球的丝蛋白和羟丙基壳聚糖分子间具有氢键和静电吸 引的相互作用，促使复合物结晶程度提高。丝蛋白羟丙基壳聚糖载药微球 的包埋率e e = 7 3 6 ，大于羟丙基壳聚糖载药微球的e e = 6 4 3 及壳聚糖载 药微球的e e = 5 7 1 。丝蛋白羟丙基壳聚糖载药微球在人工胃液中的释药率 为2 1 ，小于羟丙基壳聚糖单凝聚载药微球；在人工肠液中释放速率平稳缓 慢，最大释药率达9 2 2 ，有很好的缓释的作用，交联剂戊二醛用量为0 0 4 m l 时，微球的释药性能较好。 ( 4 ) 影响丝蛋白羟丙基壳聚糖载药微球的体外释药的主要因素有：载体 的材料、交联剂用量、制各时的搅拌速度以及其它制备参数，且各因素间存 在某种交互作用。并且通过控制工艺参数，能实现预期的要求。以丝蛋白 羟丙基壳聚糖复合物为微球载体和本工艺所制各的载胰岛素微球人工胃液 中存在的暴释现象和人工肠液中存在的缓释现象，满足药物开始很快达到治 疗浓度和延长药物释放时间的要求。所以所制备载胰岛素微球具有口服且缓 释的性能。 关键词：羟丙基壳聚糖，胰岛素，丝蛋白，微球，释放机理，性能 h p r e p a r a t i o na n dr e l e a s e p r o p e r t i e so fi n s u l i n o r a l s u s t a i n e dr e l e a s em i c r o s p h e r e s a b s t r a c t i n s u l i ni n je c t i o n sa sat r e a t m e n td r u g sf o rd i a b e t e s ，c l i n i c a la p p l i c a t i o ni s m o r et h a n8 0y e a r s b u tl o n g t e r mf r e q u e n ti n j e c t i o n s ，w h i c hh a sb r o u g h tal o to f i n c o n v e n i e n c ef o r p a t i e n t s , t h e r e f o r e t h e s t u d y o f n o n i n j e c t e di n s u l i n p r e p a r a t i o n sa th o m ea n da b r o a dh a sb e c o m eac o m m o nf o c u so ft h ec h i n e s e m e d i c i n es e c t o r m u c o s a ld e l i v e r yf o r m u l a t i o n so fi n s u l i ni sap r o m i s i n g n o n - i n je c t i n g r o u t e so fa d m i n i s t r a t i o no fi n s u l i n ，h o w e v e rt h e r es t i l le x i s t e n z y m a t i cd e g r a d a t i o n a n db i o a v a i l a b i l i t yo fs h o r t a g e i nt h i s p a p e r , o r a l s u s t a i n e d r e l e a s e d r u gd e l i v e r y o fi n s u l i nf o r m u l a t i o n s t u d y , e x p e c t a b r e a k t h r o u g h w i t h g o o db i o c o m p a t i b i l i t y a n db i o d e g r a d a b l e ，n e wn a t u r a l p o l y m e r m a t e r i a l s ，s i l kp r o t e i na n dh y d r o x y p r o p y lc h i t o s a nc o m p l e xa sac a r r i e r ，i n s u l i n i n j e c t i o na sam o d e ld r u g ，s t u d yp r e p a r a t i o np r o c e s s ，p r o c e s sp a r a m e t e r sa n dt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep e r f o r m a n c eo fm i c r o s p h e r eo fo r a ls u s t a i n e d - r e l e a s e i n s u l i nm i c r o s p h e r e s o nt h i sb a s i s ，s t u d yt h es i l kf i b r o i n h y d r o x y p r o p y l c h i t o s a nc o m p o s i t em i c r o s p h e r e sl o a d e di n s u l i n ，d r u gr e l e a s el a w sa n dr e l e a s e m e c h a n i s mo fb i o k i n e t i c si nas i m u l a t e dh u m a nb o d ym e d i a ，f o ri t sa p p l i c a t i o n s o f e x p e r i m e n t a la n dt h e o r e t i c a lg u i d a n c e t h er e s u l t sa sf a l l o w s ： ( 1 ) w ep r e p a r e dm i c r o s p h e r e su s i n gh y d r o x y p r o p y lc h i t o s a nc o a t e di n s u l i n ， s h a p ew a r p i n g ，p a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o no fs m a l la n dn a r r o w , e m b e d d i n gh i g h e r a c c o r d i n gt os t r u c t u r a la n a l y s i so fm i c r o s p h e r e ，t h e r ei s al i t t l ei n t e r a c t i o n s b e t w e e nm i c r o s p h e r ec a r r i e rm a t e r i a la n do b je c t i v ed r u g s ，b u tv e r yw e a k m i c r o s p h e r e s s h a p ea n ds i z el i t t l ec h a n g e df o r6m o n t h s ；4 h c u m u l a t i v ed r u g r e l e a s et or e a c h 4 6 i na r t i f i c i a lg a s t r i ci u i c e ，a f t e r2 4 hr e l e a s ei na r t i f i c i a l i n t e s t i n a lf l u i d ，a l m o s ts t o p p e d ，i ti n d i c a t i n gd r u gr e l e a s ef a s t e r , a n dn o te a s y r e l e a s eo fa l l ，p r o b a b l yb e c a u s eo fs w e l l i n gi nb o d yf l u i d sh y d r o x y p r o p y lr a t e g r e a t e rd r yh o l e si e r m o r ee m b e d d e dw i t h i nt h er e a c ho f d r u g e f f e c t i i i ( 2 ) m i c r o s p h e r e sp r e p a r e db ys i l kf i b r o i ne m b e d d i n g r a t el o wa n dc a l ln o t a c h i e v et h ei n t e n d e dp u r p o s e r e a s o n sa r ea sf o l l o w s ：s i l kf i b r o i na n do b j e c t i v e s d r u go f t h ei n s u l i ns u b s t a n c e sa l lb e l o n gt op r o t e i n ，m i x e dw i t he a c ho t h e rw h e n t h e ya r ed i s s o l v e d ，d r u g sc a nn o tb ew r a p p e di n s u l i ni d es i l kf i b r o i n ，w h e n s e p a r a t i o n ，t h ep e r i p h e r a l i n s u l i n p a s s e s ；c r o s s l i n k i n ga g e n tg l u t a r a l d e h y d e c r o s s l i n k i n g t h es h e l lm a t e r i a lc a nb es i l k f i b r o i n ，y o uc a n a l s oo c c u r c r o s s l i n k e dw i t hd r u g si n s u l i n ，l e a d i n gt od e g e n e r a t i o no fi n s u l i nc r o s s l i n k e d w h i c hc a r ln o tb ed e t e c t e d ；s i l kp r o t e i ns o l u t i o ni sn o tas t r o n gv i s c o s i t ys o l u t i o n ， e a r ln o tb es t i c k e dt o g e t h e ri nt i m ew i t ht h e d r u g s w h e nm i x e da n d m e d i c i n e s w h e nj o i n e dt h ec r o s s l i n k i n ga g e n t ，t h ed r u gc a nn o tb es c a t t e r e di n t o t h em i c r o s p h e r e s ，a n di n c r e a s e dt h ed r u g sp a s s a g e ( 3 ) u s i n gc o m p o s i t ep o l y m e rm a t e r i a l s ，n a t u r a l s i l kf i b r o i na n d h y d r o x y p r o p y l c h i t o s a na s d r u g - l o a d e dm a t e r i a l ，r e u n i t e w a s p r e p a r e d d r u g l o a d e dm i c r o s p h e r e s ，w h i c hw e r es m o o t h ，d e n s ea n ds t r u c t u r e d ，w i t ha n a v e r a g ep a r t i c l es i z eo fa b o u t2 2 4 p m ，c l o s et on o r m a ld i s t r i b u t i o n t h e r ei s h y d r o g e nb o n d sa n de l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o ni n t e r a c t i o nb e t w e e nt h es i l kf i b r o i n m i c r o s p h e r e sa n dh y d r o x y p r o p y lc h i t o s a nm o l e c u l e s ，p r o m p t e dc r y s t a l l i n eo f c o m p l e x e sh i g h e rl e v e l s ；t h es i l kf i b r o i n - - h y d r o x y p r o p y lc h i t o s a nd r u g - - l o a d e d m i c r o s p h e r e se n t r a p m e n te e = 7 3 6 ，g r e a t e rt h a n h p c sd r u g l o a d e d m i c r o s p h e r e se e = 6 4 3 a n dt h ed r u g - l o a d e dc h i t o s a nm i c r o s p h e r e se e = 5 7 1 s i l kf i b r o i n h y d r o x y p r o p y lc h i t o s a nd r u g l o a d e dm i c r o s p h e r e si n s i m u l a t e dg a s t r i cf l u i di f lt h er e l e a s er a t eo f21 ，l e s st h a nas i n g l ep o o lo f d r u g l o a d e dh y d r o x y p r o p y lc h i t o s a nm i c r o s p h e r e s ；r e l e a s er a t e i na r t i f i c i a l i n t e s t i n a lf l u i di ss l o w , m a x i m u mr e l e a s er a t eo f9 2 2 ，t h e r ei sag o o dr e l e a s e o ft h er o l eo f c r o s s l i n k i n ga g e n tg l u t a r a l d e h y d e o 0 4 m l d o s a g e ，t h e m i c r o s p h e r e sr e l e a s eb e t t e rp e r f o r m a n c e ( 4 ) t h em a i nf a c t o r so fa f f e c ts i l kf i b r o i n h y d r o x y p r o p y lc h i t o s a n d r u g l o a d e dm i c r o s p h e r e si nv i t r or e l e a s ea r em a n y , w h i c ha r ec a r r i e rm a t e r i a l ， a m o u n to fc r o s s l i n k e r a g e n t ，t h es t i r r i n gs p e e dw h e np r e p a r e d ，a n do t h e r p r e p a r a t i o np a r a m e t e r s ，b e t w e e nt h ev a r i o u sf a c t o r st h e r ew a ss o m ei n t e r a c t i o n a n db yc o n t r o l l i n gt h e p r o c e s sp a r a m e t e r s ，w e c a r la c h i e v et h ee x p e c t e d r e q u i r e m e n t s w i t h s i l k p r o t e i n h y d r o x y p r o p y l c h i t o s a n c o m p l e x f o rt h e m i c r o s p h e r e sp r e p a r e db yc a r r i e r s a n dt h ep r o c e s s c o n t a i n i n g t h ei n s u l i n i v m i c r o s p h e r e sv i o l e n c et h a te x i s ti na r t i f i c i a lg a s t r i cj u i c ea n d a r t i f i c i a li n t e s t i n a l f l u i dr e l e a s ep h e n o m e n at h a te x i s ti ns l o w - r e l e a s ep h e n o m e n o n , t om e e tt h ed r u g b e g a nt or a p i d l ya c h i e v et h e r a p e u t i cc o n c e n t r a t i o n sa n de x t e n d e dd r u gr e l e a s e t i m er e q u i r e m e n t s t h e r e f o r e ，t h ep r e p a r e dm i c r o s p h e r e sc o n t a i n i n gi n s u l i na n d w i t ho r a ls u s t a i n e d - r e l e a s ep e r f o r m a n c e 一 k e y w o r d s ：h y d r o x y p r o p y lc h i t o s a n ，i n s u l i n ，s i l kf i b r o i n ，m i c r o s p h e r e s ，r e l e a s e m e c h a n i s m ，p e r f o r m a n c e v 目录 摘要i a b s t ra c t i l 者论l 1 1 常用的药物载体材料1 ，1 1 1 合成高分子1 1 1 2 半合成高分子1 1 1 3 天然高分子1 1 2 丝蛋白简介2 1 2 1 丝蛋白的结构和性能。2 1 2 2 丝蛋白的应用3 1 3 羟丙基壳聚糖简介5 1 3 1 甲壳素和壳聚糖5 1 3 2 羟丙基壳聚糖的制备方法6 1 3 3 羟丙基壳聚糖的应用8 1 4 非注射胰岛素给药途径的研究进展9 1 4 1 口腔给药系统：9 1 4 2 透皮给药系统1 0 1 4 3 直肠给药制剂11 1 5 本研究的目的及意义1 2 1 6 本研究的主要内容。1 3 2 羟丙基壳聚糖及其微球的制备和性能研究1 4 2 1 实验方法。1 4 2 1 1 实验仪器和试剂1 4 2 1 2 羟丙基壳聚糖制备方法1 4 2 1 3 羟丙基壳聚糖胰岛素微球的制备15 2 1 4 羟丙基壳聚糖胰岛素微球包埋率的测定1 5 2 2 结果与讨论1 5 2 2 1 羟丙基壳聚糖制各条件的确定15 2 2 2 羟丙基壳聚糖的物理性质1 6 2 2 3 羟丙基壳聚糖的定性鉴定和结构表征1 6 2 2 4 微球制备条件的确定1 7 2 2 5 微球的性能1 9 2 2 6 微球的稳定性及释放速率考察2 1 2 3 本章小结。j 2 4 3 丝蛋白溶液的制备及用于制备微球的探索2 6 3 1 实验方法2 6 3 1 1 实验材料、试剂和仪器：2 6 3 1 2 丝蛋白溶液的制备2 7 3 1 3 丝蛋白微球的制备2 7 3 1 4 微球包埋率的测定2 7 3 2 结果与讨论2 7 3 2 1 丝素分子量范围的分析2 7 3 2 2 丝蛋白液的盐离子浓度。2 7 3 2 3 丝蛋白的氨基酸分析2 8 3 2 4 微球制备条件的确定2 9 3 2 5 微球的表面观察31 3 2 6 微球的包埋率3 2 3 3 本章小绦3 2 4 丝蛋白羟丙基壳聚糖微球的制备及释放性能研究3 3 4 1 实验方法3 3 4 1 1 原料和仪器3 3 4 1 2 羟丙基壳聚糖的制备3 3 4 1 3 丝蛋白溶液的制备3 3 4 1 4 丝蛋白羟丙基壳聚糖载药微球的制备3 4 4 2 结果与讨论3 4 4 2 1 微球的结构表征3 4 4 2 2 微球的形貌观察和粒径3 5 4 2 3 丝蛋白羟丙基壳聚糖载药微球的体外释药研究方法3 6 4 2 4 释药影响因素3 7 4 3 本章小结4 1 5 结论4 2 致谢4 3 参考文献4 4 攻读学位期间发表的学术论文目录：5 1 i i 原创性声明及关于学位论文使用授权的声明5 2 l i i 胰岛素口服缓释微球的制备以及释放性能研究 1 绪论 二十一世纪，人类的科学技术水平不断提高，随着基因技术和生物学的发展，人体 多肽类药物、内源性蛋白质生产也随着现代生物技术的发展而不断发展，现代生物技术 主要包括：发酵工程、细胞工程、基因工程、酶工程等。愈来愈多的多肽类药及蛋白质 的种类也随着科技水平的进步逐渐增爹- 】。 目前，我们用到的蛋白质及多肽类药物，比较原始的给药方式为静脉注射。这类给 药方式存在一个缺点：即在人体内，为了克服蛋白质及多肽类药物半衰期较短的缺点， 需要提高人体对这类药物的注射频率，这会给人们带来极大地痛苦，导致该方法使用不 便。我们需要延长多肽和蛋白质类药物在人体内的释放周期( 即循环半衰期) ，使此类药 物在人体内缓慢释放，以保证作用持久，药效相应提高。所以，人们逐渐将重点放在了 以脂质体、微囊或微球为基础的微包埋技术上【2 7 】。下面将围绕载药材料的性质、目标药 物给药途径、释放性能等话题对国内外研究动向进行简单介绍。 1 1 常用的药物载体材料 微球可以定义为：直径范围在纳米至微米级之间的，其表面能够吸附多孔性的、有 化学反应活性的、或其他功能的基团的球型颗粒。微球制剂拥有很多优点，其中最重要 的一点是可以将血药浓度控制在合理的范围，使药效稳定、持久，药物毒副作用减少， 因此，微球可以用作多肽类、蛋白质药物载体 s - 9 。 目前，较为常用的载体材料主要有合成高分子、半合成高分子及天然高分子等阻1 6 】。 1 1 1 合成高分子 。 合成高分子材料作为载体，可以分为不可生物降解的和可生物降解的两类。近几年， 在合成高分子材料的应用方面，人们越来越重视可生物降解同时能够生物吸收的。具备 上述条件的材料有：羧甲基葡聚糖、聚碳酸、聚氰基丙烯酸烷酸、聚乳酸、聚氨基酸、 聚乳酸一聚7 , - 醇嵌段共聚物、乙交醋丙交醋共聚物及聚合酸酐等。这类材料具有化学 稳定性较高、低毒、成球性较好等优点。 1 1 2 半合成高分子 半合成高分子材料作为载体，制备成的微球一般是纤维素的衍生物，具体包括：唬 琅酸醋酸纤维素、梭甲基纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、丁酸醋酸纤维 素、羟丙甲基纤维素、甲基纤维素等。这类材料的优点是：成盐后溶解度比较大，粘度 较大，毒性较小，极易发生水解反应。 1 1 3 天然高分子 天然高分子材料也可以用于制备我们所需要的微球载体材料及膜材料，其种类有： 丝蛋白、阿拉伯胶、壳聚糖、海藻酸盐、明胶、淀粉等，这类材料的优点是：无毒副作 陕西科技大学硕士学位论文 用，来源广泛，性质比较稳定，能够生物降解，价格低廉，成膜性能和成球性能好，生 物相容性能好。 1 2 丝蛋白简介 丝蛋白( 也叫做丝心) 来源于蚕丝，是蚕丝的主要成分，是具备结晶结构的种蛋 白质m 。在组成丝蛋白的近2 0 种氨基酸中，人体所必需的8 种氨基酸约占7 的比例。丝 蛋白中，非极性侧基所占比例约为7 0 5 ，极性侧基所占比例约为2 9 5 ，极性侧基与非 极性侧基比值为0 4 2 。丝胶作为蚕丝中的另外一种重要成分，与丝蛋白差别较大，它具 有较好的水溶性能，而丝蛋白的水溶性能与之相比稍差。丝蛋白中的侧基主要是简单的 丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸等，这三种氨基酸占到了所含氨基酸总数的8 5 ，三者比值为 1 ：3 ：4 ( 摩尔比) ，并且可以按照一定的顺序排列形成具有规则结构的链段。这些链段存 在于丝蛋白的结晶区域，而存在于非结晶区域的则是有较大侧基的色氨酸、苯丙氨酸等。 丝蛋白中蛋白的构象除少量仅螺旋、p 转角等构象外，主要构象是以无规则线团状存在， 丝蛋白不溶于乙醇，亦不溶于水，但在水中易发生膨胀，其分子量约在3 6 x 1 0 5 - 3 7 x 1 0 5 1 8 1 之间。 1 2 1 丝蛋白的结构和性能 一直以来，人们认为丝蛋白分子的端基为g l y ，其结构主体是一根长分子链，它是按 照氨基酸排列顺序的重复构造而成的，例如：a - g l y a i a - g i y - x ( 其中，x 是其他的氨基酸 残基) 。近些年，随着人们对丝蛋白分子生物学研究的逐渐深入，发现丝蛋白的结构是由 两个大小不同的多肽链组成，大的叫重链，小的叫轻链，即h 链和l 链。交互排列的非结 晶区和结晶区段逐渐形成了h 链的构造，h 链结构中有2 个亲水的c y s 残基团，而l 链中也 存在亲水基i 圃c y s 残基，两者所拥有的c y s 残基通过极性基团的相互作用而越来越近，并 且，最后组合在一起【1 9 】。在一定的条件下，丝蛋白分子存在的两种结构( p 折叠结构和 无规则卷曲结构) 会发生相互转变，其形态也以可以相互转化的粉状、凝胶状、纤维状、 膜状等存在。 丝蛋白不溶于水，也不溶于有机溶剂( 乙醚、乙醇等) ，但丝蛋白与水溶液接触会 发生作用。蛋白质都会吸收一定的水分而发生膨胀作用，膨胀的程度约在3 0 - 4 0 ，作 为蛋白质的一种，丝蛋白与水接触，同样也会吸收一定的水分而膨胀；另外，丝蛋白能 够在几分钟完全熔化在一些钙和锌的强酸盐溶液中( 硫酸盐、硝酸盐、氯化盐) ，而在 硝酸钠、氯化钠等中性盐的稀溶液中，也能产生像水一样的膨胀作用。在另一些盐的浓 热溶液中，几分钟内就完全熔化1 2 0 1 。 丝蛋白经过水解后产生的中间产物为丝肽，丝蛋白水解通常有酶法、酸法以及碱法。 一般，我们都采用这些方法得到丝肽。丝肽中所含有的氨基酸成分近似与丝蛋白，都是 以s e t 、c l y 、t r y 、鲇a 四种氨基酸为主，s e r 、c l y 、t r y 、a l a 这些氨基酸总量与所有氨基 2 酸相比，占到约8 8 4 ，这基本代表了丝蛋白分子中氨基酸的构成，丝蛋白分子构象主 要是以无序疏松非晶结构和无规则卷曲结构为主。 人体中所必需的氨基酸总共有八种，丝肽中除包含其他多种氨基酸外，还几乎含有 全部的上述八种氨基酸，这八种氨基酸约占氨基酸总量的1 5 。并且，丝肽在水中溶解 度很大，因此，人体容易吸收。 丝肽分子量范围约在3 0 0 2 0 0 0 ，分布较为广泛，由于丝肽多肽链的长度较短，而丝 蛋白多肽链要比它长，因此，丝肽的分子量也相应的比丝蛋白小很多。不同分子量的丝 肽可以通过控制蚕丝的水解过程获得。分子量在2 0 0 0 以下的，都具有良好的水溶性能， 而当丝肽分子量达到最高范围( 垄4 1 4 0 0 0 。5 0 0 0 ) ，其分子都是以聚合物的形态出现，这类 丝肽分子极难溶于水，而且放置的稳定性也变差。另外，当丝肽得平均分子量在1 0 0 0 以 下时，便可以直接食用，并且味道可1 2 1 ，当丝肽分子质量范围处在1 0 0 0 5 0 0 0 ，则具备了 很好的溶解性、分散性和保湿性，所以，他可用于冰淇淋中，使冰淇淋具有良好的保香 性、持泡性和起泡性，并使味道可口【2 l 】。 当丝肽纯度很高时，其在冷水中的溶解度也很大；而丝蛋白却不能溶解在水中，只 和水发生膨胀作用，这主要是因为丝蛋白和丝肽的分子构象不同造成的。通过原子光谱 分析，我们发现丝蛋白分子的构象主要以反平行的p 一折叠形式存在的，而丝肽分子主要 是以无规则卷曲结构形式存在的。导致两者构象不同的原因是在制备丝肽的过程中，需 要将丝蛋白用强极性的浓盐溶液溶解，在溶解丝蛋白过程发生的同时，数量较多的强极 性离子使其发生强烈的水化作用，无论是非晶区还是晶区都有水分子的介入，多肽链间 的作用力( 主要是范德华力) 逐渐削弱，部分丝蛋白大分子的多肽链在溶剂化的作用下 还能断裂，丝蛋白在这些强极性的浓溶液的作用下，无限膨胀而导致溶液变为粘稠状。 丝蛋白聚集态结晶结构排列紧密有序，但由于以上作用受到破坏，使丝蛋白变成了疏松 无序排列的非晶结构。 1 2 2 丝蛋白的应用 a 丝蛋白在医药方面的应用 丝蛋白在医药方面的最早应用是在手术缝线产品上。八十年代后期，人们发现用丝 蛋白可以制得对皮肤无毒，无刺激，且有营养作用的化妆品，因而，原料为丝蛋白的丝 蛋白膜也同样具备化妆品所具有的性质。蛋白膜的制备方法是在p v c 薄膜浇丝蛋白水溶 液，在一定的条件下，便制得了优质丝蛋白膜，它具有以下优点：对水蒸气和氧气的透 过性能良好，而细菌不能透过该膜，另外，它能够很好的与细胞吸附，并且细胞在膜上 具有较强的增殖能力。如果在丝蛋白中在加入其他成分，如丙烯酸等物质，进行接枝共 聚反应后，所得到的聚合物具有很强的吸水能力。将丝蛋白与其他天然高分子材料复合 或者将丝蛋白进行恰当的处理，则可制得具有湿润强度、伸缩性和柔软性等特性的丝蛋 陕西科技大学硕士学位论文 白膜，因此，丝蛋白膜正被应用在人造皮肤的研制过程中。丝蛋白在人造皮肤领域的研 究，在我国已有突破性进展，有报道已经以动物为试验品开始了人造皮肤的研究。还有 报道，日本制得的丝蛋白膜能够自动诊断癌症，此系统进行诊断的原理是通过测定细胞 所释放出的氧的数量来确定的。另外，水解后的丝蛋白，对高血脂和高胆固醇等症状都 有很好的控制作用1 2 2 - 2 4 。 b 丝蛋白在生物技术上的应用 丝蛋白在生物技术领域应用也非常广泛，可制备成生物传感器，也可用作固定化酶 的载体。通过化学、物理或生物方法将酶固定在特定载体上( 此时的酶有很高的催化活 性) ，这一过程简称生物酶的固定化。固定化的酶很容易与底物或反应物分离，可以回收 反复利用，与游离酶相比，固定化的酶对酸、碱和热的稳定性都相应地提高了。而且， 蚕丝中所含有的蛋白质是分子量较高的天然蛋白质，分子结构独特、机械性能优良、保 温和吸湿性能良好，还具有抗微生物活性的性能，所以丝蛋白可以作为较好的酶固定化 载体材料，在生化、医疗、发酵和化学分析等领域的应用较为广泛。另外，丝蛋白固定 化酶可以制成具有生物特性的酶电极，用于检查体液中代谢物质( 葡萄糖、脂肪酸，氨 基酸等) 浓度。如用于葡萄糖含量测定的固定化葡萄糖氧化酶与氧电极组成的酶电极， 就是通过酶膜两侧体液中的葡萄糖酸与葡萄糖氧化酶发生反应，再由氧电极，测定氧的 减少量，从而可以计算出葡萄糖的含量1 2 5 。丝蛋白酶传感器是我国学者研究的方向，并 取得了可喜的成就。它由敏感元件和换能器构成，将具有生物活性物质的材料用做敏感 元件，配以相应的换能器所构成的分析系统。其作用原理为：经扩散作用，待测样品进 入固定化生物敏感膜，发生生物学反应，再经由敏感器的分子识别，产生的生物信号被 转变成可定量处理的电信号，再经二次仪表放大输出从而获得待测样品含量的信息。丝 蛋白膜作为一种优良的酶固定化载体材料，它的优点在于只需通过物理作用或化学处理， 不需要任何化学交联剂，例如改变反应溶剂、温度、介质p h 值、材料的拉伸强度等就可 以完成。因此，它扩大了酶活性的p h 范围，减少了反应过程中酶的失活，提高了酶的利 用效率。丝蛋白酶传感器是生物传感器中研究和应用最多的，且丝蛋白膜相当稳定性， 具有一定的强度和弹性。 丝蛋白膜不但可以用于酶传感器的制备，也可以用于神经系统传感器和免疫传感器 的制备。虽然酶生物传感器多数采用高分子材料制备，但是，丝蛋白作为一种固定制备 酶的材料，最为突出的优点在于：酶从溶于水的s i l k i 结构逐渐转变为性能稳定的不溶于 水的s i l k i i 结构，而不用加入其它因素( 交联剂、溶剂、温度等) 就可以发生该转变， 这就是酶的固定化。f u k u i 等人首次发现发生d 葡萄糖昔酶的固定化作用的蚕丝蛋白，从 上世纪八十年代末期起，a s a k u r a 等人首先开始了采用丝蛋白固定葡萄糖氧化酶 2 6 】的研 究。在九十年代初期，他们开始酶的固定化研究，研究中所采用的丝蛋白是从活性的蚕 4 胰岛素口服缓释微球的制备以及释放性能研究 腺体中得到，研究制得了酶电极【2 刀和葡萄糖生物传感器嘲。日本针纺公司还研制出一种 丝蛋白膜，可用于固定抗体，所制得的免疫传感器已经应用于癌症的临床诊断：我国张 雨青等人研制的丝蛋白膜同样可以固定化氧化酶；徐新颜等研制成功的丝蛋白膜可以固 定化青霉素酞化酶及葡萄糖氧化酶等。 c 丝蛋白在美化环境方面的应用 塑料的主要成分是高分子材料，他的废弃物严重地污染了环境。酶、紫外线和微生 物等因素极易破坏主要成分是纤维状蛋白质的蚕丝嘲。所以，人们越来越重视采用高分 子塑料的替代品来降低环境污染，即以层压丝蛋白膜替代高分子塑料。日本工业技术院 工业技术研究所，以丝蛋白溶液为原料，制作出了丝蛋白薄板，经过干燥、数片重叠压 缩等工艺，制成了可以替代材料。 1 3 羟丙基壳聚糖简介 1 3 1 甲壳素和壳聚糖 甲壳素广泛存在于动物界( 昆虫的外壳及蟹、蚌等甲壳类动物) 、微生物界( 木耳等 菌类的细胞壁) 、植物界( 藻类) ，它的主要成分是天然氨基多糖高分子化合物。继纤 维素之后，甲壳素是又一类天然可再生资源【，o 】。它的储量在海洋生物中特别丰富，并且 很容易获得【3 l 】。 甲壳素通过脱去乙酰基的作用，得到壳聚糖，根据不同的制各工艺，其乙酰基的脱 除程度为6 0 1 0 0 。壳聚糖拥有许多独特的药理、生理功能和理化性质，而且其分子中 含有能够与酸性介质中的质子相结合的游离氨基。人体所必需的生命要素除维生素、脂 肪、蛋白质、矿物质