（运动人体科学专业论文）急性长时间离心运动诱导大鼠骨骼肌tnfα表达的机制研究.pdf

添加 个人信 息 北 京 体 育 大 学 博 士(毕 业 ) 学位 论 文 / 、l 戒j ， 1 1 1 . . 口护小( l l n 一1 1 1 . 目当汾洲j. ”卜 尸己自. 1 口1 1 浩叮从仆 之比. . 、 、勺叼以 急 性 长 时 间离 心运 动 诱 导 大 鼠 骨 骼肌 t n f 一 a 表 达 的机 制研 究 me e h an ism s o f a e u te p ro lo n g e d e ee e n trie e x e rc ise in d u e ed t n f 一 a e x p ressio n in r a t s k ele tal mu se le 培 养 单位 :北 京体 育 大 学 一 级 学科 : 体 育 学 二 级 学科 :运 动人 体 科 学 研 究方 向:运 动氧 化 应 激 研究生 : 廖 鹏 指 导教 师:张 勇 二 0 0 七 年 五 月二 十八 日 论 文随 机验 证 编 号 : b 1 2o0 75283 16 1 ; 1 ， 533424 北京体 育大学 学位论文版权使用授权书 本人完全 了解学校有关保 留、使用学位论文 的规定，同 意学校对本人递交的学位论文 急性长时间离心运动诱导大 鼠骨骼肌 tn f一 。表达的机制研究 保 留并 向国家有关部 门或 机构送交论文的复印件和 电子版 ，允许在校 内和与学校有协 议的部 门公布论文并被查阅和借 阅。 本人授权北京体育大学可 以将本学位论文 的全部或部分 内容 编入有关数据库进行检索 ，可 以采用影 印、缩 印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文 。 保密 团，在 3 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密 冈。 (请在 以上方框 内打 “了” ) 学位论文作者签名 : 咖心 日期 : 二 0 0 七年 五 月二十 八 日 沦文 随机验 证 编 号: bt20075283 16 14.邪 3424 北京体 育大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 本人所呈交 ( (急性长时间离心运动诱导大 鼠 骨骼肌 t n f一 q 表达 的机制研究是本人在导师的指导下，独立进 行研 究工作所取得 的成果 。除文中 己经注 明引用的内容外 ，本论 文不包含任何其他个人或集体 己经发表或撰写过的作品成果 。对 本文的研究做 出重要贡献的个人和集体 ，均 己在文中以明确方式 标 明并致谢 。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 。 学位论文作者签名 : 日期 : 二0 0 七年五月二十八 日 论文 随 机验 证 编 号 : 日 12() ( )75283 16 14.533424 北京体育大学 博 分学位论文 主要缩略词表 缩略词英文全称中文全称 a 20 zine f inger protei n a zo锌指 蛋 白 a 20 舒 2 aeti vatorprotei n一 1激活 蛋 白 1 从 n a n kyri n r e peat s dom ain锚蛋 白重复结构域 d v l deep por*ion of vastus lat eralis股 外侧肌深层 e i ubiqui ti n一 aetivati ng enzym e泛 素活化酶 ez ubi qui ti n一 eon j ugati ng enzym es泛 素结合酶 e3 ubiquiti n一 pr o t ein li gati ng enzym es泛 素连接酶 em sa o el el eetr o m obi lit y shi r t ana一 ysis凝胶 电泳迁移试验 e r k extraeel lular一 si gna一 regulat ed pr o tein ki nase细胞外信号调 一 ， 激酶 o a s gastroenem ius川 卜 肠肌 idl i nhi bit ors of di f f e renti ati on l分化抑制 因子 l ik k 1 kappa b ki nase 1 kappa b 蛋 白激酶 i虑i nhi bit or kappa b n f仗 b 抑制 因子 m po m yel operoxi dase髓过氧化物酶 n 邵nuel ear ex卯rt si gnal核转 出信号 n 邵nuel ear exp o rt si gnal核移 出信号 n fkb nuel ear r a ct or kappa b核 因子 出 n ik n f火 b一 i nduei ng ki nase n fkb 诱导激酶 n l s nuel ear loea一 i zat ion si gnal核 定位信 号 pb s phosphat e buf f e red soluti on磷酸盐缓冲液 pn o f plat elet deri ved grow th f a etor血小板趋 化 因 子 pd t e pyr mlidine dit hi oearbam at e毗 咯烷 二硫 氨 基 甲酸酷 pm sf phenylm erhysu一 f o ny一 n uoride苯 甲基硫 酞 氟 化物 r h d r el hom ology dom ain r el 同源 结构域 工气 d transaet ivati on dom ai n反式激活结构域 翎 f - a t um or neerosis f a etor alpha肿 瘤 坏 死 因子 a 片 北京 体育人学博十学位论文 摘要 目的 : 1 )探讨急性长时间离心运动诱导大 鼠骨骼肌 tn f吸 表达 的机制 ; 2 ) 揭示急性长时间离心运动前后血清 t n f一 a 含量与骨骼肌损伤程度和氧化应激 的关 系。 方法 : 3 月龄健康雌性 sd 大鼠 3 0只随机分为 5 组 ，每组 6 只 ，分别于 电 动跑台以 25m /m i n ，一 10 坡度运动。以运动前安静状态 (rest )、运动 1 小时 (ex lh )、运动 2 小时 (e xzh )、运动 2 小时后 6 小时 (exzh+6h ) 和运动 2 小 时后 24 小时 (e xzh+24h ) 为实验观测记录点 。1 0 % 水合氯醛麻醉后活杀动物 ， 取股动脉血清、胖肠肌 (g a s ) 、深层股外侧肌 (d v l ) 一 80 0 c 保存。 结果 :1)g a s 自exlh 至 e xzh+24h、 d v l 自e xzh 至 e xzh+24h t n f一 a m r n a 表达 量逐渐 增 高; 2 )运动骨骼肌 自 e x l h 至 e x z h+24h in f一 a 蛋 白量逐渐增 加 ; 3 ) e xih、exzh 和 公 zh+24h o a s 和 n v l p65 核蛋 白表达 均较 r e st 显著提 高 ; 4 ) exl h 、exzh 大 鼠 g a s 和 d v l 顺乌头酸酶活性显著低于 r e st 大 鼠，随后 在 exzh+6h 开始提高，最终在 exzh+24h 完全恢复至安静水平; 5 ) exzh+24h 组大 鼠 g a s 和 d v l 姚o :含量 、m po 活性均较 r e st 显著提高; 6 )各实验观 测 点运动骨骼肌 m n一 so d 活性无显著性变化 ; 7 )形态学 改变 (h e 染色 ) 表 明 随运动和运动后时间延长 ，骨骼肌 间质血管扩张充血 ，纤维组织增生 以及变性 坏死逐渐加重 ，炎细胞浸润逐渐增 多; 8) exzh、exzh+6h 以及 exzh+24h 组血 清 in f一 a 、m d a 浓度 以及 c k 活性均较 r e st 显著提 高且呈逐渐 增 高趋势 ; 9 ) 本研 究测 定范 围 内，血清 t n f一 a 含量与 m d a 含量 、c k 活性均呈显著 正相 关 。 结论 : 1 )急性长 时间离心运动在运动过程及运动后可持续诱导大 鼠骨骼 肌 t n f一 a m r n a 、蛋 白表 达 ; 2 )骨骼肌 t n f一 a 表达 可 能通过运动 过程 中 n fkb 的两阶段 活化 触 发 ; 线粒体 0 2一 合成增 多可能诱导 n f虑 在运动过程 中的第一 次活化 : n fkb 首次活化诱 导的 t n f一 a 以及运动骨骼 肌 延迟性呼吸爆 发可 能 是 n f虑 在运动后 24 小时第二次活化的原因。3 )骨骼肌 t n f一 a 表达 可能在离 心 运 动诱 导的骨 骼肌 炎症 、氧化应激损伤 以及氧化还 原稳态 调节过 程 中发挥重 要 的介 导作用 。 关键 词 : t n f一 a : n fkb ; 骨骼 肌 : 大鼠; 急性长 时 间离 心运动 论文随机验证编号 : bt200742352i529.533424 北京 体育大学 博 :爹位 论文 a b s t r a c t t h e m ain p u rp o se o f the p resen t stu d y 15 to in v estig ate the m ech an ism s o f t n f 一 a ex p ressio n in rat skeletal n lu scle in resp 0 nse to an acu te b o u t o f p ro lo n g ed eeeentrie ex ereise. a seeo n d ary p u r p o se o f th is stud y 15 to inv estig ate the relatio n sh ip b etw een ser u m t n f 一 a resp o n se an d sk eletal m u sele m eeh an ieal an d o x id ativ e d am ag e m eth o d s: t h irty th ree一 m o n th o ld f e m ale s p ragu e一 d a wley rats w ere rando m ly di vi ded into the f o ll ow i ng f ive g r oups (n =6): ran at 25 m /m i n， 一 10%grade on the treadm ill f o r lh (exlh) or zh (e xzh) and w ere kill ed i m m edi ately; ran on the treadm il l f o r zh and w ere kill ed at 6 h (exz+6h) or 24h (e xz+24h) af t er exercise:or kill ed at rest as eontrol s (r e st). a fter anaesthesia by in j eetion of 10%chloral hydrate， t he ser u m ， deep porti on of vastus l at eralis (d v l ) and gastr o enem ius (g a s) m u seles o f th e rats w ere co lleeted an d f r o zen at 一 800c . r esult s: l) t n f一 a m r n a l evel s show ed progressi ve i ncr e ases af ter exercise in g a s o f e x lh ，e x z h ，e x z + 6 h an d e x z + 2 4 h rats，an d in d v l o f e x z h ，e x z + 6 h an d exz+24h r a t s. 2) b oth g a s and d v l t n f一 a protein levels show ed pr o gressi ve i nereases in e xlh， exzh， e xz+6h and exz+24h.3) p65 protein l evel s in the g a s and d v l n u clear ex traetio n w ere sig n if i ean tly h ig h er in e x lh ，e x z h an d e x z h + 2 4 h rats eo m p ared to r est rats.4 ) m ito eh o n d rial aeo n itase activ ity sh o w ed p ro g ressiv e d eelin e in g a s an d d v l o f e x lh an d e x z h eo m p ared w ith r est， b u t w as elev ated in e x z + 6 h and retum ed to r e st levels at e xz+24h.5) g a s and d v l h 20 2 c o neentrations and m po aetivities w ere signif i cantly higher i n exz+24h rats vs. r e st rats. 6) d uri ng an d af t er ex ercise，th ere w ere n o sig n if i can t eh an g es in m n 一 s o d activ ity in g a s o r d v l . 7) d uri ng and af ter exer e i se，the m agni tude of bl ood vessel s hyperem i a， eo n n ectiv e tissue h y p er p lasia ， m u se le f i b er n eero sis an d in f l am m atio n eell in f i ltratio n show ed pr o gressive aggravation. 8) serum eoneentrations of t n f一 a and m d a ， and c k aetiv ity w ere sig n if i ean tly h ig h er in e x z ，e x z + 6 h an d e x z + 2 4 h rats，eo m p ared w i th r e st rats.9) in the testing range of this study ， serum c o ncentrati ons of t n f一 a sho w ed sig n if i cant p o sitiv e eo r r elatio n s w ith c k aetiv ity an d m d a lev el. c onclusions: l) a eute prol onged eecentrie exereise ean i nduee t n f一 a m r n a and protein expression i n rat skeletal m usele.2) t he inereased t n f一 a expressi on 1 5 p ro b ab ly trig g e red b y n f k b ae tiv atio n b y e lev ated r o s p ro d u etio n in a b ip h asie 论文随机验证编号: bt 2 00742352152 9 .533424 石 北京体育大学 博 日沂 位 沦文 m ann er . inereased m itoeho nd rial 0 2一 d urin g ex ereise can ex p lain th e first p h ase， w hereas th e inereased d e no v o ex p ressio n o f t n f a an d elev ated h zo z d u rin g respi ratory burst ean explai n the seeond phase. 3) t he obser v ed upregulati on of t n f 一 a m ay p lay an im p o r t an t ro le in th e in f l am m ato ry resp o n se o f sk eletal m u se le to m ech an ieal an d o x idativ e dam ag e and f o r th e m ain ten an ee o f o x id an t一 an tio x id ant h o m eo stasis. k ey wor ds: t n f 一 a : n f 沼 ; skeletal m u scle : rat: aeu te pro lo n ged eecen tric ex er e ise 论 文随 机验证编粤 : bt z 。 。 742352152 9 .533424 气 / 急性 长时间离心运动诱 导 人鼠骨骼叭tnf一 。 表达 的机制研究 目录 1 前言 . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一3 - 2 文献综述 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 6 - 2.1 运 动 中 自由基 的生成途 径 . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一6 - 2 . 2 运动 中 自由基 的清 除途 径 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .一8 - 2. 3 氧化 还 原稳态 及其 意义 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一1 2- 2. 4 剧烈运动 时细胞氧化还原稳态亲氧化改变介导的 n fkb 信 号 . . . . . . 一16 - 2. 5 n fkb 汀n f一 a 信 号介导不适宜剧烈运动伴随的骨骼肌蛋 白消耗 . . . . 一23 - 3 材料与方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 2 8- 3.1 实验 材料 . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一28 - 3.1.1 实验动物 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . ， . ， . . . “ . . ， 一 2 8- 3.1. 2 土 要 试剂 ， . . . . . ， . . . . . . . . . . .， . . 一28 - 3.1. 3 主 要仪 器 . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 29 - 3. 2 实验 方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . .一 30 - 3 . 2.1 运动模 型 的建立 ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 30 - 3. 2 . 2 样本采 集 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . .， . . . . . . . . ， . . ， . . . . . 一 30 - 3. 2 . 3 rl- pc r 测 定骨骼肌 t n f - a m r n a 表达 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . 一 3 1- 3 . 2 . 4 w es t em b l o t t i n g 测 定骨， 骼肌 t nf - a 蛋 白表达 ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .一3 3- 3. 2 . 5 w es t em b l o t t i n g 测 定骨 骼肌细 胞核 p 6 5 蛋 白表达 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . 一3 5- 3 . 2 . 6 骨骼肌线 粒体顺乌头酸酶相对活性测定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . .一3 6- 3. 2 . 7 骨 骼肌 h zo :含量 测 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .一3 6- 3 . 2. 8 骨骼肌 m po 活性 测 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . 一 37 - 3. 2 . 9 骨骼肌 m n一 so d 活性 测 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一3 7- 3 . 2， 1 0骨骼肌 h e 染色， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .， . . . . . . . . . . . . . . . . 一 37 - 3. 2.1 1双抗 夹心 e u sa 法测 定 血清 t n f - a 含量 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 37 - 3. 2.1 2血清 m d a 含 量 测 定 . . . . . . .， . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 39 - 3. 2.13 血清 c k 活性 测 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一3 9- 3. 3 统 计学处理 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .， . . . . . . . . . . . . . . ， 一39 - 4 实验 结果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 40 - 4.1 急性 长 时间离心 运动 前后 大 鼠骨骼肌 t n f一 a m r n a 表达 的时程变化一 40 4 . 2 急性 长 时 间离心 运 动 前 后 大鼠骨骼 肌 t n f一 a 蛋 白 含量 的时程变化 一4 1- 论 文随 机 验 证 编 号 : bt z o0 7 褪 83 1614.533424 急性长 时 间离心运 动 诱 导人 鼠骨骼 肌 rnf旧 表 达 的机 制研 究 4. 3 急性长时间离心运动前后 大 鼠骨骼肌 n fkb p6 5核蛋 白含量 的时程变化 .， .一4 2 - 4 . 4 急性长 时间离心运动 前后大 鼠骨骼 肌 线 粒体顺 乌头 酸酶 相对 活性 的 时 程变化 . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一4 3- 4 . 5 急性长时间离心运动前后大 鼠骨骼肌 h 20 :含 量的时程变化 . . . . . . . 一43 - 4. 6 急性长时间离心运动前后大 鼠骨骼肌 m po 活性的时程变化 . . . . . . . 一44 - 4 . 7 急性 长时间离心运动前后 大 鼠骨骼肌 的形态学变化 . . . . . . . . . . . . . . . . ， 一 4 5- 4. 8 急性长时间离心运动前后大 鼠骨骼肌 m n一 so d 活性 的时程变化 . 一4 5- 4 . 9 急性长时间离心运动前后大鼠血清 t n f一 a 含量的时程变化 . . . . . . . . 一4 6- 4.1 0急性长时间离心运动前后大 鼠血清 m d a 含 量的时程变化 . ， . . . . 一4 7- 4. n急性长时间离心运动前 后大 鼠血清 c k 活性 的时程变化 . . . . . . . . . . . . 一4 7- 4.1 2血清 t n f一 a 、m d a 含 量及 c k 活性 的相 关 与 回归分析 . .， ， 一4 8- 5 讨论 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 5 0- 6 结论 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 59 - 参考文献 . . . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一 61 - 附录. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .一 70 - 个人简历在读期间发表 的学术论文与研究成果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 一7 2- 论 文随机 验 证编 号 : b犯 00752毗 16 14.53洲 组 急性 长时间离心运动诱导人 鼠骨骼肌tnf一 。 表达 的机制研究 月 l j 台 长期适量的剧烈运动刺激机体特别是运动骨骼肌产生适应性变化 以提 高运 动能力 。但是急性剧烈的骨骼肌收缩又是一种炎症诱导因素，介导多种炎性介 质血液 、骨骼肌组织水平的提高t l一 ” !。值得关注的是，剧烈的，特别是重复性剧 烈运动在造成骨骼肌微损伤的同时，伴随骨骼肌细胞凋亡、蛋白合成减少、降 解增多，导致体重特别是骨骼肌组织的蛋 白净消耗 ，引起骨骼肌肌力下降、疲 劳甚至横纹肌溶解 ，其具体机制仍存在争议。 肿瘤坏死因子 (tum o:neer o sis f a et o:a ，t n f一 a ) 因早期研究发现可介导肿瘤 组 织 出血 坏 死 而 得 名 1 0 1 ， 又 因 引 起 急 、慢 性 感 染 动 物 恶 液 质 而 称 恶 液 素 (ca c he c t i n ) l 7 ， “ 。迄今的证据表明，作为多效能的促炎因子，tn f一 a 参与炎症 、 免疫 以及造血 反应等多种病理生理过程 的调节 。 对于慢性感染、充血性心力衰竭、癌症 、a i d s 等消耗性疾病 以及正常 的衰 老进程 ，动物及人体实验均证实这些病理生理过程 中血液 t n f一 a 水平和/或骨骼 肌 in f一 a 表达增多并伴随骨骼肌丢失。而针对恶液质动物模型的抗 t n f一 a 治疗 【 8一 0 1可 以减轻这些动物的骨骼肌蛋白丢失特征。这些研究提示 翎 f一 a 参与调节 骨骼肌 蛋 白合成与降解 ，是启动骨骼肌蛋 白丢失级联 的重要细胞 因子 。 骨骼肌存在 翎 f一 a 受体并可被包括 t n f一 a 在 内的炎症因子诱导! 川; t n f一 a 膜受体 (tn f recept or l，州 frx) 缺陷小鼠对癌症恶液质的抗性增加 2，提示 骨骼肌细胞也 能对 炎症反应作 出应答 。 目前 比较一致 的看法是 t n f一 a 与 t n fr i 结合后通过 多途径诱导细胞 r o s一 合成增 高 3一 6】 ，后者通过氧化修饰 活化对细胞 氧化还 原稳态敏感 的核 因子 n fkb i 7!。哺乳动物 中 n fkb 多 以 p 5 0 / p6 5异 二聚体 形式存在 ，且正常状态下在胞浆与 ikb结合处于失活状态 。胞质环境 的亲氧化 改变可通过活 化 ik k 催化 i虑 磷酸化 ， ikb 进而经泛素一 蛋 白酶体途径降解 。 n f沼 的去抑制使 p 5 0 / p6 5迅速转位入核与相关基 因启动子序列上的 出 位 点结合 ，启 动靶 基 因的表达1 1 8 】 。 t n f一 a附f忍 信号至少通过影响下游三个通路的基 因表达介导骨骼 肌蛋 白代 谢 : n f沼活 化 可 迅 速 上 调 泛 素 一 蛋 白 酶 体 途 径 的 限 速 酶 泛 素 结 合 酶 (ubi quitin一 eon j ugating enzym es，e z用be ) 以及 泛 素 连 接 酶(ubiquitin一 protein li gating enzym es，e 3川bl) 的表达i 9， 201，介导泛素与底物 蛋 白结合 ，泛素化 蛋 白 论 文随机验 证 编 号: b犯0075283 1614.533424 急性 长时 间离j 心运 动诱 导人 鼠渭 骼肌tnf一 。 表达 的机制研究 最终被 2 6 5 蛋 白酶体酶解 ，这也是运动过程 中骨骼肌 蛋 白降解的主要途径 z l 1; t nf一 a 也是 n fkb下游众 多的靶基 因之一。在各种刺激诱导下即!，n fkb上调 tn f一 a 在转录和蛋 白水平的表达 。在 以旁分泌形式释放至细胞外基质后，t n f一 a 通过靶细胞 t nfr i的结合启动膜受体介导的凋亡途径【 到。在该通路顺序活化 的 c a s pa s e一 8 还可上调 b a x 、b i d，通过线粒体膜通透性转换孔道的开放，介导 c y t c 由线粒体漏 出，启动线粒体途径凋亡 。由凋亡途径触 发活化的 c a s pa s e 3 还介导 泛 素酶 的表达 ，是 蛋 白酶 解 途 径 的早 期 事 件 曰， 到 ; 近 年逐渐 引起 关注 的是 tn f一 a加f沼 信号在成肌过程 中的抑制作用 。研究发现 n fkb 抑制肌细胞分化因 子 (m yoeyte dif f e rentiat ion f a etor，m yon ) 的表达 26， 27。m yod 又称成肌分化抗 原 (m yogenie dif f erentiation antigen )， 是成肌 调 节 因子 (m yogenie regulatory f a ctor， m r f s ) 的重要成 员 。成人 m r f s只在骨骼肌 活化 的卫星细胞 中表达 ，参与调节 静止 的肌干细胞进入有丝分裂并分化融合 为肌 管 。 m y o d 在此过程 中发挥触 发作 用1 2 8 ， “ 9。已证实 翎 f一 a肘fkb 通过在转录水平抑制 m y o d 介导各种病理 、生理 性骨骼肌萎缩过程 。 对 t n f一 a加 f虑 介导骨骼肌流失和抑制成肌作用的研 究主要集中在各种 消耗 性疾病和衰老的肌 肉蛋 白降解和萎缩领域 ，而其在运动 中的意义 目前仍不清楚。 剧烈的体力活动也可导致机体产 生类似各种病理状态 的代 谢紊乱 ，其 中包括对 运动骨骼肌各种信号转导通路的上调【 ， 30 ， 3 l。在此过程 中，运动诱导骨骼肌组织 多种信 号分子的表达 。其 中急性剧 烈运动特 别是离心运动在诱导骨骼肌 炎症反 应 的同时，伴随包括 t nf一 a 在 内的多种炎性介质血液 、骨骼肌水平的提高【 一 5!。 剧烈运动上调骨骼肌 tn f一 a 除与骨骼肌微损伤 引起 的炎症细胞侵润有关外 ，运 动本身导致 的 自由基及衍生物水平升高介导 n f沼活化进而启动骨骼肌 t n f一 a 表达也是可 能机制【 ， 3。 一 331。 急性剧 烈运动 以及 重 复性剧 烈运动也存在骨骼肌 流 失 现象 。但 与慢性 消耗性 疾病和 衰老等病理 生理 过程 中的骨骼肌流 失现象不 同 ， 急性和重复性剧 烈运动 多存在骨骼肌 微损伤 、血液肌 酸激 酶等骨骼肌 酶 的活性 提 高; 尽管 急性和 重 复性剧烈运动存 在骨骼 肌 蛋 白的净消耗 ，但重复性剧 烈运 动造成 的骨骼 肌萎缩 并不明显 。剧 烈运动造成 的骨骼肌 t n f一 a 水平提高与骨骼 肌 蛋 白消耗存在何种 关系，这种 关系与消耗性疾病及衰老进程 中 t n f一 a加 fkb 的 调节作用有 何不 同 ， 目前较少有研究关注 。 因此 ，本研 究 的 目的在 与探 讨 急性 长 时 间离 心 运 动 是 否诱 导大 鼠骨 骼 肌 tn f一 a 表达 ，其详细机制如何。在建立急性长时间离心运动诱导大鼠骨骼肌损 论 文随机 验 证编 号 : b犯0075283 16 14.5貂424 急性 长时间离j自运动诱导人 鼠骨骼肌tnf一 表达 的机制研究 伤 的运动模型后 ，我们观察 了急性长时间离心运动前后骨骼肌线粒体 o z - - 生成 速率 、骨骼肌 h zo :含量 、m po 和 m n一 so n 活性 、骨骼肌 n fkb 亚基 p65 核蛋 白表达 、骨骼肌 t n f一 a m r n a 和 蛋 白表达 以及运动骨骼 肌 形态学 的改变 。我们 设想 ，急性长时间离心运动过程 中骨骼 肌通过多途径 上调 r o s 合成 ，由其造 成 的骨骼肌细胞氧化还原稳态的亲氧化改变是 n fkb 活化并诱导 t n f一 a 表达 的先 决条件 ; 此外 ，如果 急性长 时间离心运动 诱导 了骨骼肌微 结构损伤 ，则损伤 部 位诱发 的炎症反应 以及延迟性呼吸爆发也必然对启动运动骨骼肌 t n f一 a 表达作 出贡献 。 最后， 我们还 比较 了血清 t n f一 a 含量与血清 m d a 含量和 c k 活性在 急 性长 时间离心运动前后 的变化规律 。因为如果 急性长时 间离心运动在氧化应激 与骨骼肌 炎症损伤过程 中能够诱导 tn f一 a 表达 ，则 t n f一 a 血清含量应 与氧化应 激与骨骼肌损伤的血液指标相关 。在研究 急性 长时间离心运动是否诱 导 t n f一 a 表达及其机制 的基础上 ，可 以为建立新 的骨骼肌 炎症损伤程度 评估指标提供理 论依据 ，也必然能够 为预 防和减轻剧烈运动 、临床 医学各种 消耗性疾病及衰老 导致 的骨骼肌损耗提供药物治疗靶 向。 论 文随 机验 证编 号 : b犯00752韶 16 14.533424 急性 长时间离心运动 诱导人 鼠骨骼肌丁 f一 。 表达 的机制研究 2 文献综述 2 . 1 运动 中自由基的生成途径 地球上 由厌氧微生物进化至今， 形成了种类繁多的包括人类在内的具有抗氧 化防御体系的需氧生物 。需氧生物可耐受大气 2 1 % 的氧 ，但超过这种水平生物 体就会 出现各种损伤 。临床 医学将这种现象称为氧毒性 (o xygen t o x i c i t y) 并逐 渐认识 到其主要来源 于 自由基的氧化损伤l 3 l。 由于运动伴随机体对氧 的利用率增加， 研究者开始关注此过程 中 自由基 的生 成情况 。d i n盯d 等详1 1 9 7 8年首次在人体实验中观察到急性疲劳运动后呼出气脂 质过氧化产物戊烷水平增加 。198 2年 d a v i e s 等晰】 则用 电子 自旋共振技术直接证 实急性疲劳运动可 以上调大 鼠肝脏 、骨骼肌 自由基合成 。截至 目前 的大量研 究 均证实剧烈运动确实导致 自由基合成增多。 线粒体呼吸链 线粒体呼吸链是有氧代谢的最终部位 ，同时也是氧 自由基 的 主要合成场所 。生理状态下在线粒体呼吸链 占机体 8 5 % 的耗氧 中，约 1一 5% 的氧 通过 电子漏生成 r o s团l。分子氧在细胞呼吸过程 中可分别 由复合体 i 和m 处接 受一个 电子还原生成 0 2一。后者经 m n一 so d 歧化为 h zo z，也可在金属离子存在 时再经 f e n t o n型 h a b e r 一 w ei s s反应迅速形成，o h 。由于最大运动时运动骨骼肌纤 维的耗氧量水平可提 高至安静状态的 1 0 0 倍 ，且此时呼吸链的完整性仍然存在 ， 因此一般认为线粒体呼吸链也是运动过程 中 r o s 合成的主要部位 。但是 0 2一 化 学性 质 极 为活 跃 ，其 一 旦 形成 就 成 为 自由基 反 应扩 展程 序 的一部 分 ，因而