（细胞生物学专业论文）hspa5在斑马鱼早期胚胎发育中的作用.pdf

四川师范大学硕士学位论文 h s p a 5 在斑马鱼早期胚胎发育中的作用 细胞生物学专业 研究生孟蛛指导教师马丹炜。孟安明 卸a 5 为脚7 0 家族的成员，它可以作为分子伴侣促进新合成蛋白质的折 叠、组装及其跨过内质网膜的转运；使应激变性的可溶性蛋白质重新折叠；通 过调节蛋白激酶或转录因子的活性而控审! i f 言号转导途径。在小鼠的早期胚胎发 育中，三印西能保护内细胞团，阻止其凋亡本文主要研究了斑马鱼删基 因的表达模式及其调控，以及它在早期胚胎发育中的作用。结果表明，硒芦西 m r n a 在卵子中就存在，是个母源基因；其合子基因的表达开始于原肠中期 的下胚层，在体节期发生在脊索和孵化腺中在热刺激的条件下胚胎中飓p 酊 的表达明显增强，从而起到保护细胞的作用；抑制胚胎中- s p a 5 m r n a 的翻译 可导致该基因的转录水平增高，表明存在反馈调控机制。尽管在胚胎中过量表 达肠硝对胚胎发育没有明显影响，但是利用反义吗啉环寡核苷酸抑制胚胎中 伍p 西的表达会导致胚胎外包变得缓慢，2 4 h p f 出现尾部变细或卷曲、缺少腹鳍 等背部化的表型，同时母c 和棚等背部标记基因的表达增强，但e v e 等腹部 标记基因的表达减弱。这些结果说明，王劬西不仅对胚胎的外包过程起一定作 用，而且可以抑制背部组织的发育。进步研究发现，抑制肠p 叮的表达能够 挽救砌够历过量表达所导致的胚胎腹部化，b m p 2 b 的过量表达可使阻断忍p 西 表达所引起的背部化表型减弱，提示王印西在胚眙背腹分化方面的作用可能与 b m p 信号相关。相关的详细机理还有待深入研究。 关键词：斑马台、热刺激、h 唾，a 5 基因、背腹分化、b 印信号 h s 阻5 在斑马鱼胚胎发育中的作用 h s p a 5 f u n c t i o n si ne a r l y d e v e l o p m e n t o ft h ez e b r a f i s he m b r y o m a s t e ro fs c i e n c ec a n d i d a t e ：m e n gs h u s u p e r v i s o r ：m a d a n - w e i a n d m m g a n - r u i n g v i s p a 5b e l o n g st oam e l l 3 b c ro ft h er a p t 0 细n 戤i tp l a y s 缸驴。哟毗r o l e si n 缸i i j ! c 缸培f o l da n da s s e m b l yo f n e w l ys y n t h e 蒯p r o t e 妇a n dt h e i ra m s l o c a f i o n a c r o s s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m m e m b m l e a s a m o l e c u l a r 蛐, h e i p i = n g r e f o k i s a e s s - d e m t u l e ds o h b l ep r o t e i n sa n dt e g u l a 血gs i g n a lw d n s d l 瑚o np a t h w a y sb y m o d u l a t i n gt h es t a b i l i t ya n da o i v i t yo fp r o t e i nk i n a s e sa n di r a m c r i p f i o n a lf a a o l x d u r i n ge a f i y m o u s e e m b 聊) g e n e s i s , h s p a 5 i sa b l e t o p r o t e c t _ t b e i n n e r c e l l m a s s f r o m a p o p t o s i s 1 t 凼p r o j e da i m st oi n v e s d g a t ee x p r e s s i n 肚a n dr e g 衄o no f 髓弘jd u r i n g z e t r a f i s he m b x y o g e n e s i sa n di t sf u i 蜘o i li n 既曲q m l i cd e v e l o p m e n t t r a n s i t so f z d 蛐驯a r cp r e s 耐i nf e r f i t i z e d 镏唠s u g g e 血gt h e i rm a t e r n a l 甜豇 z y g o t i c 懿挪鼬o f 驯s t a r t s d u r i n g m i d g a s c u l a f i o n a n d o c c u r s i n t h e h y p o b l a s t c e l l s i ti s 删c a u ye x p r e s s e di nt h eb a 蛾g l a n da n dt h en o t o c h o l dd r m g 辩粤琳删觚mt h e 仇呱疆脚o f 丑眵西i n 瑟h a 劬锄幽r y o s i se n t r a n c e dw h e n t r a n s l a t i o no fm d o g m o u s 驯m r n ai sb l o c k e d , g g e s t i n gaf e e d - b a c k r e g u l a t o r ym e c 妇u p o n h e a ts h o c k , a n b r y o ss h o wh i g h e rl e v e l sa n de x p a n s i o n o f h 碜z 5e x p r e s s t 呱i n d i c a 9 1 】gt h a t 别呼e ：s s l o ni si n d u c i b l eb yh e a ts h o c k a 在h , , u g h 讲喇期中r e s s i o f 月自口dd o e sn o tc a u s ed e t e c t a b l ed e f e c t s , i t sk n o c k d o w n b yi n j e c t i n g 驯m o r p h o l i n oa n f i s m s eo l i g o n u c l e o f i d e sr e s u l t si ns l o w e re p i b o l y n 四川师范大学硕士学位论文 d u r i n gg l l $ t l u l a f i o l la n dd o m l i z e dp h e n o t y p 锚a t2 4t 轼i n c l u d i n g 斌i l a 1 e l a r i dc u r l e d t a i la n da b s e n c eo fc a u d a lv t 删f i n w h e nn s m * a 甲r e s i s 吼i n 础f f y d si s k n o c k d o w n , t h e 口甲嘴龉o f l h ed o r s a lm a r k e t sg 虻a n d n t i se n h a n c e dw h i l et h e e x p r e s s i o no f v e a l t r a lm m k 娜i sr e d u c e d t h e s e 建飘吐bs u g g e s tt h a t - - s p 西i sr e q u i r e d f o re p i b o l i cm o v e m e l ta n di si n v o l v e di nc 0 呲啦鸦o fd o r s a ld e v e l o p m e n ti n z e b r a f i s h 锄b r y o s f u 曲舳i 删吗k n o c k d o w no f 且驴酊m 麟v e 曲硼z e d p h e n o t y p e si n d u c e db yo v e 删o n o fb m p 2 b ；o nt h eo t h e rh a n d , d o m l i z 面 p h m o t y p c sc a u s e db y 剐k n o c k d o w n 血；样w h e nb m p 2 bm r n ai s c o i n j e c t e c li t i sl i k e l yt h a ti n v o l v e m e n to f 驯i nd o r s o v 劬 a l 弘蛔n i n gi s a 鹤o c i 劬e d 祈l h 印s i g n a i s h o w o v f f , i t s u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s r e m a i n u n c l e a r k y e w o r d s ：z e b r a 丘s h ，h e a ts h o c k ，驯，d o r s o v e 删x a l p a t t e r n i n g ，b m ps i g n a l i l l n s p a 5 在斑马鱼胚胎发育中的作用 图片目录 图1 1 斑马鱼早期胚胎发育 图1 2 图1 3 图1 4 图1 5 图2 1 图2 2 斑马鱼胚胎的原肠运动5 原肠胚期胚胎的组织中心和细胞发育命运图6 早期脊椎动物胚胎中功能性b m p 信号梯度的形成8 h s p a s ( g r p 7 8 ) 是内质网应激信号和细胞幸存的中心调控子1 5 引物序列和p c r 条件 反义吗啉环核苷酸分子结构示意图 图2 3 原位杂交原理图 2 0 2 1 图3 3 斑马鱼n s p a 5 蛋白同人、小鼠和爪蟾h s p a 5 蛋白的序列比对3 4 图3 6 h s p a 5 基因表达的自我调节3 7 图3 7 不同时期热激胚胎的h s p a 5 表达。3 9 图3 8 ，p c m v 5 m y c - h s p a 5 在2 9 3 t 细胞中的表达检测。4 0 图3 9 注射h s p a 5m 0 1 或m 0 2 后2 4 h 胚胎的表型4 l 图3 1 0 抑制m p a 5 表达会减慢胚胎外包速度 图3 1 1 抑制n s p a 5 基因导致胚胎背部化4 3 图3 1 2 抑制h s p a 5 后胚胎的背腹标记基因的表达情况4 4 图3 1 3 抑制h s p a 5 后胚胎的背腹标记基因的表达情况的统计数据4 5 图3 1 4 注射b m p 2 bm r n a 引起的胚胎腹部化表型4 6 图3 1 5 抑制n s p a 5 能够挽救过量表达b m p 2 b 导致的腹部化表型4 8 v i 四川师范大学硕士学位论文 表格目录 表1 诱导h s p a 5 基因表达的因素1 4 表2 构建的质粒以及合成的m r n a 、探针的作用3 l v 四川师范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师马丹炜和孟安明教授指 导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因 不符而引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在 大学拥有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学 校规定提交印刷版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索；2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文或解密后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在 校园网上供校内师生阅读、浏览。 论文作者签名： 2 0 0 7 年5 月 四川师范大学硕士学位论文 发育生物学是当前生命科学研究当中一个非常活跃的领域，主要研 究多细胞生物体从生殖细胞发生、受精、胚胎发育到个体生长、衰老和 死亡的机制近5 0 年来，分子生物学、细胞生物学、遗传学、生物化学 等领域都获得了飞速的发展，并同发育生物学相互交叉融合，使人们对 生物体发育的分子机制有所了解，对发育过程在基因水平的分析已经全 面展开。 模式生物在发育生物学的研究中起到关键性的作用。生物界的多样 性决定了在现有的条件下对所有生物的生命现象都进行研究是不可能 的，也是不必要的。模式生物，因为具有便于操作和便于观察的特点， 成为现代生物学中的主要研究对象。果蝇和线虫是被广泛采用的无脊椎 模式动物。它们具有相对简单的结构，容易操纵基因，便于观察和突变， 将胚胎学和遗传学二者有机地结合起来，奠定了分子发育生物学研究的 基础。在脊椎动物的研究中，则主要采用鸡，小鼠，非洲爪蟾，斑马鱼 等作为模式生物。斑马鱼作为发育生物学模式生物的研究开展较晚。但 是由于斑马鱼具有体外受精、胚胎透明易于实验操作、繁育能力强、生 长周期短等优点，其作为发育生物学模式生物的地位被广泛的接受，以 斑马鱼为材料的研究也越来越多，加深了对脊椎动物发育机理的了解。 尽管对其它物种的h s p a 5 的表达、调控和功能已有较多研究，但关 于斑马鱼的h s p a 5 的研究尚未见报导。本研究主要通过运用显微注射和 胚胎原位杂交等技术，探讨了h s p a 5 在斑马鱼早期胚胎发育中的作用， 主要目的是探讨斑马鱼h s p a 5 在胚胎发育中的时空表达谱、表达调控方 式以及其在胚胎发育中的可能功能，加深对热休克蛋白家族在胚胎发育 中的作用的了解。 1 文献综述 1 1 模式动物斑马鱼的优点 近年来，以斑马鱼为模式动物对胚胎早期发育的研究工作在国内外 大量开展，做出了很多优秀的工作。在发育生物学中的许多领域都有重 大发现，包括细胞命运决定、组织形态发生、环境对发育的影响等。它 h 印a 5 在斑马鱼胚胎发育中的作用 作为模式生物研究具有以下的优点【1 1 ：1 1 ) 成鱼个体小，便于大规模养殖；性成熟时间短，仅3 个月左右； 繁殖力强，一对鱼每周1 次可以产卵2 0 0 4 0 0 枚；它们的产卵时间也可以 通过光照控制。这样就能够保证获得大量的实验样本。 2 ) 体外受精、体外发育而且胚胎透明。因此可以在显微镜下方便地 观察和研究胚胎发育过程。而且在2 4 h 内斑马鱼的各种组织器官已经基 本分化出来，还有利于研究细胞的早期发育命运。 3 ) 胚胎直径达到i m m , 易于进行显微注射。通过m r n a 和m o r p h o l i n o ( 反义吗啉环寡聚核苷酸) 酌注射可以实现对某个特定基因韵过量表达 或者抑制，从而研究基因在早期发育过程中的作用。 4 ) 通过胚胎原位杂交技术可以直观地检测特定基因的时空表达情况 以及某特定基因的过量表达或者抑制对其他因子表达的影响。 5 ) 可以比较方便地进行细胞移植实验，从而能够更直观地观察细胞 命运。 6 ) 已经建立了一定规模的突变体库，并且已经完成了全基因组测序 工作，这些都为后续的研究工作奠定了良好的基础。 比较其它的一些模式生物，斑马鱼在进化上比果蝇和线虫高等，在 遗传操作上又比小鼠、鸡等便捷，因而是一种研究发育生物学比较理想 的模式生物。比如研究器官的形成，线虫和果蝇缺少脊雄动物所具有的 许多器官，因而不适合做有关的研究模型；爪蟾、鸡和小鼠不适合进行 大规模突变筛选，或者难以进行直接观察，做有关研究也面临一些困难： 在这些方面，斑马鱼具有相应的一些优点 i 2 斑马鱼胚胎的早期发育过程 根据斑马鱼在受精后3 d 之内发育过程中的主要形态变化，可以将其 早期胚胎发生过程分为7 个大的时期受精卵期、卵裂期、囊胚期、 原肠胚期、分节期、咽胚期以及孵化期，然后就进入幼鱼阶段闭。 1 2 1 卵裂期( c l e a v a g e p c r i o d ) 2 四川师范大学硕士学位论文 豳1 1 斑马鱼早期胚胎发育( 摘自k i m m e ! e t a l 1 9 9 5 i z l ) f 毡1 1 勘r 咿d e v e l o p m e n t o f z e b r n f i s he m b r y o ( k i m m e l e t a l l 9 9 5 ”) ( 娃。a 、r q 受精的斑马鱼胚胎；8 ，单细胞期 c ，两细胞期 d 、2 5 6 细胞期le 、球期lf 、 圆碗期；o 、胚盾期，侧面观，背侧向右# o 、胚盾期，由动物极方向向下观察，箭头标记背侧 的胚盾；h 、s 0 0 o f 包期。侧面观，蓊头指示内卷运动的前墙；h 、8 0 , 0 外包期，背侧观，箭头指 示细胞向背侧会聚运动；1 2 体节期，箭头所示为新生的体节；j 8 伴节期。箭头所示为眼原基； k1 4 体节期，箭头指示k i p 彘r s v 1 c ；l 、i s 体节期；m 、2 2 体节期) 斑马鱼的卵细胞在受精前就已经决定好了动物极植物极方向。受精 时精子从预置的动物极进入细胞，这时的细胞卵黄和胞质是混在一起的 ( 见图1 1a ) 受精后1 0 m i n 左右，卵黄中出现了从植物极到动物极的 胞质流使得胞质和卵黄分别聚集在动物极和植物极。受精后3 0 m i n 左右， 动物极细胞鼓起( 见图1 1b ) 受精后4 5 r a i n 第一次细胞卵裂发生了 h s p a s 在斑马鱼胚胎发育中的作用 斑马鱼的卵裂属于不完全卵裂，只有动物极的细胞分裂而卵黄不分裂。 后面的几次卵裂每隔1 5 r a i n 发生1 次。这时位于胚盘边缘靠近植物极的 细胞与卵黄细胞问存在着胞质桥。 1 2 2 囊胚期( b l a s t u l ap e r i o d ) 在经过了l o 次卵裂后，细胞发育至t j l k - c e l l 时期，舍子基因开始表达 这时的胚胎出现了卵黄合胞层( y o l 】( s 蜊a 1l a y e r ，y s l ) ，它是由位于 胚盘边缘靠近植物极的细胞与卵黄融合而成。该结构可以分泌产生调控 胚胎发育的信号因子。随着细胞的继续分裂，胚盘细胞开始向植物极运 动将卵黄包在里面( 图1 1f ) ，进入原肠胚期。 1 2 3 原肠胚期( g a s t r u l a p e r i o d ) 原肠胚期是斑马鱼发育的一个关键阶段。这个时期胚胎通过原肠运 动形成了前后轴( a n t e r i o r - p o s t e r i o ra x i s ) 和背腹轴( d o r s a l v e n w a la x i s ) 以及外胚层、中胚层和内胚层。其中外胚层可以分化为表皮和神经系统； 中胚层可以分化为脊索、血液、体节等；内胚层最终形成肠、肝等内脏 器官。 原肠运动包括外包( 印i b o l y ) 、内卷( i n v o l u t i o n ) 、会聚延伸 ( c o n l 搿g 髓c ea x t e n s i o n ) 等运动形式【3 】。在原肠胚初期，胚层很厚，这时 内层细胞和外层细胞相互嵌入使得胚层变薄( 上图1 2 a ) 。由于细胞数目 并没有变少，所以胚层变薄使得胚层面积变大，胚层开始进行沿着卵黄 外侧向植物极方向的外包运动。在原肠胚中期，胚层在向下外包的同时 最前端的细胞开始内卷，并在卵黄和外侧胚层细胞间向动物极方向运动 ( 图1 2b ) 。这层细胞形成下胚层，以后会形成中胚层和内胚层；外侧 细胞形成上胚层，以后形成外胚层。在胚层向下外包的同时，不断有上 胚层前沿的细胞内卷成为下胚层。胚层的原肠运动还包括细胞向背侧的 会聚，以及由于细胞间交叉会聚引起的细胞沿前后轴方向的延伸( 图1 2 c ) 。 4 四川师范大学硕士学位论文 圈1 2 斑马鱼胚胎的原肠运动( 摘自m o n t e r o h e i s e n b e r g2 0 0 4 1 3 1 ) m 9 1 2c e l lm o v e m e n t sd u r i n gg a s t u l a t i o no f z e b r a f i s he m b r y o ( m o n t e r o & h e i s e n b e r g2 0 0 4 s ) ( 注：a ，3 0 外包期胚胎，右图为红色方框内细胞径向嵌入运动的示意圈：b 、胚盾期胚胎右 匿为红色方框内细胞内箍运动及由此形成韵上，下胚层的示意图；“尾芽期胚脆。右匿为细瞻会 聚延伸运动示意图) ， 在原肠胚期，胚盘上不同位置的细胞就已经具有了发育成外、中、 内胚层及最终分化成不同组织的命运( 见图1 3a 、b ) 1 4 】。原肠运动中的 内卷和会聚运动形成了背侧的胚盾结构( 见图1 1g 、g ) 。胚盾是胚胎 发育的组织中心，它可以分泌出多种信号因子指导体轴及胚层的发育。 胚盾、腹侧细胞及卵黄合胞体中释放的各种信号因子相互作用诱导着各 个胚层的发育( 见图1 3c 、d ) 5 h s p a 5 在斑马鱼胚胎发育中的作用 胚胎发育到尾芽期后，胚胎的原肠作用结束，胚胎开始出现体节， 进入体节期( 见图l 。li - m ) 。在这个时期胚胎的各个器官原基相继形成。 等到胚胎发育到2 4 h 后( 见图1 1m ) ，胚胎的雏形已经形成。 在胚胎发育到1 0 体节左右的时候，在胚胎的尾部可以看到k u p f f e r s v e s i c l e 研究表明这个结构对于胚胎的左右不对称发育起到很关键的作 用。k u p f f e r sv e s i c l e 中的纤毛通过具有一定方向的运动使得一些信号因 子在胚胎中不对称分布，最终影响胚胎的左右不对称发育。 豳1 3 原肠胚期胚胎的组织中心和细胞发育命运图( 摘自s c h i e r 2 0 0 1 1 4 1 ) f i 9 1 3f a t em a pa n do r g n 协rc e n t e ri nz e b r a f l s bg a s t r u l a ( s c h i e r2 0 0 1 4 j ) ( 注to 、各胚层前体细胞在胚盘上的分布b 、背腹组织前体的发育命运图c 、卵黄合胞层分泌 的信号分子影响胚盘边缘细胞的发育命运。核内0 - r a p p e n 的聚集地形成了背部组织中心d 、背 部组织中心产生的拈抗因子抑制腹部因子b m p 的作用，腹侧的v o x v e n t 抑制背部的拈抗因子， 互相作用形成备自的浓度梯度) 6 四川师范大学硬士学位论文 1 2 5 咽胚期( p h a r y n g u l as t a g e ) 以及孵化期( h a t c h i n gs t a g e ) 受精2 4 h 以后，胚胎进入咽胚期。身体的轴线开始从卵黄囊周围的 曲线逐渐伸直；循环系统开始工作、色素形成和鳍开始发育。受精4 8 h 后进入孵化期，完成主要器官的快速形态发生；头部和胸鳍的软骨开始 发育；胚胎的孵化开始不同步地发生。 1 3 斑马鱼胚胎的背腹分化 。 在斑马鱼胚胎发育的过程中，诱导形成的中胚层，还要继续分化为 背部中胚层( 以脊索为标志 和腹部中胚层( 以血液为标志) ，在这两者 之间的细胞沿背腹轴线依次获得发育为体节、前肾、侧板中胚层等的命 运，即背腹分化，如图1 3 ( b ) 所示。在背腹分化的过程中，背部组织中心 起到重要作用，斑马鱼的组织中心称为胚盾( e m b r y o n i cs h i e l d ) ，它是由 母源的b - c a t e r i i l l 进核后诱导产生的胚盾中的细胞可以产生脊索、前脊 索板、神经底板、背部内胚层等中轴组织，还产生拮抗腹部因子的信号 因子指导其周围细胞分化为体节、神经组织、肝、胰脏等。 背腹分化的过程由复杂的分子机制调控。如图1 3 ( d ) 所示，组织中心 分泌信号蛋白c h o r d i n ，n o g g i n ，f o l l i s t a t i n 等，它们拮抗来自腹部的b m p 信号，从而使后者形成沿腹部到背部的浓度梯度，诱导除背部中轴组织 以外的不同的中胚层组织的形成p 】。母源争c a 触l i n 进入背部细胞的细胞 核。诱导一系列因子的表达，如s q t 、c h o r d i n ，b o z o z o k 等，并间接诱导中 轴特异的槲和g s c 等表达，从而形成中轴组织1 4 l 。此外，还有许多其它 分子在转录水平上相互抑制或蛋白水平上相互拮抗，增强了这种背腹分 化的稳定性。 1 4b m p 信号通路 骨骼形态发生蛋白0 3 0 n em o r p h o g e n c t i cp r o t e i n , b m p ) 是t g f b 超家 族成员的旁分泌因子之一，控制着早期胚胎发育、器官形成和成体组织 发育的基本事件嘲t g f - 3 超家族成员的旁分泌因子还有a e t i v i n 、t g f d 等，它们所采用的通路是s m a d 通路，这一信号通路是根据通路信息最终 7 砷a 5 在斑马鱼胚胎发育中的作用 传递给s m a d 的一组转录因子而命名忉。b m p 家族成员特异激活s m a d l 、 s m a d 5 和s m a d 8 。a v t i v i n 则激活s m a d 2 和s m a d 3 。 。鱼 零 嚣 4 圈1 4 早期脊椎动物胚胎中功能性b m p 信号梯度的形成( y u k i y oy a n d m i c h a e lo ，2 0 0 4 日) f i 9 1 4 f o r m a t i o no f f u n c t i o n a l b m ps i g n a l i n g g r a d i e n t i n e 4 r l y v e r t e b r a t e e m b r y o s ( y u k i y oya n dm i c h a e lo ，2 0 0 4 阿) ( 注ti t 、b m p 信号转导通路，b - d ，早期爪蟾胚胎中b m p 信号的激括灰色代表激活的b m p 在囊胚期激活的b m p 均等地分布在胚胎中，在原肠期，位于组织中心的b m p 分泌性拮抗因子 c h o r d i n 和n o g g i n 使b m p 沿着背腹轴线形成浓度梯度神经外胚层和中胚层豹脊索和肌肉b m p 活性水平底，在腹部外胚层和腹部中胚层的b m p 活性水平高) b m p 信号通路( 图1 4 a ) 受体是具有丝氨酸和苏氨酸激酶活性的蛋 白，包括两种类型；i 型受体和i i 型受体。b m p 信号首先和型受体结 合，从而使结合的n 型受体具备了与i 型受体进行异源聚合的能力。一 8 四川师范大学硕士学位论文 旦两个受体结合， ， n 型受体便可以磷酸化i 型受体的丝氨酸或苏氨酸从两使其激活。 激活的i 型受体具有了激酶的活性，再进一步磷酸化s m s d 转录因子家族 蛋白s m a d l 、s m a d 5 和s m a d 8 ( 也称受体磷酸化s m a d ，即 r e c e p t o r - p h o s p h o r y l a t e ds m a d ，r - s m a d ) 受b m p 家族成员特异激活。 激活的r - s m a d 与s m a d 4 结合( s m a d 4 也被称之为c o s m a d ) ，一起 进入核内，募集转录因子，启动下游特定基因的转录隅1 在胚胎发育过程中，b m p 蛋白存在于整个腹部外胚层和腹部中胚层 中在背腹分化和表皮形成中起作用。在组织中心分泌的c h o r d i n 、n o g 西n 等蛋白拮抗作用下，一方面b m p 形成从腹部到背部的浓度梯度，指导背 腹分化，另一方面，这些组织中心分泌的蛋白会诱导其上方的外胚层分 化为神经外胚层，b m p 则指导所在的外胚层分化为表皮。导致胚胎背部 化的因子对b m p 信号的抑制作用，通常表现为两个方面：一方面可以通 过诱导c h o r d i n 表达来拮抗b r a p 信号，另一方面也可以直接抑制b m p 的 转录 1 5 h s p a 5 基因的研究现状 1 5 i h s p s 基因家族 各种生物有机体，从大肠杆菌、酵母、果蝇到植物细胞、哺乳动物 细胞，在受到周围环境不利或有害因素影响时，会产生一系列为适应环 境的改变而作出快速短暂的细胞代谢调节，此期间细胞内一些正常基因 的表达受到抑制，而一些特殊基因则被激活并表达，表现暂时性下调某 些蛋白的合成和选择上调表达一组蛋白，r p h s p s ，实质上是细胞对外界 做出的一种自身保护性反应。这种现象称为热休克反应，这组特殊基因 就是热休克基因，所产生的蛋白就是熟休克蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n s ， h s p s ) 。现在已知h s p s 不仅能被热所诱导，还能被许多其它类型的胁迫 如低糖、低氧、低钙等所诱导，因此有时也称为胁迫应激蛋白( s u e s s p r o t e i n s ) 除了受胁迫的情况外，正常生理条件下的细胞中也有r l s p s 存 在。这类 i s p s 是组成型表达的，称为热休克相关蛋白( h e a ts h o c kc o g n a t e 9 h s p 丑5 在斑马鱼胚胎发育中的作用 p r o t e i n s ，h s c s ) h s c s 在正常条件下即有高表达而应激后的表达量进一步 提高，与细胞的分化、发育密切相关；h s p s 在正常生理条件下不存在或 表达量低，但能为热强烈诱导，具有保护细胞的功能。h s c s 和h s p s 在核 苷酸序列上高度同源，蛋白结构和功能很相近，通常都统称3 白h s p s ! 们 对h s p s 的研究历史并不长。1 9 6 2 年，r t o s s a 发现，短暂的热激能 诱导黄猩猩果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 唾腺的多线染色体发生膨突 ( p u f f s ) ，膨突的生成与该区基因发生转录有关，后经证实在受热激的果 蝇组织中产生了一类新型的蛋白，h s p s 以后又陆续从原核生物( 细菌) 和高等动物鸟类和哺乳动物的组织或培养细胞中发现了类似的反应。 1 9 8 2 年a d e m s 等证实了一切生物细胞( 包括原核细胞和真核细胞) ，受 高温诱导时均可合成一类具有相似生物学活性和生理功能的蛋白质自 1 9 8 2 年在美国冷泉港召开了第一届h s p s 的国际会议后，世界上对h s p s 的研究蓬勃发展起来。 目前对于h s p s 无明确的分类标准，但大都是基于同源程度和分子量 大小进行分类。另外，根据诱导方式不同，分子量3 4 、7 5 、7 8 及1 7 0 k d 的 h s p s 又称为葡萄糖调节蛋白( g l u c o s e - r e g u l a t e dp r o t e i n s ，g r p s ) ，认为与 葡萄糖缺失诱导有关，实际上钙浓度、缺氧等因素均可引起g r p s 的表达 增加，但此名称一直沿用下来( 斑马鱼的h s p a 5 基因就是哺乳动物的 h s p a 5 b i p 基因) 。因此，h s p s 的分类是楣对的，普遍公认的主要有四个 家族，i l p h s p 9 0 ( 8 3 - 一9 0 k d ) 家族、h s p 7 0 ( 6 6 , - 7 8 k d ) 家族、h s p 6 0 家族及 小分子h s p ( 1 5 3 0 1 d ) ) 家族【1 0 l 本论文中所研究的h s p a 5 g r p 7 8 b i p 分 子量为7 8 k d ，而且与n s p 7 0 家族的成员在结构和功能上也相似，因此属于 h s p t 0 家族的成员之一。 在个体发育阶段h s p s 基因调控有特异性。发育的某一阶段，一些细 胞在生理条件下，也存在n s p s 基因表达，同时在某些阶段赋予一些应激 h s p 基因的不表达。说明h s p s 基因有发育阶段的特异性和组织特异性。 例如正常情况下。胚胎发育时期不同，被激活的热休克蛋白基因也不同； 胚胎组织不同，熟休克蛋白的种类和分布亦不完全相同 1 0 四川师范大学硕士学位论文 1 5 2 h s p 7 0 基因家族的特性及分类 h s p 7 0 在原核生物和真核生物体内都存在，并存在于所有的细胞区 室和器官【l l 】中 哺乳动物胞液中的h s p 7 0 有2 种，一种为基础合成型( h s c 7 0 又称 h s p 7 3 ) ，另一种为高度诱导型( h s p 7 0 又称为h s p 7 2 ) 内质网上h 印7 0 的 代表性成员是7 8 k d 的蛋白称为免疫球蛋白重链结合蛋白( b i p 蛋白) 或 h s p a 5 1 2 1 。线粒体内i i s p 7 0 家族成员是g r p 7 5 h s p a 5 ( b i p h s p a 5 ) 、 g r p 7 5 、h s c 7 0 ( h s p 7 3 ) 在无胁迫的细胞中表达，而h s p 7 0c h 印7 2 ) 由应 激诱导产生。 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i )和酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e j c e r e v i s i a e ) 中h s p 7 0 家族成员具有不同的名称大肠杆菌胞液中的i - i s p 7 0 称为d n a k p 3 1 。酵母菌胞液中有两种h _ s p 7 0 ，s s a 和s s b ；内质网中的称为 驱动蛋白( k a r 2 ) 0 4 1 ，线粒体中的称为s s c 。果蝇的h s p 7 0 家族有2 个诱 导型成员，h s p 6 8 和h s p 7 0 ，和5 个组成型表达的成员，h s c 7 0 - 1 、2 、- 3 、 4 、5 ，其中h s c 7 0 - 3 和h s c 7 0 5 分别定位于内质网和线粒体，其余的定 位于胞质内 ， h s p 7 0 家族成员均含有两个主要的结构域，n 端高度保守的4 4k d a t p a s e 功能域( a t p - b i n d i n gd o m a i n ) 和一个2 5l 的d 端区域组成 由于n 翁有a t p a 功能域，因此可以结合a t p 。c - 端又可以分成保守的 1 5k d 啪多肽结合功能域( p o l y p e p t i d eb i n d i n gd o m a i n ) 和不保守的靠近 c 端最末端的1 0k d 可变区和c 端最末端的基序( m o t i f ) ，不同类型的 m p 7 0 成员的基序是特异性的，定位于胞质中的r a p 7 0 的基序序列为 e e v d ，内质网中的为h d e l ，线粒体中的为p e a e y e e a k k p s l 。不同物 种问位于同一细胞区室的h s p 7 0 蛋白之间，比来自同一生物不同器官的 h s p 7 0 之间更相似，说明不同成员功能的特化。 1 5 3 h s l , a s 基因 7 葡萄糖调节蛋白( g l u c o 静r e g u l a t c dp r o t e i n , g r p ) 是定位在内质网中 与钙结合的分子伴侣蛋白 1 6 1 内质网是分泌蛋白和膜蛋白合成和修饰的 h s p 酊在斑马鱼胚胎发育中的作用 细胞器，也是细胞内部一个主要的储存钙的场所。处于特定生理和药理 条件下。如低糖、低氧、低钙、热刺激以及某些化学试翅吐砷s i g 嘲豇、 a 2 3 1 8 7 等，细胞常发生内质网应激反应，引起内质网功能紊乱，如蛋白 质糖基化受阻，错误折叠蛋白大量积聚，内质网内钙大量流失等。这些 内质网应激细胞接着就会发生错误折叠蛋白反应( u n f o l d e d - p r o t e i n r 酷p o n s e ，u p r ) n ”u p r 作为一种进化上保守的细胞自我保护的防御机 制，能诱导内质网应激细胞g r p s 的表达以维持内质网的动态平衡。细胞 中含量丰富最具特征的g r p 是h s p a 5 ( h e a ts h o c k7 0 k d ap r o t e i n5 ) ，它是 一个分子量为7 $ k d 韵蛋白质，常称为g r 7 8 。由于它能与前b 缅胞的 免疫球蛋白重链结合，亦可称之为免疫球蛋白重链结合蛋白( t h e i n n n u n o g l o b u l i nh e a v y c h a h lb i n d i n gp r o t e i n , b i p ) i s 】。g r p 7 8 的诱导通常 作为内质网应激和错误折叠蛋白反应发生的指示因子而被广泛应用 1 4 3 1 h s p a 5 的功能 研究发现，从酵母到人类的体内均存在h s p a 5 1 柳，它与热休克蛋白 7 0 ( h s p 7 0 ) 家族大约有6 0 的同源性，与h s p 7 0 具有结构和功能上的 相似性i 硼，普遍认为是i - i s p 7 0 家族成员之一嗍。 h s p a 5 作为内质网行使功能的一个中心调控子，在维持细胞正常运转 的过程中起着极为重要的作用。它可作为一个内质网分子伴侣促使蛋白 质正确折叠、组装及转运；能靶向作用于错误折叠蛋白并使之降解；并 能结合内质网中c a 2 + ，控制内质网应激跨膜蛋白的活性。多种化学物理 因素都能诱导h s p a 5 表达增强。其表达的增强可视为一种临时的细胞保 护防御机制。近年来研究表明h s p a 5 在大量的肿瘤细胞以及肿瘤活体切 片组织中呈高表达，也为肿瘤治疗的研究提供了一条新思路。 1 4 , 3 , 2 i i s p a 5 的表述与胚胎发言 各种环境和生理的应激条件，如扰乱内质网功能和动态平衡，通过 药理学试剂影响蛋白质折叠，糖基化或是内质网钙的聚集等，都能诱导 h 印岱表达。在非应激条件下的体外培养的细胞中，h s p a 5 也能持续合成， 1 2 四川师范大学硕士学位论文 这可能是因为组织培养条件对细胞本身就是一种应激刺激。在不同的生 物体内，不同发育的时期和不同组织之闻，h s p a 5 的表达水平各异。体内 的研究主要集中在小鼠上，通过免疫组化染色检测h s p a 5 的分布情况表 明：h s p a 5 在鼠胚早期器官形成过程中的脑、心脏、神经管、内脏内胚层、 体节以及表面外胚层中都有表达。研究进一步发珊- i s p a 5 在小鼠脑发育过 程中呈时空性表达：时间上，胚胎早期表达较高，胚胎发育末期逐渐下 降，出生后逐渐升高，至生后一周时达到成年鼠的水平；空间上，胚胎 j 羽h s p a 5 蛋白在脑组织的表达呈现从端脑到后脑逐渐降低的趋势。研究结 果还表明h s p a 5 蛋白的免疫染色阳性产物在神经细胞中出现的时间旱于 神经胶质细胞【2 l 】。这些结果提；示h s p a 5 与脑的早期发生和形态建成有一定 的关系。早期鼠胚心脏中h s p a s 表达水平高，而在胎儿时期心脏h s p a 5 表 达显著降低，但在低血糖条件下能够被诱导【2 2 】。在未成熟大鼠的脑部也 发现h s p a 5 高表达，而在成年大鼠中其表达量减少1 2 3 在成年大鼠脑中 h s p a 5 能受脑缺血发作，谷氨酸激动剂，红藻酸氨的诱导【硼。在培养的大 鼠海马神经元，用谷氨酸盐和氧处理，h s p a 5 水平升高而且能防止神经毒 剂的毒害。因此认为，在胚胎早期发育中h s p a 5 作为一个关键性的分子伴 侣，是蛋白质正确折叠和分泌所必需的利用转基因小鼠对h s p a 5 进行的 研究也得到了可喜的结果：由于在早期鼠胚心脏中3 k b 的小鼠h s p a 5 启动 子显示出强的报告基因活性，因此通过检测某一结构缺失的转基因小鼠 上由脚a 5 启动子驱动的p g a l 活性，能够反应出h s p a 5 基因上所缺失结构 的重要功能研究发现缺失内质网应激反应元件( t h ee n d o p l a s m i c r c t i c u l u ms t r e s sr c s p o n b ce l e m e n t s ，e r s e ) 的转基因小鼠胚胎心脏没有报告 基因p - g a l 的活性，因此认为在小鼠胚胎心脏发育中，h s p a 5 的诱导依赖于 e r 应激【2 5 1 。 普遍认为，h s p a 5 作为e r 分子伴侣蛋白之一，驻留在内质网腔中。然 而大量的研究证明h s p a 5 也可定位在细胞表面。在用t h a p s i g a r g i n 处理的 人类横纹肌肉肿瘤细胞中首次发现了脚a 5 可在细胞表面表达【2 昭”进一 步研究发现，h s p a 5 在癌细胞表面存在，而在正常细胞表面不存在【2 s j ，这 一发现说明癌细胞中h s p a 5 向细胞表面的转运涉及到一个特异的机制。