（细胞生物学专业论文）dna甲基化对骨髓间充质干细成骨分化的作用.pdf

浙江人学硕f ：学位论文 摘要 具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 是组 织工程良好的细胞种子来源，然而使干细胞高效地向预定的方向分化还是个很大的 挑战，这就需要我们充分了解干细胞分化的调节机制。除了传统的转录因子调节， 表观遗传修饰也在干细胞分化调控中也起着十分重要的作用，d n a 甲基化修饰是表 观遗传调控的主要方式之一。本文以m s c s 成骨分化为模型，利用d n a 甲基化抑 制剂一一5 氮胞苷研究了d n a 甲基化对m s c s 成骨分化的影响。在成骨分化诱导 前用5 氮胞苷预处理m s c s2 4 小时，其成骨分化效率明显提高，并伴随着基因组整 体水平上d n a 甲基化修饰的减少。在单基因水平上，我们又检测了成骨分化重要 调控基因d l x 5 上甲基化修饰水平的变化，发现5 氮胞苷预处理后，d l x 5 基因的“c p g i s l a n ds h o r e ”处甲基化水平降低。本文充分证明了d n a 甲基化修饰在m s c s 分化中 的作用，为m s c s 未来的研究和应用提供了重要依据和方法。 关键词：5 氮胞苷间充质干细胞成骨分化d n a 甲基化表观遗传 i i i 浙江人学硕 ：学位论文 a b s t r a c t m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( m s c s ) a r ec o n s i d e r e dt ob eo n eo ft h em o s tp r o m i s i n gt h e r a - p e u t i cc e l ls o u r c e sa st h e ye n c o m p a s s ap l a s t i c i t yo fm u l t i p l ec e l ll i n e a g e s t h ec h a l l e n g e i n u s i n gt h e s e c e i l sl i e si nd e v e l o p i n gw e l l d e f i n e dp r o t o c o l sf o rd i r e c t i n gc e l l u l a r d i f f e r e n t i a t i o nt og e n e r a t ead e s i r e dl i n e a g e i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h ee f f e c to f 5 - a z a c y t i d i n e ，ad n ad e m e t h y l a t i n ga g e n t ，o no s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no fm s c s t h e c e l l sw e r ee x p o s e dt o5 - a z a c y t i d i n ei nc u l t u r em e d i u mf o r2 4hp r i o rt oo s t e o g e n i c i n d u c t i o n o s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o nw a sd e t e r m i n e db yt h ea p p e a r a n c eo fan u m b e ro f o s t e o g e n e s i sc h a r a c t e r i s t i c s ，i n c l u d i n gg e n ee x p r e s s i o n ，a l pa c t i v i t y , a n d c a l c i u m m i n e r a l i z a t i o n p r e t r e a t m e n to fm s c sw i t h5 - a z a c y t i d i n es i g n i f i c a n t l yf a c i l i t a t e d o s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o na n dw a sa c c o m p a n i e db yh y p o m e t h y l a t i o no fg e n o m i cd n a a n di n c r e a s e do s t e o g e n i cg e n ee x p r e s s i o n t a k i n gd l x 5a sar e p r e s e n t a t i v e ，m e t h y l a t i o n a l t e r a t i o n so ft h e c p gi s l a n ds h o r e i nt h ep r o m o t e rc a u s e db y5 - a z a c y t i d i n ea p p e a r e d t oc o n t r i b u t et oo s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n k e y w o r d s ：5 - a z a c y t i d i n em e s e n c h y m a ls t e mc e l l so s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n d n a m e t h y l a t i o ne p i g e n e t i c i v 浙江人学硕，i ：学位论文 致谢 两年半的研究生生活飞逝而过。在这个人生重要阶段即将结束的时刻，我怀着 感恩的心情面对我所经历的一切。 感谢邵健忠和项黎新两位导师对我的教导和付出。是他们把我领入科研的大门， 教给我研究的思维和方法，让我具备了基本的分析问题和解决问题的能力。从我论 文的选题、研究方案的设计、实验的实施、结果的分析到论文的撰写无不倾注了两 位导师大量的心血。两位导师对科研的投入和忘我更是让学生深感敬佩! 还要感谢 两位老师对学生成长的关心，感谢他们对我今后发展道路选择的理解和支持。 感谢董伟仁、张瑞鹏、陈烨、潘若浪、黄燕丹、吴俊平、张卉、胡瑜兰、熊然、 林爱福、顾一峰、刘广平、彭博、刘慧慧、巩永凤、方玮、温轶、施科云、金阳等 师兄师姐，感谢潘萍萍、王渠龙、王浩、卢亿齐、于岱永、张晓瑜、杨超、朱律韵、 孙岑岑、王萍、方瑜、何丁、王宇尧，感谢大家在学习和生活中对我的帮助和鼓励。 祝愿实验室的兄弟姐妹们实验顺利、生活愉快，未来都有好的发展。 感谢我的父母和爱人，感谢他们无私的爱；感谢所有关心和帮助过我的朋友们! i i 浙江大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 间充质干细胞与成骨分化 1 1 1m s c s 的背景与来源 干细胞是生命体中一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞群体。 根据个体发育过程中出现的先后顺序，干细胞又可分为胚胎干细胞和成体千细 胞。其中胚胎干细胞具有分化全能性，可以分化成机体任意组织细胞，它的主要 功能是参与机体的发育；成体干细胞的分化潜能则相对有限，其功能主要是维持 组织器官的新陈代谢。成体干细胞可有不同组织来源，其中以骨髓间充质干细胞 最为主要。骨髓间充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，m s c s ) 是中胚层来源 的干细胞，以骨髓组织中含量最为丰富，具有自我更新和增殖能力，经过诱导后 可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞以及心肌细胞等 1 4 】。目前，研究者已经从多种间质组织中培养得到了具有m s c s 特性的细胞， 包括皮肤、骨骼、软骨、肌肉、腱、脂肪、血管等，这些来源的m s c s 具有骨髓 来源的m s c s 相似的特性 5 】。鉴于m s c s 具有易获得、易培养、低免疫原性、 能在宿主体内长期存活、易于外源基因转染和长期表达等优点，已作为理想的种 子细胞被广泛应用于组织工程、细胞移植、基因治疗及器官移植等领域【6 】。 1 1 2m s c s 的特性 近几年来，科研人员们对m s c s 的研究有了很大的进展，对其生物学特性也 有了一定的了解。m s c s 在形态上呈现纺锤状成纤维样或不规则样，培养早期大 部分由增殖快的小梭形细胞组成，随着培养时间的延长，逐渐被增殖慢、体积大 的长方形、多角形成熟细胞替代，并且细胞形态逐渐趋于一致。m s c s 胞浆丰富， 核染色质细，核仁明显，细胞呈平行排列或旋涡样生长。对细胞周期的研究显示， 只有少数m s c s 处于活跃的复制期，而大多数细胞处于g o g 1 期，这就提示m s c s 具有高度的分化潜能。m s c s 在体外具有很强增殖能力，可以在体外大量扩增和 长期培养，并且可以长时间保持其未分化状态。 m s c s 具有很强的自我更新和多向分化的潜能。m s c s 通过不对称分裂一方 面实现增殖与分化，另一方面维持自身干细胞数量的稳定，体现其自我更新的能 力；m s c s 具有广泛的分化潜能，大量研究证实m s c s 在合适的分化条件下不仅 可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞等间充质细胞，而且可以 浙江大学硕 j 学位论文 跨胚层分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞和内胚层的肝细胞、血管内皮细胞 及心肌细胞等 7 】。并且m s c s 在经大量传代以后，有些细胞仍能保持其多向分 化的潜能。由于m s c s 的这些生物学特性，m s c s 被越来越多地用于临床研究与 治疗中，成为组织工程修复骨及软骨缺损的重要的种子细胞 8 1 0 】。 m s c s 属混杂细胞群，目前尚没有完全确定m s c s 的标志，因此，对m s c s 的选择、鉴定只能靠主要细胞表面标志来判断，一些特异抗原、细胞因子受体和 黏附蛋白都可以作为主要细胞表面标志。它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞 的表面标志物。主要包括：( 1 ) 黏附分子，如c d l 6 6 、c d 5 4 、c d l 0 2 、c d 4 4 、 c d l 0 6 等。( 2 ) 生长因子和细胞因子受体，如白介素l 受体( i l 1 r ) 、i l 3 r 、i l 一4 r 、 i l 6 r 、i l 7 r 、c 干扰素受体( i f n - c r ) 、肿瘤坏死因子( t n f ) 等。( 3 ) 整合素家 族成员，包括c d 4 9 a 、c d 4 9 b 、c d 4 9 c 、c d 2 9 、c d l 0 4 等。( 4 ) 其他如c d 9 0 、 c d l 0 5 、s h 2 、s h 3 、s h 4 等。不表达造血细胞的表面标志，如c d 3 4 、c d 4 5 、 c d l 4 、c d 3 、c d 4 、c d 8 等，也不表达与人白细胞抗原( h l a ) 识别有关的共刺激 分子及主要组织相容性复合物类分子如h l a d r 抗原等 1 1 ，1 2 。至今尚未筛选 出m s c s 特有的表面标志分子。故m s c s 鉴定常通过负性筛选和细胞多向分化结 果，逆推为m s c s 。 1 1 3m s c s 的分离方法 骨髓中的m s c s 含量极少，约占单个核细胞的0 0 0 1 - 0 0 1 1 3 。目前，用于 分离m s c s 的方法主要有四种：密度梯度离心法，流式细胞仪分离法，贴壁筛选 法和免疫磁珠法 7 ，1 4 】。 密度梯度离心法：根据m s c s 与其他细胞的密度不同，采用1 0 7 3 9 m lp e r c o l l 与骨髓悬液混合离心，分离不同密度的骨髓细胞系，取其界面的单核细胞置于含胎 牛血清的i m d m 培养液中培养。流式细胞仪分选法：根据骨髓m s c s 体积小，相 对缺少颗粒的特性，利用流式细胞仪对m s c s 进行分选。贴壁筛选法：应用不同 细胞对培养容器介质表面的不同贴壁能力进行细胞分离纯化。免疫磁珠法：根据 m s c s 表达的某些细胞表面标志物进行收集或根据其表面不表达的抗原进行负 分选。由于目前尚未发现骨髓m s c s 特异性很强的表面标志物，并且应用流式细 胞仪分选和免疫磁珠的方法对细胞损伤较大、需要骨髓量较多，所以此两种方法 应用较少。密度梯度离心法虽然可以得到相对均一的m s c s ，但其随后的分化能 浙江人学硕： ：学位论文 力却有所降低。贴壁筛选法操作简便、快速，对细胞损伤小，因而应用最广【1 5 】。 1 1 4m s c s 的成骨分化 成骨细胞( o s t e o b l a s t ) 是由m s c s 经骨祖细胞、前成骨细胞等多个独立阶段分 化而来的。在胚胎发育过程中，m s c s 通过以下两条途径参与骨的形成：膜内成 骨和软骨内成骨。对于颅面骨、部分锁骨及下颌骨，m s c s 可直接分化成为成骨 细胞，此为膜内成骨。而对于躯干及四肢骨，先是聚集，增殖并向软骨细胞分化， 形成骨骼的原始雏形。随后软骨细胞逐渐成熟为肥大软骨细胞，接着深层基质部 分钙化，血管侵入、软骨细胞逐渐凋亡并由成骨细胞取代，此过程即为软骨内成 骨。 在体外，m s c s 可经诱导分化为成骨细胞，最常用的诱导体系通常包含地塞 米松、d 甘油磷酸钠和维生素c ，但诱导剂诱导分化的作用机制尚未完全研究 清楚。其中发现地塞米松可促进成骨细胞分化成熟，同时提高碱性磷酸酶( a l p ) 的活性，调节成骨细胞分泌胰岛素样生长因子( i n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o r s ，i g f s ) ， 促进细胞外基质合成；d 甘油磷酸钠可释放磷酸根，促进生理性钙盐的沉积和 钙化；维生素c 能促进细胞合成胶原，并能调节a l p 活性和非胶原基质蛋白的 合成【1 6 】。同时细胞因子如b m p s 、t g f d 、df g f 和i l 6 等均可促进m s c s 向成骨细胞分化 1 0 】。m s c s 分化为成骨细胞的特异标志包括a l p 、i 型胶原蛋 白、矿化结节和骨特异性蛋白等。a l p 是成骨细胞的功能性酶，它能够水解有 机磷酸酶，使局部磷酸根浓度增高，而且可以破坏钙化抑制剂，从而启动钙化 【1 7 ，1 8 。m s c s 分化为成骨细胞过程中i 型胶原蛋白合成大大增加，有利于细胞 外基质的合成和钙沉淀。骨特异性蛋白包括骨钙素、骨桥蛋白和骨唾液蛋白等： 骨钙素是钙连接基质蛋白，其蛋白合成是成骨细胞进入矿化期的主要指征之一， 是成骨细胞成熟的标志；骨桥蛋白和骨唾液蛋白参与调节成骨细胞与胶原的粘附 及矿化 1 9 】。 m s c s 成骨分化过程中的关键转录因子包括d l x 5 、r u n x 2 和o s t e r i x 等 2 0 】。 d l x 5 在成骨分化早期就开始表达，它在骨骼发育过程中起着重要作用，其无义 突变的小鼠骨骼系统发育严重受损。d l x 5 主要通过调节r u n x 2 和o s t e r i x 的表达 来调控成骨的分化2 1 1 。r u n x 2 和o s t e r i x 是成骨分化的最关键的转录因子，它们 调控多种成骨基因的表达，决定着m s c s 向成骨细胞分化【2 0 , 2 2 1 。 浙江大学硕l ：学位论文 1 1 5m s c s 的应用前景 干细胞研究在近几年来已经成为全球生命科学研究领域的一大热点和前沿， 它探讨细胞如何发育成为有机体以及健康细胞如何替换体内受损细胞的相关机 制。干细胞不仅可应用于细胞疗法，还可应用于新药物、毒素筛选，以及进一步 了解出生缺陷等。由于m s c s 具有来源方便、扩增迅速、可塑性强、离成熟细胞 近和多向分化潜能，而且还可以实现个体化治疗、无免疫排斥问题和伦理之争等， 因此是最具有临床应用优势的种子细胞，在创伤修复、组织或器官重建、退行性 疾病、遗传性疾病、抗肿瘤、抗衰老等方面具有广阔的应用前景。 例如，将m s c s 直接植入骨或软骨缺损处，发现能分化为骨细胞、软骨细胞， 加速骨修复的能力。给胫骨肌肉损伤的免疫缺陷小鼠移植l a c z 基因标记的小鼠 骨髓，在损伤部位可检测到d 一半乳糖苷酶阳性的细胞，说明m s c s 参与肌肉的 再生过程 2 】。在体外诱导m s c s 分化为心肌细胞，将其植入心肌坏死的疤痕区， 发现可重建心肌，增强疤痕区张力，提高心功能 7 】。将m s c s 植入肝损伤的小鼠 体内，发现其可以参与肝损伤修复，明显的改善肝的纤维化等症状 1 】。 虽然在m s c s 的研究与应用方面已取得了很大的进展，但依然存在一些问 题：( 1 ) 目前m s c s 仍没有高特异性的表面分子标志，难以得到高纯度的m s c s 群体；( 2 ) 体外培养的m s c s 会出现老化并丧失分化能力，难以获得组织工程 所需要的种子细胞的数量；( 3 ) m s c s 分化调控的机制仍不明确，难以控制m s c s 向准确的细胞类型分化；( 4 ) 体外培养m s c s 用于体内移植时，m s c s 有可能 分化为其它细胞并出现免疫排斥反应。具体到m s c s 的诱导成骨特性，其诱导分 化成骨的机制、免疫表型与功能之间的关系以及各诱导因子发挥作用的机制仍未 完全阐明，解答这些问题需要对m s c s 做更深入的研究，同时，完善m s c s 修复 骨、骨软骨缺损的理论及方法，最终实现临床应用仍尚需大量的基础和临床研究。 1 2 d n a 甲基化与干细胞分化 1 2 1 表观遗传与d n a 甲基化概述 在基因组中除了d n a 和r n a 序列以外，还有许多调控基因的信息，它们 虽然本身不改变基因的序列，但是可以通过基因修饰、蛋白质与蛋白质、d n a 和其它分子的相互作用，而影响和调节遗传基因的功能和特性，并且通过细胞分 裂和增殖周期影响遗传，这就是表观遗传 ( e p i g e n e t i c s ) 。表观遗传学是阐明基 4 浙江人学硕 学位论文 因组功能及基因表达调控的新研究领域，是现代分子生物学研究的重要课题之 一，其研究的主要内容是d n a 的甲基化以及染色质的物理重塑和化学修饰。因 此，它是一类高于基因水平的基因调控机制，是将基因型与表型联系起来的一条 纽带。它不仅对基因表达、调控及遗传有重要作用，而且在肿瘤、免疫等许多疾 病的发生和防治中亦具有十分重要的意义 2 3 】。它是生命科学中近年来的一个突 出进展，具有十分广泛深刻研究和应用前景。 d n a 甲基化广泛存在于细菌、植物和动物中，是d n a 的一种天然的修饰方 式。在真核生物中，甲基化只发生在胞嘧啶第五位碳原子上，是由d n a 甲基转 移酶所催化，以s 一腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶上，生成 5 甲基胞嘧啶的一种反应 2 4 】。在哺乳动物中，d n a 甲基化主要发生在c p g 双 核苷酸序列的胞嘧啶上。它不仅可影响细胞基因的表达，而且这种影响还可随细 胞分裂而遗传并持续下去 2 5 】。d n a 甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚 胎发育、细胞分化x 染色体失活以及肿瘤发生等生命活动过程起着重要作用 【2 6 ，是目前新的研究热点之一。 1 2 2d n a 甲基化的形成机制 d n a 甲基化是d n a 甲基转移酶将s 腺苷甲硫氨酸的甲基转移给胞嘧啶的 过程，其反应过程包括：识别目标胞嘧啶，并将其移入催化袋内，酶的催化结构 域中的半胱氨酸残基与胞嘧啶环上的第六位碳原子( c 6 ) 形成共价中间体，破 坏整个碱基的芳香环构型，从而使第五位的碳原子( c 5 ) 活化，在酶的催化下， 把s a m ( s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e ，s 腺苷甲硫氨酸) 的甲基转移到胞嘧啶的c 5 上， 随后胞嘧啶c 5 的质子被释放，c 6 的共价键断裂，同时s a m 转变成为 s a h ( s a d e n o s y l h o m o c y s t e i n e ，s 一腺苷高半胱氨酸) 2 4 】。至此，胞嘧啶的甲基化 修饰就基本完成。 根据作用方式和参与反应的酶的不同，甲基化反应可分为两种：维持甲基化 ( m a i n t e n a n c em e t h y l a t i o n ) 和从头甲基化( d en o v om e t h y l a t i o n ) 2 7 ，2 8 。前者 与d n a 的复制相关联，当被甲基化的双链d n a 复制后，在生成的两条新的d n a 链中，只有亲代链是甲基化的，而新合成的子代链是非甲基化的。d n m t l ( d n a m e t h y l a t i o n t r a n s f e r a s e1 ，d n a 甲基化转移酶1 ) 以非对称甲基化d n a 为底物， 识别新生成的d n a 双链中亲代单链上已经甲基化的c p g 位点，然后催化互补单 浙江人学硕二i j 学位论文 链相应位置的胞嘧啶( c ) 发生甲基化，以维持甲基化。从头甲基化则是对d n a 上甲基状态的重新构建，它不依赖d n a 复制，在完全去甲基化的位点上引入甲 基，是建立甲基化的机制。一般认为，维持甲基化主要参与的分子是d n m t l ， 而从头甲基化则依赖于d n m t 3 a 和d n m t 3 b 的活陛 2 8 1 。但是最近的研究表明， d n m t 3 a 和d n m t 3 b 也参与了维持甲基化的过程，可以增强d n m t l 所介导的 甲基复制的保真度。而d n m t l 在体外也可以参与从头甲基化，只是活性较低， 但在体内研究中还没有明确的结论。同时，这三种甲基转移酶对个体发育也都是 不可缺少的，d n m t l 。和d n m t 3 b 乒同源缺失的小鼠胚胎往往在出生前死去，而 d n m t 3 a 4 的个体在出生后四周内死亡。这也证实了d n a 甲基化在正常细胞生 长发育中有着极其重要的作用【2 9 。 1 2 3d n a 甲基化与基因表达调控 一般说来，d n a 甲基化与基因表达呈负相关，但不同区域d n a 的甲基化对 基因表达的影响却差异很大，而基因组中5 甲基胞嘧啶的分布也不均匀。在哺乳 动物中，d n a 甲基化主要发生在c p g 双核苷酸序列的胞嘧啶上，而c p g 出现 的概率和分布却不是随机的 3 0 1 。由于d n a 是由腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、 胸腺嘧啶( t ) 和胞嘧啶( c ) 四种碱基组成的，因此就有1 6 种二核苷酸组合方 式：a a 、t t 、c c 、g g 、a t 、t a 、t c 、c t 、g c 、c g 、a c 、c a 、t g 、g t 、 g a 、a g 。如果d n a 中二核苷酸出现的频率是随机的，那么每个二核苷酸在任 意一段序列中出现的概率应是1 1 6 ( 即6 2 5 ) ，但事实上c p g 二核苷酸在人 类基因组中的含量很低，小于l ，而不是平均的6 2 5 ，这种现象称为c g 抑 制 3 1 1 。产生这种现象的原因与甲基化胞嘧啶较高的突变率有关，例如5 甲基胞 嘧啶容易脱氨基转变为胸腺嘧啶t ，从而导致了部分c g 突变形成t g ，而t 本 身就会存在于d n a 中，因此不易被修复。哺乳动物基因组中，约7 0 一8 0 c p g 被甲基化，并常发生在重复序列区域。在某些区域中，c p g 位点出现的密度较 高，这些区域大约有3 0 0 3 0 0 0 b p ，其c p g 的含量可以达到预计的平均值( 6 2 5 ， 又称期望值) ，甚至超过期望值的5 倍以上，这些区域在基因组中约占1 ，被 称为c p g 岛。c p g 岛的定义指长度大于等于5 0 0 b p ，g c 的含量大于等于5 5 ， c p g 二核甘酸的实际观察值与期望值之比大于等于6 0 的d n a 片段。c p g 岛之 所以能够逃避c g 抑制现象，主要是因为它们的胞嘧啶是非甲基化的，因此较少 浙江人学顾i j 学位论文 有突变。研究发现，这些区域与基因的启动子区有着密切的关系。大部分c p g 岛位于基因的5 端，包括基因的启动子区域和第一外显子区，而且超过6 0 的 人类基因组的启动子区都含有c p g 岛，这暗示它们在基因表达调控中可能发挥 着重要的作用。另外，d n a 复制起始点也往往与c p g 岛位置相互重合，但是其 具体的生物学意义尚待研究3 0 。 研究表明，绝大多数c p g 岛都处于基因启动子区和第一外显子区，且是非 甲基化的，一旦c p g 岛被甲基化，则基因沉默。例如肿瘤细胞中部分抑癌基因 启动子区的c p g 岛出现高度甲基化而使抑癌基因沉默 3 2 】。当用甲基转移酶抑制 剂5 - a z a 处理肿瘤细胞抑制其甲基化，可以导致原先甲基化的基因再表达【3 2 】。 同时，d n m t l 4 小鼠胚胎可以再表达很多基因，包括通常静止的一些印迹基因， 大量存在但通常抑制的内源性的逆转录病毒序列等，而在杂合性的同窝出生的小 鼠中，这些基因是甲基化并且不表达的，证明d n a 甲基化确实引起基因沉默 3 3 1 。 但最近的研究显示，d n a 甲基化对基因表达的调控与甲基化c p g 的密度密 切相关。在正常体细胞中，c p g 含量丰富的c p g 岛总是非甲基化的，无论基因 是否表达；于此相反，低密度的c p g 通常都是甲基化的，并不影响基因的表达； 而中等密度c p g 的甲基化程度与基因表达呈明显的负相关【3 4 。另外，r a f a e l a 【3 5 】等人的研究结果类似，他们发现c p g 岛两侧的约2 k b 以内的区域c p g 含 量适中，其甲基化程度与基因表达呈负相关，将此区域其称为“c p gi s l a n ds h o r e ”。 目前认为，d n a 甲基化对基因表达的抑制主要通过两种方式实现：一是甲 基化的c p g 直接干扰了转录因子与识别位点的结合；二是甲基化的c p g 通过甲 基特异性结合蛋白( m e t h y l c p gb i n d i n gp r o t e i n s ) 招募其他转录抑制蛋白，形成 转录抑制复合物，并使染色质紧缩而使基因沉默 3 6 】。第一种方式不具有普遍性， 因为并不是所有转录因子结合的d n a 序列都含有c p g 二核苷酸。第二种方式是 间接的，例如m e c p 2 可招募组蛋白去乙酰化酶( h i s t o n ed e a c e t y l a s e s ，h d a c ) 和组蛋白甲基化转移酶( h i s t o n em e t h y l t r a n s f e r a s e s ) 使组蛋白h 3 去乙酰化，并 h 3 第9 位赖氨酸甲基化，最终形成紧密包装的染色质结构，阻止转录因子与d n a 的结合，形成稳定牢固的沉默 3 7 】。 1 2 4d n a i 甲基化与其他表观遗传修饰的作用 组蛋白是染色体基本结构核小体中的重要组成部分，其n 一末端氨基酸残基 浙江人学硕i ：学位论文 可发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等多种共价修饰作用，是表观遗传调控 的重要形式。组蛋白修饰可通过改变组蛋白与d n a 双链的亲和性，从而改变染 色质的疏松或凝集状态，调控基因的转录；也可通过影响转录因子与相应顺式作 用元件的亲和性来发挥基因调控作用 3 8 。组蛋白修饰对基因表达的调控有类似 与d n a 遗传密码的调控作用，所以被称为“组蛋白密码”。一般来说，组蛋白 乙酰化能选择性的使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因的转 录，增强其表达水平 3 9 】。而组蛋白甲基化既可抑制也可增强基因表达，如组蛋 白h 3 k 9 ，k 2 0 ，k 2 7 的三甲基化修饰与异染色质的形成及基因抑制相关，而组 蛋白h 3 k 4 ，k 3 6 ，k 7 9 的三甲基化修饰则与基因激活相关 3 7 】。 当前的研究表明，d n a 甲基化与组蛋白修饰存在相互作用，如甲基化的d n a 可通过甲基结合蛋白m e c p 2 招募组蛋白甲基转移酶s e t ，引起h 3 k 9 甲基化， 抑制基因转录 4 0 】；催化h 3 k 2 7 甲基化的复合物e z h 2 可与d n a 甲基转移酶结 合，引起相应位点d n a 的甲基化，即组蛋白甲基化引起d n a 甲基化。同样甲 基化的c p g 还可通过m e c p 2 招募组蛋白去乙酰化酶h d a c ，引起组蛋白去乙酰 化，恢复核心组蛋白与d n a 紧密结合，并招募异染色质蛋白h p l 、染色质重塑 复合物s w i s n f 等，介导异染色质的形成，阻碍基本转录单位蛋白质复合物进 入启动子结合位点，导致基因沉默 2 7 ，4 1 。 1 2 5d n a i 尹基化与干细胞分化 干细胞在相对静息的状态下也受到环境因素的影响，环境的改交往往会引向 表观遗传的变化，细胞的状态也会随之改变。表观遗传学是环境与遗传之间的桥 梁。近年来，表观遗传调控的干细胞分化机制，已成为研究热点和前沿领域 【4 2 - 4 4 。 d n a 甲基化是表观遗传研究的重要内容，其在细胞分化中也扮演了重要的 角色。细胞分化的方向由组织特异性基因的特异表达决定，而d n a 甲基化参与 基因的特异表达调控，使细胞向特定的方向分化，形成不同的组织器官，促进个 体的生长发育。研究表明胚胎干细胞的甲基化图谱与正常体细胞存在很大差异， 胚胎干细胞的分化通常伴随d n a 甲基化的改变，部分基因由非甲基化变为甲基 化，部分基因由甲基化转变为非甲基化，证明d n a 甲基化参与干细胞分化的调 控。 浙江人学顾：学位论文 2 实验研究 2 1 引言 干细胞分化的过程受到复杂的调控，且总是伴随不同基因的激活与关闭，而 表观遗传修饰是调控基因激活与关闭的重要方式，因而在于细胞分化过程中起重 要作用。近年来，表观遗传调控的干细胞分化机制，已成为研究热点和前沿领域 【4 2 4 4 。d n a 甲基化是表观遗传研究的重要内容，其在细胞分化中也扮演了重 要的角色。已有研究表明胚胎干细胞的分化与d n a 甲基化相关，胚胎干细胞的 d n a 甲基化修饰与体细胞存在很大差异，胚胎干细胞的分化通常伴随的改变， 证明d n a 甲基化参与干细胞分化的调控 4 5 】。但d n a 甲基化是否参与成体干细胞 分化还不得而知。本研究p j , m s c s 成骨分化为模型，探讨了d n a 甲基化对m s c s 成骨分化的作用。我们利用d n a 低甲基化试剂5 - a z a 处理m s c s ，然后再对其进 行成骨诱导分化，从成骨特异基因的表达、a l p 活性、钙结节形成等几个方面进 行了成骨分化鉴定，并对m s c s 的d n a 进行了甲基化分析。实验结果证明1 0 州 的5 - a z a 可降低基因组水平d n a 的甲基化程度，同时促进m s c s 向成骨细胞分化， 表明d n a 甲基化状态的改变会影响成体干细胞的分化。 本研究首次探讨了d n a 甲基化对成体干细胞分化的影响，并初步揭示了 d n a 甲基化调控m s c s 成骨分化的原理。同时，我y f * j 用5 - a l z a 建立了m s c s 向成 骨细胞分化的高效诱导体系，可为骨组织工程提供种子细胞治疗骨骼疾病。 2 2 实验材料 2 1 1 实验动物3 4 周龄的雄性i c r , 鼠，体重2 0 士2 9 ，购自浙江省医学科学院实 验动物中心。 2 1 2 引物引物由i n v i t r o g e n 公司上海分公司合成。 2 1 3 试剂和试剂盒 d n at a q 酶、p c rb u f f e r 、d n t p 、d n am a r k e rd l 2 0 0 0 、d l l 5 0 0 0 、t r i z o l 试 剂盒、逆转录试剂盒、t 4d n a 连接酶、p u c m - t 载体、限制性内切酶m s p i 、h p a l i 和d n am a r k e r 购于t a k a r a 公司；n a h s 0 3 、凝胶回收试剂盒、氨苄青霉素、l b 液体和固体培养基粉剂购自上海生工生物工程有限公司。胎牛血清( f e t a lb o v i n e 9 浙江人学硕士学位论文 s e r u m ，g i b c o ) 、i m d m 培养液( i s c o v e sm o d i f i e dd u l b e c c o sm e d i u m ，g i b c o ) 购于i n v i t r o g e n 公司上海分公司；a l p 检测试剂盒购自上海西宝生物科技有限公 司。 2 1 4 仪器设备 低温高速离心机购自s i g m a z , k 司；常温离心机e p p e n d o r f 公司的5 4 1 8 ；p c r 仪t h e r m a lf o 彻a 公司( 均p t c 1 0 0 ；凝胶成像系统为柯达i 均g e ll o g i c2 0 0 ；二 氧化碳培养箱购自t h e r m of o r m a 公司；倒置相差显微镜购自z e i s s 公司。 2 3 实验方法 2 3 1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养 i c r d x 鼠断颈处死，无菌条件下取股骨和胫骨，剔除脂肪和肌肉，用i m d m 培养液反复冲洗骨髓腔，1 0 0 目滤网过滤后置于无菌离心管中，1 0 0 0 叩耐m i n 离心 5 m i n ，弃上清，加入含1 0 f b s 的i m d m 制成细胞悬液，取少许细胞进行计数， 其余细胞用含有1 0 f b s 的i m d m 培养液混匀后，按5 x 1 0 6 m l 细胞密度接种在 t 一1 7 5 塑料培养瓶中，置3 7 。c ，5 c 0 2 培养箱中培养，2 4 h 后换液，除去未贴壁细 胞。当原代培养的细胞生长到约9 0 融合时，用0 2 5 胰蛋白酶3 7 。c 消化5 m i n ， 加入含1 0 f b s 的培养基中和，用吸管轻轻吹打细胞，直到贴壁细胞悬浮。按l ：2 进行传代培养，并记为p 1 代。传代培养过程中每3 天更换一次培养液，直至贴壁 细胞生长到约9 0 融合时，用0 2 5 胰蛋白酶消化贴壁细胞，按合适的接种密度 进行下一代传代接种培养，并记为p 2 代，余类推。实验采用p 3 至p 5 代细胞。 2 3 2m s c s 的鉴定 2 3 2 1m s c s 形态学鉴定( 多分化潜能鉴定) 每天用相差显微镜观察培养细胞的形态变化并做实验记录。 2 3 2 2m s c s 表面分子标记鉴定 a 收集细胞 0 2 5 胰蛋白酶消化贴壁细胞，培养基中和后转移至1 0 m l 离心管中， 1 0 0 0 印“m i n 离心5 分钟，弃上清收集沉淀细胞。 b 荧光标记的单抗体染色 浙江人学硕：i j 学位论文 将收集的细胞悬浮于p b s 中，调整细胞密度为5 8 x 1 0 6 m l ，以每管l m l 的量 分装于1 5 m l 离心管中，2 0 0 0 叩m m i n 离心5 m i n ，弃上清，每管分别加入1 0 0 lp b s 重悬细胞，再分别加入荧光标记的大鼠抗小鼠抗体：f i t c 标记的c d l l b 、c d 4 5 ， p e 标记的c d 4 4 、c d 7 3 、c d 9 0 和s c a 1 抗体，3 7 4 c 避光孵育3 0 m i n 。孵育结束后， 用l m lp b s 悬浮细胞，2 0 0 0 印m m i n 离心5 m i n ，弃上清；再重复一次，洗去未与细 胞结合的抗体。最后将细胞悬浮与l m lp b s 中，用流式细胞仪检测。p e 、f i t c 的 激发光都选择波长为4 8 8 n m 的蓝色激光，发射波长是5 7 8 n m 和5 1 9 n m ，分析计数 1 0 0 0 0 个细胞。 2 3 35 - a z a 对细胞活力影响分析 2 3 3 1 细胞计数法检测5 a z a 对细胞活力影响 ( 1 ) 收集对数期m s c s ，调整细胞悬液浓度并接种于9 6 孔培养板；2 x 1 0 3 细胞 孔，每孔1 0 0 1 t l 培养液，3 7 。c ，5 c 0 2 培养箱中培养过夜。 ( 2 ) 加入不同剂量的5 - a z a ，使终浓度分别为0 ，2 5 ，5 ，1 0 ，2 0 ，4 0 ，8 0 ，1 2 0 和1 6 0 0 m ，每个浓度5 个复孔，继续培养2 4 h 。 ( 3 ) p b s 洗去非贴壁细胞，用0 2 5 胰蛋白酶消化贴壁细胞，细胞计数板计数。 2 3 3 2m t t 法检测5 a z a 对细胞活力影响 ( 1 ) 收集对数期m s c s ，调整细胞悬液浓度并接种于9 6 孔培养板；2 x1 0 3 细胞 孔，每孔1 0 0 肛1 培养液，3 7 。c ，5 c 0 2 培养箱中培养过夜。 ( 2 ) 加入不同剂量的5 - a z a ，使终浓度分别为0 ，2 5 ，5 ，1 0 ，2 0 ，4 0 ，8 0 ，1 2 0 和1 6 0 g m ，每个浓度5 个复孔，继续培养2 4 h 。 ( 3 ) 每孔加入2 0 9 l5 m g m l 的m t t 溶液，继续培养3 小时。 ( 4 ) 小心吸出孔内培养液后，每孔加入1 5 0 1 a l 二甲基亚砜( d m s o ) ，置摇床 上低速振荡1 0 m i n ，使结晶物充分溶解。 ( 5 ) 在酶联免疫检测仪o d4 9 0 n m 处测量各孔的吸光值。 2 3 4 体外诱导m s c s 分化成成骨细胞 将分离培养的m s c s 根据需要接入孔板或细胞瓶( 2 4 孔板接种密度为1x 1 0 4 ； 6 ：t l 板接种密度为5 1 0 4 ；f , ；细胞瓶的接种密度为2 x 1 0 5 瓶) 。( 1 ) 正常培养的对照 组：用含1 0 f b s 的i m d m 培养液培养，加入1 0 n m 地塞米松( d e x a m e t h a s o n e ) ， 5 0 e d m l 维生素c ( a s c o r b i ca c i d ) 以及1 0 m md - 甘油磷酸钠 浙江人学颂i ：学位论文 ( 1 3 - g l y c e r o p h o s p h a t e ) ，配制成普通的成骨细胞条件诱导液诱导m s c s ；( 2 ) 5 a z a c 预处理组：在m s c s 长至5 0 融合时，分别用1 0 ，2 0 ，4 0 t m5 - a z a c 处理m s c s2 4 h ， 再进行正常成骨诱导，每周换液两次，共诱导1 4 d 。 2 3 5 成骨细胞分化的鉴定 2 3 5 1 形态学观察： 每天用相差显微镜观察培养细胞的形态变化并做实验记录。 2 3 5 2 成骨细胞特异基因表达的r t p c r 检测 a 总r n a 提取： ( 1 ) 将细胞p b s 洗1 次。 ( 2 ) 在细胞瓶中加入t r i z o l1m l 。 ( 3 ) 用枪反复吹打3 0 次左右( 静置5 m i n ，将裂解液转移入离心管) 。 ( 4 ) 加入氯仿( 2 0 0 p 1 ) ，盖紧离心管盖，用力震荡( 氯仿沸点低、易挥发， 振荡时应小心离心管盖突然弹开) 。待充分乳化溶液呈乳白状( 无分相现 象) 后，室温静置2 3 m i n 。 ( 5 ) 1 2 ，0 0 0 9 ，40 c 离心1 5 m i n ，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为 三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。 吸取上清液转移至另一新的离心管中( 切忌吸出白色中间层) 。 ( 6 ) 向上清中加入5 0 0 1 a l 的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静 置1 0 m i n 。 ( 7 ) 1 2 ，0 0 0 9 ，4 c 离心1 0 m i n ，收集沉淀。 ( 8 ) i x i 心 弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入7 5 的乙醇l m l ( 切勿触及沉淀) ， 轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，1 2 ，0 0 0 9 ，4 c 离心5 m i n 后小心弃去乙醇 ( 为了更好地控制r n a 中的盐离子含量，应尽量除净乙醇，可以再次 1 2 ，0 0 0 9 ，40 c 离心l m i n 用移液枪吸去乙醇) 。 ( 9 ) 室温干燥沉淀2 5 m i n ，加入适量的d e p c 水溶解沉淀，必要时可用移液 枪轻轻吹打沉淀，待r n a 沉淀完全溶解后于8 0 。c 保存。 ( 1 0 ) 取出少量用于紫外分光光度计测定样品r n a 的质量，测o d 2 6 0 和 o d 2 8 0 ，计算o d 2 6 0 o d 2 8 0 ，比值在1 8 2 0 之间为佳。r n a 总量( i t g m 1 ) 浙江大学硕士学位论文 = o d 2 6 0 x 4 0 x 稀释倍数。经变性琼脂糖凝胶电泳，确定抽提r n a 的完整 性。 b 反转录合成c d n a ( 1 ) 取出r n a 模板，1 0 x r tb u f f e r ，d n t p s ，r n a s ef r e eh 2 0 。 ( 2 ) 在冰盒中按下列组成配制反应液，反应体积为1 0 t l ，r n a 模板量为l “g 。 5 x r tb u f f e r 2 9 l d n t pm i x t u r e ( 各10 m m ) 1 l