（病原生物学专业论文）食管鳞癌dna修复酶hogg1表达的改变及其意义.pdf

东南大学学位论文独创性声明 f i l l1 ii i i iii ii i1 111 1l y 17 61812 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：撕r期：圣塑生址 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内 容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可 以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研 究生院办理。 研究生签名：主丝抽导师签名： 中文摘嘤 食管鳞癌d n a 修复酶h o g g l 表达改变及其意义 研究生：张翔 导师：高大庆 ( 东南大学病原生物学与免疫学实验室，南京，2 1 0 0 0 9 ) 中文摘要 由于各种内外因素的共同作用，基因组d n a 容易受到氧自由基的攻击而发生氧化损 伤( o x i d a t i v ed n ad a m a g e ) ，氧化损伤可导致d n a 突变的发生，8 羟基鸟嘌呤( 8 - o x o g u a n i n e ， 8 - o x o g ) 是d n a 氧化损伤的重要产物，8 - o x o g 会与腺嘌呤( a ) 和胞嘧啶( c ) 以相同的 效率进行配对，这样，经过两次复制，就会导致基因组d n a 发生g ：c - - * t ：a 颠换。f 常情 况下，机体可通过修复酶系统对d n a 突变进行修复，哺乳动物细胞内能够特异性修复 8 - o x o g 的酶，被称为8 羟基鸟嘌呤d n a 糖苷酶( 8 o x o g u a n i n ed n a g l y c o s y l a s e ，o g g l ) ， 在人体内又称为人8 羟基鸟嘌呤d n a 糖苷酶( h u m a n8 - o x o g u a n i n ed n ag l y c o s y l a s e ， h o g g loh o g g l 是碱基切除修复途径( b a s ee x c i s i o nr e p a i r ，b e r ) 的关键酶。 由于经常暴露于烟酒、冷热等刺激因素下，食管较容易受到氧化损伤，我国是食管癌 的高发国家，主要病理类型足食管鳞状上皮细胞癌( e s o p h a g e a ls q u a m o u sc e l l c a r c i n o m a ， e s c c ) 。食管癌由于其早期症状不明显、不典型，容易被忽略，所以被检出时往往已到晚 期或伴有淋巴转移，所以手术切除和化疗在食管痛的治疗中占据了重要地位。 本文旨在探讨d n a 损伤修复酶h o g g l 在临床食管鳞癌组织中表达的变化，及其与8 o x o g 氧化损伤程度、凋亡指数和临床病理特征之间的关系，用于指导食管鳞癌患者术后个 体化治疗方案的制定。 1 收集食管鳞状上皮细胞癌手术切除新鲜标本4 2 例和存档蜡块2 6 例，免疫组化法检测 6 8 例鳞癌和癌旁组织中h o g g l 蛋白的表达情况。结果显示：h o g g l 蛋白在癌组钐 和 癌旁组织均有不同程度的表达，主要表达在胞核，在不同鳞癌患者组织中的表达存在个 体差异，5 7 例鳞癌组纵中h o g g l 蛋白较痛旁组织的表达明显减少( t = l2 5 5 ，p 0 ：0 0 1 ) 。 w e s t e mb l o t 法检测4 2 例新鲜鳞痛和癌旁组织中h o g g l 蛋白的表达情况，发现3 8 例 鳞癌组钐 中h o g g l 蛋白表达下降，这个结果与组化结果基本相一致，并且敏感性更好。 免疫组化法检测食管鳞癌和癌旁组织中8 - o x o g 氧化损伤程度，结果显示：不同鳞癌患 者组织中8 - o x o g 氧化损伤程度不同。食管鳞癌组织中8 - o x o g 的氧化损伤程度明显高 于癌旁组织( t = - 1 6 3 2 ，p 0 0 0 1 ) ，并且鳞癌组织中的8 - o x o g 氧化损伤程度与h o g g l 蛋白的表达呈负相关( x 2 = 2 9 6 5 ，p o 0 5 ，= 0 6 6 ) 。用t u n e l 试剂盒比较鳞癌和 癌旁组织中细胞凋亡的情况，发现不同鳞癌患者组织中细胞凋亡指数不同。高表达 h o g g l 的鳞癌组织，凋亡指数较h o g g l 表达低的鳞癌组织明显降低( t = 1 7 6 4 ，尸 0 0 0 1 ) ，并且与h o g g l 的表达呈负相关( 2 = 2 3 1 3 ，p o 0 5 ，= 0 5 8 3 ) 。食管鳞 癌组织中h o g g l 蛋白的低表达与食管鳞癌静脉侵犯、淋巴结转移有相关性( 尸 0 0 5 ) 。由此推测，某种因素可能抑制了 食管鳞癌组织中h o g g l 蛋白的表达，h o g g l 蛋白的低表达又影响了食管鳞癌组织中 8 - o x o g 的修复，造成鳞癌组织中8 - o x o g 氧化损伤程度的增高和凋亡指数的升高，这些 都加剧了食管鳞癌发生发展。另外，h o g g l 蛋白在不同鳞癌患者的组织中的表达存在 个体差异，这些差异是否影响术后化学治疗效果，将在后续的试验中进行探讨。 2 为了研究食管鳞痛细胞h o g g l 蛋白表达改变，与氧化剂和化疗药作用后，该细胞存活 率、氧化损伤、凋亡指数改变的关系，本研究建立了h o g g l 蛋白高表达的食管鳞状上 东南人学帧l ：学位论义 皮癌细胞模型。即构建重组质粒p e n t r 3 c h o g g l ，再将重组质粒与腺病毒载体 p a d c m v 5 d e s t 进行同源重组，获得重组腺病毒p a d c m v 5 d e s t - h o g g l 。重组腺病 毒和空载体腺病毒p a d c m v v 5 g w l a c z 分别转染2 9 3 a 细胞，分别得至0 高滴度的病 毒液，经噬斑形成实验测定其滴度，再分别转染食管鳞癌细胞株e c 9 7 0 6 。分别提取转 染重组腺病毒的e c 9 7 0 6 h o g g l 细胞、转染空载体腺病毒的e c 9 7 0 6 1 a c z 细胞以及未转 染腺病毒的e c 9 7 0 6 细胞蛋白，用w e s t e r nb l o t 比较其中h o g g l 蛋白的表达量，结果显 示前者h o g g l 蛋白的表达明显高于后两者，而未转染组及转染空腺病毒的细胞h o g g l 蛋白的表达没有明显差别。 3 h 2 0 2 可以作用于核内d n a ，导致d n a 链断裂和碱基损伤。用不同浓度h 2 0 2 作用 e c 9 7 0 6 h o g g l 、e c 9 7 0 6 1 a c z 、e c 9 7 0 6 细胞，经不同时间，m t t 法测得h z 0 2 长时间作 用细胞的最适作用浓度为6 5 9 m ，再用该浓度的h 2 0 2 不同时间分别作用于三种e c 9 7 0 6 细胞，m t t 和台盼蓝染色实验显示，e c 9 7 0 6 h o g g l 细胞较另两种细胞有更高的存活率 ( p o 0 5 ) ；用不同浓度h 2 0 2 短时l 日j 作用e c 9 7 0 6 细胞，8 - o x o g 染色测得h 2 0 2 作用 的最适浓度及时| 、日j 为1 0 0 9 m2 h ，再用该浓度及时白j 作用三种细胞，8 - o x o g 和t u n e l 试剂盒染色显示，e c 9 7 0 6 h o g g l 细胞中8 - o x o g 氧化损伤程度和细胞的凋亡指数较均较 e c 9 7 0 6 1 a c z 和e c 9 7 0 6 细胞降低。 4 顺铂是广泛应用于恶性肿瘤的化疗药物，也是食管鳞癌化疗的常用药物之一。用不同浓 度顺铂作用e c 9 7 0 6 h o g g l 、e c 9 7 0 6 1 a c z 、e c 9 7 0 6 细胞，经不同时间，m t t 法测得顺 铂长时间作用细胞的最适作用浓度为2 m g m l ，再用该浓度的顺【铂不同时间分别作用于 三种e c 9 7 0 6 细胞，经m t t 和台盼蓝实验显示，e c 9 7 0 6 h o g g l 细胞较另两组细胞有更 高的存活率( p o 0 5 ) ；用不同浓度顺铂短时间作用e c 9 7 0 6 细胞，8 - o x o g 染色试得 顺铂作用的最适浓度及时问为4 斗m l2 h ，再用该浓度及时问作用三种细胞，8 - o x o g 和 t u n e l 试剂盒染色显示，e c 9 7 0 6 h o g g l 细胞中8 - o x o g 氧化损伤程度和细胞的凋亡指 数较均较e c 9 7 0 6 1 a c z 和e c 9 7 0 6 细胞降低。这些结果说明，当食管鳞状上皮癌细胞 h o g g l 蛋白表达高时，食管鳞癌细胞对氧化剂h 2 0 2 和顺铂类化疗药物的耐受性就增 强。因此，术后常规对患者食管痛标本做h o g g l 蛋白表达的检测，有助于指导食管鳞 癌术后化学治疗方案的制定。 关键词：食管鳞癌；h o g g l ；8 - o x o g ；h 2 0 2 ；顺铂 江苏省自然科学基会项目b k 2 0 0 7 1 0 8 和b k 2 0 0 8 4 7 8 d n a m u t a t i o n 8 - h y d r o x y g u a n i n e ( 8 ，o x o g ) i sa ni m p o r t a n tp r o d u c to fd n ao x i d a t i v ed a m a g e ， 8 - o x o gc a np a i r e dw i t ha d e n i n e ( a ) a n dc y t o s i n e ( c ) w i t ht h es a m ee 衔c i e n c y , s ot h a ta f t e rt w o r e p l i c a t i o n i tc a nl e a dt og e n o m i cd n a o c c u r r e dg ：c t ：at r a n s v e r s i o n n o r m a l l y , t h eb o d y c a nr e p a i rd n am u t a t i o n sb yr e p a i re n z y m es y s t e m s s p e c i f i c8 o x o ge n z y m et or e p a i rw a s k n o w na s8 o x o g u a n i n ed n ag l y c o s y l a s e ( o g g1 ) i nm a m m a l i a nc e l l s ，a n dh u m a n 8 o x o g u a n i n ed n ag l y c o s y l a s ef h o g g1 ) w a sa l s oc a l l e d h o g glw a st h ek e ye n z y m eo fb a s e e x c i s i o nr e p a i rp a t h w a y ( b e r ) d u et of r e q u e n te x p o s u r et ot o b a c c o ，a l c o h o l ，h o t ，c o l da n do t h e rs t i m u l u s ，t h ee s o p h a g u si s s u b j e c tt om o r eo x i d a t i v ed a m a g et h a no t h e ro r g a n i z a t i o n s c h i n ai sac o u n t r yo fh i g hi n c i d e n c e o fe s o p h a g e a lc a n c e r ，a n di t sm a i np a t h o g e n i ct y p ei se s o p h a g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ( e s c c ) b e c a u s ei t se a r l yd i s e a s es y m p t o m sw a sn o to b v i o u s 。n o tt y p i c a l a n dw a se a s i l y o v e r l o o k e d e s o p h a g e a lc a n c e rw a so f t e nd e t e c t e di ni t sa d v a n c e ds t a g eo rw i t hl y m p hn o d e m e t a s t a s i s s os u r g i c a lr e s e c t i o na n dc h e m o t h e r a p yi st h em a j o rm e a n so fe s o p h a g e a lc a n c e r t r e a t m e n t s t h ec o r r e l a t i o n sb e t w e e ne x p r e s s i o no fd n a r e p a i re n z y m eh o g g 1a n dt h e8 o x o go x i d a t i v e d a m a g ei ne c s st i s s u e s 、t h ep a t h o g e n i ca n dc l i n i cp a r a m e t e r so fe s c cp a t i e n t sw e r ee x p l o r e d f o rt h eg u i d a n c eo fm a k i n gt h ep a t i e n t s c h e m o t h e r a p e u t i cs c h e d u l e 1 4 2c a s e so ff r e s hr e s e c t i v es p e c i m e n sa n d2 6c a s e so fp a r a m nb l o c k sf r o me s c ct i s s u e s w e r ec o l l e c t t e d t h ee x p r e s s i o no fh o g g1p r o t e i nb e t w e e n6 8c a s e se s c ct i s s u e sa n di t s a d ja c e n tt i s s u e sw e r ec o m p a r e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e d i f f e r e n tl e v e lo fh o g g le x p r e s s i o ni ne c s st i s s u e sa n dt h ea d j a c e n tt i s s u e s 1 0 c a t e dm a i n l y a tt h en u c l e u s t h e r ew e r et h ed i f f e r e n c e so fh o g g1e x p r e s s i o na m o n gt h ee c s sp a t i e n t s d e c r e a s e dh o g gle x p r e s s i o na n di n c r e a s e d8 o x o go x i d a t i v ed a m a g eo fe s c ct i s s u e sw e r e f o u n d ，c o m p a r e dw i t ht h ea d j a c e n tt i s s u e s ( 户1 2 5 5 。p 0 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fh o g g l p r o t e i nb e t w e e n4 2f r e s he s c ct i s s u e sa n dt h ea d i a c e n tt i s s u e sw e r ec o m p a r e db yw e s t e r n b l o t t h ee x p r e s s i o no fh o g g1i n 38e s c ct i s s u e sw a ss i g n i f i c a n td e c r e a s e d t h i sr e s u l t w a sc o n s i s t e n ta n dm o r es e n s i t i v et h a nw i t hi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 8 o x o go x i d a t i v e d a m a g eb e t w e e n6 8c a s e se s c ct i s s u e sa n di t sa d j a c e n tt i s s u e sw e r ec o m p a r e db y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i f f e r e n tl e v e lo f8 o x o gi ne c s s t i s s u e sa n dt h ea d j a c e n tt i s s u e s t h e8 - o x o go x i d a t i v ed a m a g ei ne s c ct i s s u e sw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ni ne c s st i s s u e s ( 户l6 3 2 ，p o 0 5 ) ，a n dw a sa s s o c i a t e dn e g a t i v e l y w i t hd e c r e a s e dh o g gl e x p r e s s i o no fe s c ct i s s u e so r 毛2 9 6 5 。p o 0 5 。r = 0 6 6 ) a p o p t o s i s i n d e xf a i ) b e t w e e n6 8c a s e se s c ct i s s u e sa n di t sa d j a c e n tt i s s u e sw e r ec o m p a r e db y t u n e lk i t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i f f e r e n tl e v e lo fa ii ne c s st i s s u e sa n dt h e a d j a c e n tt i s s u e s t h ea ii ne s c ct i s s u e sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ni ne c s st i s s u e s ( f = l7 6 4 ，尸 0 0 5 ) ，a n dw a sn e g a t i v e l yr e l a t e dw i t hh o g g le x p r e s s i o no fe s c ct i s s u e s o r e = 2 3 13 ，尸 0 0 5 r = 0 5 8 3 ) d e c r e a s e dh o g g le x p r e s s i o no fe s c ct i s s u e sw a s a s s o c i a t e dw i t hc a r c i n o m av e i ne n c r o a c h m e n ta n dl y m p hn o d em e t a s t a s i s ( p 0 0 5 ) ，b u tn o t a s s o c i a t e dw i t hp a t i e n t s g e n d e r a g e ，p a t h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o ng r a d ea n di n f i l t r a t i o nd e p t h i tm i g h tb ei n f e r r e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fh o g g1p r o t e i nm a yb ei n h i b i t e db ys o m ef a c t o r s 东南人学颂i ：学位论文 i ne s c c a n dt h el o w e re x p r e s s i o no fh o g g1i ne s c cm a ya f f e c t8 - o x o gr e p a i r , a n dr e s u l t i nt h ei n c r e a s ei f8 - o x o ga n da i ，w h i c ha g g r a v a t e dt h ed e v e l o p m e n to fe s c c t h ea m o u n t o fh o g glp r o t e i nw a sd i f f e r e n ti nd i f f e r e n te s c ct i s s u e s ，a n dw h e t h e rt h e s ed i f f e r e n c e s a f f e c tt h ee f f e c to fp o s t o p e r a t i v ec h e m o t h e r a p yw i l lb ed i s c u s s e di nt h ef o l l o w i n gp r o p o r t i o n 2 i no r d e rt oa n y l s i st h ee f f e c to fh o g glp r o t e i nt od n ao x i d a t i v ed a m a g ea n dc h e m o t h e r a p y i ne s c cc e l l s w ee s t a b l i s h e da ne s c cc e l lm o d e lw i t hh i g he x p r e s s i o no fh o g g1p r o t e i n i no r d e rt oe s t a b l i s ht h ec e l lm o d e l ，w ef i r s tr e c o m b i n a n t e dp e n t r 3 c h o g g l ，a n dt h e nt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dw a sh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t e dw i t ha d e n o v i r u sv e c t o rp a d - c m v 5 d e st t h er e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sw e r en a m e dp a d - c m v 5 - d e s t - h o 9 9 1 t h ep a d c m v 5 d e s t - h o g g la n dt h ep a d c m v v 5 g w l a c zw e r et r a n s f e c t e di n t o2 9 3 ac e l l s ，a n d o b t a i n e dh i g ht i t e rv i r u ss o l u t i o n ，w h i c hw a sm e a s u r e db yp l a q u ef o r m a t i o na s s a y c o n c e n t r a t i o n t h e nt r a n s f e c t e dt h e s et w oa d e n o v i r u si n t oe c 9 7 0 6c e l l s c o l l e c tt h ew h o l e c e l le x t r a c t so fe c 9 7 0 6 h o g g lc e l l s 。e c 9 7 0 6 1 a c zc e l l sa n de c 9 7 0 6c e l l sw h i c hw e r eo n t t r a n s f e c t e dw i t ha d e n o v i r u s u s ew e s t e r nb l o tt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fh o g g l p r o t e i ni n t h e s e3c e l l s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eh o g g 1p r o t e i ne x p r e s s i o nw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r i ne c 9 7 0 6 h o g g lc e l l s b u tt h ee x p r e s s i o no fh o g glp r o t e i nw a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t i nt h eo t h e rt w oc e l l s 3 a t i e rb e i n gt r e a t e dw i t hh 2 0 2f o rd i f f e r e n tt i m e ，t h e3k i n do fe c ：9 7 0 6c e l l sw e r ed e t e c t e db y m t t t r y p a nb l u ee x p e r i m e n t s ，8 - o x o gs t a i n i n ga n dt u n e lk i t t h er e s u l ts h o w e dt h a t e c 9 7 0 6 h o g g lc e l l sh a dh i g h e rs u r v i v a lr a t e s ( p o 0 5 ) ，l o w e r8 o x o go x i d a t i v ed a m a g e a n dl o w e ra it h a nt h eo t h e rt w oc o n t r o lg r o u p s 4 a t i e rb e i n gt r e a t e dw i t h2 m g m lc i s p l a t i nf o rd i f f e r e n tt i m e ，t h e3k i n do fe c 9 7 0 6c e l l sw e r e d e t e c t e db vm t t t r y p a nb l u ee x p e r i m e n t s ，8 o x o gs t a i n i n ga n dt u n e lk i t t h er e s u l t s h o w e dt h a te c 9 7 0 6 h o g g lc e l l st h a tw e r et r a n s ；f e c t e dw i t hp a d c m v 5 一d e s t - h o g g 1h a d h i g h e rs u r v i v a lr a t e s ( p 0 0 5 ) ，l o w e r8 - o x o go x i d a t i v ed a m a g ea n dl o w e ra it h a nt h eo t h e r t w oc o n t r o lg r o u p s k e yw o r d s ：d n ar e p a i re n z y m e s ：h o g g1 ；e s o p h a g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ；8 - o x o g ； c h e m o t h e r a p y ；a p o p t o s i s l v 目录 目录 内容页码 中文摘要一i 英文摘要- i i i 主要英文缩写词一i 绪论一一1 第一章文献综述：d n a 修复酶h o g g l 及其与人类疾病相关性的研究进展 3 第二章h o g g l 在食管鳞癌组织中表达的改变及其意义一9 前言一9 丹u 舌一一- 1 材料9 2 方法一1 1 3 结果一15 4 讨论2 2 第三章食管鳞痛细胞中h o g g l 表达的改变及该细胞对氧化剂和化疗药物的 耐受性一2 4 前+ 言一2 4日u 舌- z 辞 第一节建立h o g g i 蛋白高表达的食管鳞癌细胞模型2 4 1 利料一2 4 2 方法一2 7 3 结果一3 1 第二节食管鳞癌细胞h o g g l 表达的改变及其对氧化剂的耐受性3 3 1 材料一33 2 方法一3 4 3 结果一36 v 东南人学硕f j 学位论文 第三节食管鳞癌细胞h o g g l 表达的改变及其对化疗药物的耐受性3 9 1 材料39 2 方法39 3 结果4 0 4 讨 仑一4 2 结论4 5 致诩 4 6 参考文献4 7 作者简介51 缩略词 符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表 v i i 绪论 绪论 山于受到各种内外理化因素的作用，细胞内不断产生活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ， r o s ) ，r o s 攻击d n a 可导致d n a 损伤，这些受损的d n a 女i j 果得不到及时修复，就会发生 突变，随着突变的积累，基因组稳定性进一步下降，细胞有可能会凋亡。如果这些细胞没 有发生凋亡，随着损伤的进一步积累，就可能发生癌变。在众多r o s 攻击d n a 产生的d n a 氧化损伤中，鸟嘌呤8 位碳原子的氧化最常见，其氧化产物8 羟基鸟嘌呤( 8 - o x o g u a n i n e ， 8 - o x o g ) 在体内形成后较为稳定、易于检测，是稳定存在的代谢终产物，也是目前国际上公 认的一种评价d n a 氧化损伤的敏感指标和生物标志物。在d n a 复制时，8 - o x o g 将与腺嘌吟 ( a ) 配对，导致g ：c t ：a 颠换。一旦这种错配逃避了机体自身修复，就可能成为致突变、 致畸、致癌的启动因子。 d n a 修复系统在维护d n a 完整性、修复致癌因素所致的损伤及抗痛过程中有着重要作 用，其途径主要包括：碱基切除修复( b a s ee x c i s i o nr e p a i r ，b e r ) ；d n a 双链断裂修复 ( d o u b l es t r a n db r e a kr e p a i r ，d s b r ) ；错配修复( m i s m a t c h r e p a i r ，m m r ) ；核苷酸切除 修复( n u c l e o t i d ee x c i s i o nr e p a i r ，n e r ) 。其中，碱基切除修复是体内切除和替换突变碱基的 主要形式，主要有四个关键酶，分别是d n a 糖苷酶、a p 裂解酶、聚合酶和连接酶，碱基切 除途径的启动离不开糖苷酶的作用，d n a 糖苷酶是此过程最初环节的关键酶，由其对错配 碱基进行切除，并在其他修复酶作用下将d n a 链缺口修补完整。 特异性识别切除与c 配对的8 - o x o g 的d n a 修复酶，被称为8 羟基鸟嘌呤d n a 糖苷酶 ( 8 - o x o g u a n i n ed n ag l y c o s y l a s e ，o g g l ) 。在人体内，又称为人8 羟基鸟嘌呤d n a 糖苷酶 ( h u m a n8 - o x o g u a n i n ed n ag l y c o s y l a s e ，h o g g l ) 。除了8 - o x o g ，h o g g l 也能识别、切除其 他异常碱基对，如8 氧化鸟嘌呤：胞嘧啶，8 氧化腺嘌呤：胞嘧啶等，它参与碱基切除修 复过程，具有两种酶活性：n 糖基化酶活性和脱嘌呤脱嘧啶a p 裂解酶活性。n 糖基化酶 活性能从双链d n a 上去除受损嘌呤碱基，产生脱嘌呤( a p ) 位点；而a p 裂解酶活性则能 从a p 位点的3 处进行切割产生一个5 磷酸和一个3 丌坏的糖。已明确h o g g l 是修复d n a 损 伤的第一环节，因此，h o g g l 在碱基切除修复( b e r ) 中起着重要的作用。a u d e b e i r t 等【2 】 报道h o g g l 基因的m r n a 初级转录产物经不同剪接形成两种不同的m r n a ，即0 【- h o g g l 和 i b - h o g g l 。现在的研究认为，0 【h o g g l 主要存在于细胞核，参与核中8 - o x o g 的修复，而 i b - h o g g l 主要定位于线粒体，参与线粒体d n a 的氧化损伤修复【3 】。在哺乳动物细胞内，b e r 在修复核d n a 突变中起重要作用，仅h o g g i 与其他修复酶一起对维持细胞摹凶组的稳定性 发挥作用。而线粒体是氧化还原反应产生细胞的能量的主要场所，由于线粒体内的d n a 与 氧化还原体系非常接近，因此它更容易受到损伤。碱基切除修复是线粒体d n a 修复的唯一 途径，i b - h o g g l 在维持线粒体d n a 的稳定性方面起到十分重要的作用。 食管癌是人类常见的消化恶性肿瘤之一，我国是食管癌的高发地区，全世界食管癌患 者的一半以上发生在中国。我国食管癌的主要病理类型是鳞癌。在烟、酒、冷热食物等刺 激因素的作用下，食管上皮细胞内的d n a 经常受到机体内外因素的攻击而容易发生d n a 氧化损伤。目前，国内外关于食管癌中d n a 损伤和修复的研究，主要集中在食管癌中存 在的杂合性缺失、基因组微卫星不稳定性现象【4 】，以及h o g g l 遗传多态性和人群食管癌发 病率的关系【5 刁j 。本研究第一部分拟从以下四方面展开研究：临床食管鳞癌( e s o p h a g e a l s q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ，e s c c ) 组织中，d n a 氧化损伤程度如何? 食管鳞癌中是否存在 碱基切除修复酶h o g g l 表达的改变? 食管鳞癌中h o g g l 表达的改变和8 - o x o g 氧化损 伤程度、凋亡指数是否存在相关性? h o g g l 表达的改变与食管鳞癌临床病理特征的关系 怎样? 另外，食管癌早期诊断较为困难，确诊时常有扩散和转移，化疗在食管癌治疗中占有 重要地位。顺铂是广泛应用于恶性肿瘤的化疗药物，也是食管鳞癌化疗的常用药物之一。 东南人学帧i ：学位论义 但其耐约性的产生严重影响了治疗效果。顺铂的主要作用靶点是d n a ，进人细胞后水解为 双氯双氨铂，然后与细胞d n a 形成顺铂d n a ) j n 合物，影响d n a 的复制与转录，从而使细 胞d n a 受损。顺铂耐药的机制尚不十分清楚，目前普遍认核苷酸切除修复( n e r ) 是顺铂耐 药的重要机制之一。但是，近年的研究表明碱基切除修复( b e r ) 也涉及顺铂耐药的机制。 d n a 损伤修复系统作为机体抵抗各种损伤的分子基础，对于维护基因组的稳定与完整起着 至关重要的作用，然而对于通过损伤d n a 杀伤癌细胞的化疗，d n a 的修复无疑削弱了治疗 效果【l 8 1 。如何预见和克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，是肿瘤化疗急需解决的问题。 h 2 0 2 作为r o s 中的典型代表常被用于氧化应激的研究，它可以够自由扩散，并能到达 核内并作用于d n a ，引起d n a 链断裂和碱基损伤，目前国际上研究氧化损伤的课题较多都 是用h 2 0 2 作为氧化剂诱发细胞d n a 损伤p 一。 考虑到腺病毒具有包装容量较大、宿主范围广、感染效率高、无d n a 整合等优点，我 们选用腺病毒作为载体，构建高表达h o g g l 蛋白的重组腺病毒p a d c m v 5 d e s t h o g g l ， 并用它转染食管鳞癌e c 9 7 0 6 细胞，检测细胞在受到氧化刺激和化疗药物作用后，存活率、 8 - o x o g 氧化损伤、凋亡指数的改变，以此探讨h o g g l 在细胞抗氧化损伤以及肿瘤细胞对化 疗药物耐受性方面所起的作用。 本课题第二部分拟从以下三方面展开研究：1 构建p a d c m v 5 d e s t h o g g l 重组腺病 毒，建立h o g g l 蛋白表达量不同的食管鳞痛细胞模型；2 h 2 0 2 对h o g g i 蛋白表达量不同的 食管鳞癌细胞存活率、8 - o x o g 氧化损伤的积累和凋亡指数的影响；3 顺铂对h o g g l 蛋白表 达量不同的食管癌细胞存活率、8 - o x o g 氧化损伤的修复和凋亡指数的影响。 通过以l 二研究，旨在探讨：在食管鳞癌组织中h o g g l 蛋白表达的改变和鳞癌发生发展 的关系；以及通过术后常规对患者食管癌标本做h o g g l 蛋白表达的检测，推测机体对化疗 的敏感性及其预后，可指导食管鳞癌术后化学治疗方案的制定。 文献综述 第一章文献综述 d n a 损伤修复酶h o g g l 及其与肿瘤等疾病相关性的研究进展 l 上- j j 目q 罱 j f 常代谢、外界的环境污染、电离辐射、各种化学致癌物等会导致机体细胞内活性氧 ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 自由基的产生，r o s 攻击d n a 可形成多种氧化修饰的碱基， 致使基冈组稳定性下降，其中以8 羟基鸟嘌呤( 8 - o x o g u a n i n e ，8 - o x o g ) 形成频率最高，致突 变性最科1 2 ，13 1 。 在d n a 复制时，8 - o x o g 与腺嘌呤的结合能力增强，碱基c 和a 可以与8 o x o g 以相同效 率配对，从而在复制时形成g ：c t ：a 的碱基颠换，这种颠换不能阻止d n a 链的延伸， 最终将导致基因组d n a 发生突变，这种突变可能激活原癌基因或抑制抑癌基因的活性，并 与机体细胞的衰老及肿瘤等疾病有密切关系【1 4 1 5 1 。 d n a 修复系统在维护d n a 完整性、修复致癌因素所致的损伤及抗癌过程中有着重要 作用