（细胞生物学专业论文）rad18在dna双链损伤修复中的作用.pdf

t h e r o l e o f r a d 1 8 i n d n a d o u b l e s t r a n d b r e a k r e p a i r ab s t r a c t w i n t h e d n a p o s t r e p l i c a t i o n r e p a i r ( p r r ) r a d 6 e p i t a s i s p a t h w a y , t h e e r r o r - fr e e g r o u p c o m p r i s e s r a d 1 8 , r a d 5 a n d t h e mms 2 - u b c 1 3 h e t e r o d i m e r f a c t o r s . b o t h r a d 6 a n d u b c 1 3 a r e u b i q u i t i n - c o n j u g a t i n g e n z y m e s , a n d m m s 2 i s a u b c - l i k e p r o t e i n . r a d l 8 a n d r a d 5 a r e b o t h s i n g l e s tr a n d b i n d i n g r i n g f i n g e r p r o t e i n s . r a d 6 b i n d s t o r a d 1 8 a n d mm s 2 - u b c 1 3 b i n d s t o r a d 5 . t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n r a d l 8 a n d r a d 5 me d i a t e s t h e c o o p e r a t i o n b e t w e e n t h e u b c s , a n d a l s o l o c a l i z e s t h e u b c s o n d n a . h o w e v e r , t h e u b i q u i t y l a t e d s u b s t r a t e p r o t e i n o f t h e s e u b c s r e m a i n s u n k n o w n , a n d t h e n a t u r e o f t h e d n a t o w h i c h t h e r e p a i r f a c t o r s b i n d i s s t i l l u n c l e a r . s o t h e m a i n o b j e c t i v e o f m y p h d w o r k i s t o i n v e s t i g a t e t h e r o l e p l a y e d b y t h e u b i q u i t i n s y s t e m d u r i n g d n a r e p a i r . we i n t e n d e d t o u s e r a d 1 8 a s a k e y e l e m e n t t o s t a r t t h e w o r k , a s r a d 1 8 i n t e r a c t s w it h b o t h u b c a n d d n a . we i n t e n d e d t o i n v e s t i g a t e w h a t t y p e s o f d n a s t r u c t u r e s r a d 1 8 i s a s s o c i a t e d w i t h i n v i v o . t h e d n a d o u b l e s tr a n d b r e a k ( d s b ) c a n b e r e j o i n e d b y a t l e a s t t w o d i s c r e t e p a t h w a y s , i .e . , t h e h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n a n d t h e n o n h o m o l o g o u s e n d j o i n i n g . a t l e a s t 1 0 g e n e s w e r e f o u n d i n v o l v e d i n n h e j . a m o n g t h e m , y k u 7 0归d fl ) a n d y k u 8 0 ( h d f 2 ) a r e b r e a k e n d s b i n d i n g p r o t e i n s , a n d r a d 5 2 , mr e i l , x r s 2 a r e f o u n d b o t h i n h r a n d n h e j . i n s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e , s w it c h i n g o f m a t i n g - t y p e i s a s s o c i a t e d w i t h a d s b , c r e a t e d 妙t h e s i t e - s p e c i f i c e n d o n u c l e a s e h o . i t i s r e p o r t e d t h a t r a d 1 8 i s f o u n d t o b e i n v o l v e d i n h o d e g r a d a t i o n v i a t h e u b i q u i t i n 2 6 5 p r o t e a s o m e s y s t e m . r a d 5 i s f o u n d i n v o l v e d i n t h e a v o i d a n c e o f n o n - h o m o l o g o u s e n d 一 o i n i n g o f d s b i n s . c e r e v i s i a e . t h e r e f o r e , o u r h y p o t h e s i s i s t h a t r a d 1 8 m a y d i r e c t l y a s s o c i a t e w i t h d s b . a n d a l s o f o r t h e e s t a b l i s h m e n t o f t h e t e c h n i q u e , w e w e r e i n t e r e s t e d i n e x a m i n i n g w h e t h e r r a d l 8 p l a y s a r o l e i n t h i s h o - i n d u c e d d s b r e p a i r i n s . c e r e v i s i a e . t o m e a s u r e t h e a s s o c i a t i o n o f r a d l 8 w i t h d s b , w e u s e d t h e c h r o m a t i n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( c h i p ) . i n t h i s t e c h n i q u e , f i r s t t h e s p e c i f i c p r o t e i n - d n a i n t e r a c t i o n i s c r o s s l i n k e d b y f o r m a l d e h y d e , a n d t h e p r o t e i n s b o u n d w i t h t h e s p e c i f i c d n a a r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d b y a n t i b o d i e s . t h e n t h e p r e c i p i t a t e d d n a i s p u r i f i e d b y r e v e r s i n g t h e p r o t e i n - d n a w i t h 1 % s d s a n d h e a t . i n o u r e x p e r i m e n t , r a d 1 8 w a s t a g g e d w i t h 9 m y c i n v i v o . w e i n tr o d u c e d t h e d s b b y t h e i n d u c t i o n o f h o e x p r e s s i o n , w h i c h i s u n d e r t h e c o n tr o l o f t h e g a l 4 p r o m o t e r . s h o rt l y a ft e r d s b i n d u c t i o n , c h i p w a s p e r f o r m e d w i t h a n t i - m y c a n t i b o d i e s . f o r m u l t i p l e x p c r , p r i m e r s s p e c i f i c f o r z a n d y a , w h i c h a r e i n v o l v e d i n t h e d s b , w e r e e m p l o y e d . a n d a l s o , a p a i r o f p r i m e r s o f a c t i w a s u s e d as a n e g a t i v e c o n t r o l . i n t h i s e x p e r i m e n t , w e a l s o u s e d y k u 7 0 a s a p o s i t i v e c o n tr o l , s i n c e i t h a s b e e n w e l l d e f i n e d as a d s b e n d b i n d i n g p r o t e i n . we f o u n d r a d 1 8 d i r e c t l y b i n d s t o t h e t w o e n d s o f d s b . t h e r e s u lt s s u g g e s t e d t h a t r a d 1 8 p l a y s a r o l e i n d s b r e p a i r , as w e l l a s i n p r r . t h i s w o r k i s a l s o s u g g e s t i v e o f t h e d i s c o v e r y o f a n o v e l d s b r e p a i r f a c t o r . k e y w o r d s : r a d 1 8 d n a d o u b l e s t r a n d b r e a k h o y k u 7 0 c h i p 独创性声明 本人声明:所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进 行的研究工作及取得的研究成果。 除了文中加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人己经发表的研究成果， 也不 包含他人为获得东北师范大学或其他教学机构的学位或证 书而取得的研究成果。 与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均以在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名 : 哗 鱼坚日期:， 加 又、 f 关于论文使用授权的说明 本人了解并遵守东北师范大学有关保留、使用学位论文 的规定，即:学校有权保留、向国家有关部门 送交学位论文 的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全 部或部分内容， 可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论 时文 。 ( 保 密 的 论 文 在 解 密 后 应 遵 守 此 规 定 ， 作 者 签 名 二 r指导教师签名 期: a v d . s 日 一 掣 期:亡 些 己竺i 几一 第一章前 言 一、 泛素 系 统( t h e u b i q u i t i n p r o t e a s o m e s y s t e m ) 1 ， 概述 泛素( u b i q u i t i n ) 是高 度保守的7 6氨基酸小分子蛋白。 当 泛素分子首尾 以共价键相接在其它胞内蛋白上形成泛素分子链，这些蛋白会被a t p依赖 的多聚蛋白 一2 6 s蛋白酶识别而降解 ( h e r s h k 。和 c i e c h a n o v e r , 1 9 9 8 ; h o c h s t r a s s e r , 1 9 9 6 ; ) 。另外，也有相当的底物蛋白 只被一个或几个泛素分 子标记，通过胞吞作用进入过氧化物体或液泡而被消化降解。这就是所谓 的 泛素系统 ( t h e u b i q u i t in p r o t e a s o m e s y s t e m ) . 在真核生物中，泛素系统在细胞周期，基因表达和新陈代谢等各种重 要细胞功能的调节中 起着举足轻重的作用 ( h e r s h k o和 c i e c h a n o v e r , 1 9 9 8 ; h o c h s t r a s s e r , 1 9 9 6 ) 。泛素系统主要是对细胞瞬时存在的功能蛋白 进行及时 降解以保证各项细胞功能如:细胞周期，基因表达和新陈代谢等重要生命 活 动的 正 常 进 行( k o e p p 等 人 ， 1 9 9 9 ; r o c k 和g o l d b e r g , 1 9 9 9 ) o 泛素系统通过蛋白酶对功能蛋白的降解而精确调节着大量细胞功能 ( k o e p p 等人， 1 9 9 9 ; r o c k 和g o l d b e r g , 1 9 9 9 ) 。细胞周期， 应激反应， 抗原 表位等都依赖于泛素依赖型蛋白降解系统( k o e p p等人， 1 9 9 9 ; r o c k和 g o ld b e r g , 1 9 9 9 ) ， 所以 泛素 依 赖的 蛋白 降 解 系 统 失调 能 够导 致 癌 症 ( j o a z e ir o 等 人，1 9 9 9 ; b i g n e l l 等 人， 2 0 0 0 ) 或其 他疾病 ( s h i m u r a等人， 2 0 0 0 ; l a m 等人， 2 0 0 0 ) 。当 然被贴上泛素标签的 蛋白 并非只是为被降 解， 泛素化同 样 调 节 着 其它 细胞 过 程， 例 如 核 糖 化功 能( s p e n c e 等人， 2 0 0 0 ) ， 复 制 后d n a 的 修复 ( s p e n c e 等人， 1 9 9 5 ; h o f m a n n等 人， 1 9 9 9 ) ， 应 激反 应的 开 始， 和许多转录因子的功能 ( k a i s e r 等人，2 0 0 0 ) ,等等。只是这些调节过程的 机制还鲜为人知。 在蛋白 质上形成泛素分子链的过程被称之为泛素化。泛素化首先是在 底物蛋白上的 一 氨基酸基团的赖氨酸和泛素的 c端形成共价键，这一反 应需要三种酶的系列反应:泛素激酶，使g 7 6 梭基基团形成硫酷，使泛 心区，由大约 1 5 0 氨基酸组成，许多e 2 家族含有延伸的n端或c端利于 特殊的结合反应 ( j e n s e n 等人，1 9 9 5 ) 。酵母中共有 1 1 种e 2 ，而高等真核 生 物中 有更多e 2 ( r a j a p u r o h i t a m等人，1 9 9 9 ) 。 虽然e 2 之间 有许多 共同 之处，但是不同的 e 2行使不同的生物功能，这些不同功能也表现在不同 的e 2 与不同的e 3 合作上， 这己 在酵母中得到了证实( h o c h s t r a s e r , 1 9 9 6 ) . 举 例 来 说， c d c 3 4 ( u b c 3 ) 基因 的 突变 体中 ， 有大 量 与 细 胞周 期调 节相 关的 蛋白，其中包括细胞周期素依赖型激酶的阻遏。s i d 和 g 1周期素会稳定 存在而无法被降解。 正常情况下s i c l 和g 1 周期素被两种相关但不同的s c f e 3分别降 解 ( p i c k a r t , 2 0 0 1 ) 。 在突变菌株中，从它们的稳定存在可以 推 知c d c 3 4 可与这两种e 3 分别合作 ( t y e r s , 2 0 0 0 ) . 人们对e 2 蛋白的结构已 有了充分的认识，目 前至少有5 种e 2的晶体 结 构和 一 种溶 质结 构已 被发 表 ( h u a n g等 人， 1 9 9 9 ; z h e n g等 人， 2 0 0 0 ; c o o k 等人， 1 9 9 4 ; w o rt h z l a k e 等人， 1 9 9 8 ; j i a n g 等人，1 9 9 9 ; m i u r a 等人， 1 9 9 9 ) . e 2的中心结构域由4种基本螺旋结构组成:一种短螺旋，一种四 链反向0 折叠。0折叠和a 2形成一个心结构，一端为a1螺旋而另一端 为a 3 / a 4 。在这活性部位中，赖氨酸残基存在于连接于 s 4和a 2之间的 一个长环中，这一长环的上游肤段和。 2 -a 3 环的一段形成一个浅沟， 赖 氨酸即位于这一沟中。另外许多高度保守的 e 2氨基酸残基环绕于活性位 点 赖氨酸的周围 ( c o o k 等人，1 9 9 4 ; w o r th z l a k e 等人，1 9 9 8 ; j i a n g 等人， 1 9 9 9 ) 。其中许多残基会与泛素结合，而其它残基与e l 相互作用。 许多非 保守的 e 2残基与活性位置反向，在分子外侧成团。很多非保守残基，由 于选择压力小而改变，但是也有一些与不同 e 2的特殊性相关联。这结构 模型是以最新的 e 2 / u b c h 1 0的研究分析为依据而建立起的 ( y a m a n a k a等 人，2 0 0 0 ) 0 e 2 -c与多亚基的环指 e 3 :后期推动复合物 ( a p c )相合作，其泛素 化底物包括有丝分裂周期素 ( 有丝分裂过渡到细胞生长的前提蛋白) ( a r i s t a r k h o v 等人，1 9 9 6 ; y u 等人，1 9 9 6 ; p a g e 等人，1 9 9 9 ) 。 许多 残基 在e 2 - c的。 rt h o l o g s 中是保守的， 但是在其它e 2 中却是非保守的， 这些 残基位于上述活性部位的外侧 ( j i a n g等人，1 9 9 9 ) 。许多这种残基是泛素 化信号的一部分，被称为“ 破坏盒” ，在许多 a p c底物中都存在这种“ 破坏 盒” ，这种“ 破坏盒，. 在与细胞周期息息相关的 e 2 -c中存在，使之可以同 样得到及时降 解 ( p a g e 等人，1 9 9 9 ; g l o t z e r 等 人，1 9 9 1 ) 。 这种蛋白 的 周 期稳定性的原理尚不清楚， 但是它有助于在细胞周期的不同阶段， 不同a p c 与不同的e 2 相合作降解其它周期蛋白 ( y a m a n a k a 等人，2 0 0 0 ) 0 对 e 2 一泛素氨醋 ( 活化硫醋的类似物)的核磁共振研究表明，e 2与 泛素之间特殊形成的共价结合仅限于泛素c端的最末端，而且这种结合并 不常见 ( mi u r a等人，1 9 9 9 ) 。这一结论与序列分析和晶体结构分析的结果 是一致的，缀合泛素的e 2 和缀合其它泛素类似蛋白的e 2 有着惊人的相似 性 ( t o n g 等人，1 9 9 7 ) 。由 于e 2 一 泛素结合 形成的 硫醋结构很少， 所以 可 能是e l 主要负责带给e 2 正确的蛋白 配体 ( w h i t b y 等人，1 9 9 8 ) 。泛素与 e l 的结合在这一反应过程中是很重要的:e 2 对于负载泛素分子的e l 可以 稳定结合， 而对于自由的泛素分子和 e l分子的结合力却极微弱 ( h e r s h k o 等人，1 9 8 3 ; mi u r a等人，1 9 9 9 ) 。相反，自由的 e 2与和它们相关的 e 3 结合力却相对较强 ( b a i l l y等人，1 9 9 4 ) . e l 活化泛素并很快 将之传递给 e 2 ，同样e 2 也会很快将泛素带到下一个反应阶段 ( h a a s 等人，1 9 8 8 ) 0 e 2 活性部位外的侧链可以 催化泛素由e l 转至e 2 ，或由e 2 转至底物 蛋白的赖氨酸上。人们可以把 e 2活性部位看成一个琉基蛋白酶，含共用 残基使进攻的疏基或氨基酸基团去质子化，同时另外的基团用于稳定泛素 梭基基因逐渐增加的负电 ( h a a s等人，1 9 8 8 ) 。这些基团分别含有一个组 氨酸和一个谷氨酞胺，在 e 2的活性部位中至关重要，它们可以把泛素从 底物赖氨酸残基上去掉 ( j o h n s t o n 等人，1 9 9 9 ) 。目 前并没真正发现e 2 活 性琉基中的共用碱基，而且半肤氨酸上游的天冬酞胺在位置朝向上也很难 起静电中和作用 ( m o s s e s s o v a等人， 2 0 0 0 ) 。在理论上，e 3的结合会改变 e 2 活性部位氨基酸的位置，但是在对两种e 2 -e 3复合物晶体结构研究中 并没有发现e 2的构象变化 ( t o n g等人，1 9 9 7 ) . 这一点可能说明 在e 1 一 e 2复合物中真正对泛素的转移起催化作用的基团主要位于 e 1的活性部 位， 而催化泛素从e 2 转移到底物的 功能基团 存在于e 3 的活性部位( h u a n g 等人，1 9 9 9 ; z h e n g 等人， 2 0 0 0 ) . e 3主要有两大家族的构成:h e c t e 3和 r i n g e 3 。这两个家族的 催 化原 理 模型 与氨 基酸 序 列 和结 构 无关 ( h u a n g 等人， 1 9 9 9 ; z h e n g 等 人， 2 0 0 0 ) 。 有许多e 2 可分别与来自 两个家族的不同e 3 相互作用。 例如u b c h 7 , 可与h e c t家族的e 6 - a p 合作，同 样与几个r i n g e 3 结合 ( h u a n g 等 人，1 9 9 9 ; n u b e r 等人，1 9 9 6 ; k u m a r 等人，1 9 9 7 ) 。晶体结构的研究表明 在两种不同的结合中， e 2中有许多相同的残基起作用 ( m o z n i h a n等人， 1 9 9 8 ) 。多数残基位于d 折叠的两个环状结构中，从结构上可以 看出一个 确定的e 2 只能与一些确定的e 3 相结合，这些结构也同样解释了泛素化的 过程( y o k o u c h i 等人， 1 9 9 9 ) 。 这些结构带来的ib题， 例如h b c h 7 与h e c t , r i n g e 3 的结 合只涉 及到这 个e 2 表面的 一小部分结 构( h u a n g 等 人， 1 9 9 9 ; z h e n g 等人， 2 0 0 0 ) 。 那么e 2 的其 它核心区 域的功能又是 什么呢? 其它的 e 2也同样有相同的问题，而且，e 2表面还有些区域在 e 2 -e 3复合物中 也是处于开放性状态，可以继续与其它分子，如泛素化底物，其它 e 2或 共通因子相结合( m a t h i a s 等人， 1 9 9 8 ; m a d u r a 等人， 1 9 9 3 ; x i e 等人， 1 9 9 9 ) 0 另一个问题是，既然这么多e 2 - e 3以同样方式形成复合物 ( c h e n 等人， 1 9 9 3 ) ，为什么每种e 3 又需要与其特定的e 2 相结合呢?对新的e 2 的结合 分子的研究可能会有助于解答这一问 题. 4 ,泛索链接醉e 3 e 3的反应至少涉及两个步骤:一是 e 3识别泛素化信息并结合于底物 蛋白 上:二是将一个或多个泛素分子转移到底物上。另外， 被转至蛋白复 合物而降解的 底物上的k 4 8 泛素链会加以 延伸， 这也是由e 3 负责( p i c k a r l 等人，2 0 0 1 ) 。 泛素分子结合在底物上和泛素链的延伸在是由不同的 e 2 -e 3复合物 催化的 ( 有不同的e 2参与) ，这目 前仍是一个有待探讨的问题。理论上， 不同的e 2 - e 3 负责不同的反应可以 提供更多的调控机会 ( h o f m a n n 等人， 1 9 9 9 ; ma s t r a n d r e a 等人，1 9 9 9 ; c h e n 等人，1 9 9 3 ) 。目 前已 发现有许多e 3 既可以催化泛素一底物的结合又可以催化泛素分子链在底物上的延伸。例 如u b r l 是 一 种r i n g e 3 ， 可以 根据n端原 则困端 氨基 酸 特性 ) 识 别 一 些底物 ( c h a u 等人，1 9 8 9 ; x i e 等人，1 9 9 9 ) 。 对于u b c l 底物的 研究表明， 底物上形成泛素链的最基本要求是一个正确的n末端残基和一个在空间上 开放的赖氨酸残基 ( 泛素化位点)( c h a u等人，1 9 8 9 ) 。 而后 u b r l 催化泛 素分子链的延伸 ( 泛素化信号) ，这一过程需要一定的时间，反应后产物 的释放较慢 ( 类泛素蛋白 s u m 。和 n e d d 8在一段特殊的共有序列中修饰 赖氨酸残基)( c h a u 等人，1 9 8 9 ) 。在对三种天然泛素化底物的可能的泛素 化位点的研究中，底物中单一的赖氨酸到精氨酸的突变并不影响泛素化 ( h e r s h k 。等人，1 9 8 6 ) 。 这表明 许多e 3对于底物赖氨酸的泛素化是没有 太大选择性的，因为并没有研究证据表明在许多赖氨酸位点中其中之一会 被优先泛素化。 e 3可以给底物加上多聚泛素链的功能有助于蛋白酶聚合物对于底物的 识别。如果 e 3只能在底物上加一个或几个泛素分子， 那会导致在底物到 达蛋白 酶之前已先失去了泛素标签，这是因为细胞中也存在许多去泛素化 的酶.那么一个特定的 e 3在行使功能时是如何从对底物的泛素化转变成 对底物上泛素分子的泛素化 ( 泛素链的延伸)的呢?可能相对于底物泛素 化，泛素链的延伸要较为简单，但是也有可能底物结合了一个泛素分子后 会阻止其它泛素分子的结合.如果后者是正确的话，我们可能用以解释当 泛素分子被甲基化后泛素链的延伸受到抑制，但是却会形成大量结合单一 泛素分子的蛋白 底物。不过这一现象也可用位点特异性很强来解释 ( h o u 等人，1 9 9 4 ; l a w s o n 等人，1 9 9 9 ) 0 最近的 研究表明 转录因 子m y o d和e p s t e rn - b m病毒的 潜在膜蛋白1 被多 聚 泛素 化的 位点 很 特 殊， 即 在n 一 末 端( a v ie l 等 人， 2 0 0 0 ; b r e it s c h o p f 等人，1 9 9 8 ) 。在这两种情况下含有泛素化信号都被称为蛋白降解信号。 这两种底物的泛素信息都不在 n末端。这种情况下 n末端必然含有一个 很强的 特异性泛素化 位点 ( a v i e l 等人， 2 0 0 0 ; s o n g 等人，1 9 9 8 ) 。目 前并 不清楚有多少底物会在 n末端被泛素化， 也不清楚是否有一类特殊的 e 3 来催化这种特殊的泛素化。 泛素化信号通常是初级序列中的一个很短的区域( h e r s h k 。 等人， 1 9 9 8 ; h o c h s t r a s s e r , 1 9 9 6 ; c h a u 等人，1 9 8 9 ; l a n e y 等人，1 9 9 9 ; d as h a i e s , 1 9 9 9 ; t y e r s 等 人， 2 0 0 0 ; p a g e 等 人， 1 9 9 9 ) 。 最 初 被发 现的 泛素 化 信息 是 破 坏 盒， 存在于有丝分 裂周期素 ( g l o t z e r 等 人，1 9 9 1 ) 和其它a p c 底物中 ( k o e p p 等人，1 9 9 9 ; p a g e 等人，1 9 9 9 ) ， 在破坏盒的结构中 ( r x a c g x i x n ) ， 精 氨酸和亮氨酸起关键作用 ( g l o t z e r 等人，1 9 9 1 ; y a m a n o 等人，1 9 9 8 ) 0聚 合肤经常无法被泛素化，因为信号区域太短，在形成多聚肤后，底物蛋白 常常不能被泛素化 ( y a m a n o等人，1 9 9 8 ; y a r o n等人，1 9 9 8 ) .而信息的 识别并不需要专一的构象。多聚肤对于 e 3的结合力要弱一些，可见构象 起一定的作用。两种泛素化信号肤己被鉴别，晶体结构研究中两种信号肤 都处于晶体表面暴露区 域， 构象清楚 ( y a m a n o 等人，1 9 9 8 ; y a r o n 等人， 1 9 9 8 ) . 泛素过程的正常进行要求e 3 和e 2及信息肤的相互作用，这样才能保 证通过蛋白质之间的相互作用形成结合反应。在 e 3与其它蛋白 相作用之 前要被共价修饰， 或者相关的e 2要被激活 ( l a h a v - b a r a t z 等人，1 9 9 5 ) 0 有些e 2 和e 3 之间要有其它因子的共同协作， 泛素化信息肤在与e 3 作用 之前也需要化学或是构象的修饰 ( s c h e ff n e : 等人， 1 9 9 0 ; p a g e 等人， 1 9 9 9 ; k o e g l 等 人，1 9 9 9 ; s c h e ff n e r 等 人，1 9 9 3 ) 。 一 般的 机制 首 先 是 信号 肤的 磷 酸 化， 而识 别过程是去 磷酸化的 过程 ( y a r o n等人，1 9 9 8 ; s k o w y r a 等人， 1 9 9 7 ; f e l d m a n 等人，1 9 9 7 ) 。 在细胞周期的调节中， e 3 一 底物的相互作用 主 要是 磷酸化， 这样更加适合周期素依赖的 激酶的 活性 k o e p p 等人， 1 9 9 9 ; d e s h a i e s 等人，1 9 9 9 ; t y e r s 等人， 2 0 0 0 ; p a g e 等人，1 9 9 9 ) 0 大量己 被测序的真核蛋白 含有一系列的组氨酸和半肤氨酸， 这两种氨 基酸之间的距离接近，使两个锌离子可以相互作用形成交叉支撑。这种结 构 被 称为 指 状结 构r i n g ( d e s h a i e s 等 人， 1 9 9 9 ; b o r d e n 等 人， 2 0 0 0 ; j o a z e i r o 等人，2 0 0 0 ) 。目 前数据库中的 r i n g蛋白 可达几百种，它们在细胞中行 使大量的功能。锌离子及其配体没有催化活性 ( b o r d e n等人， 2 0 0 0 ) 。在 整个 r i n g结构中，锌离子与配体之间的空间距离，要比 任何初级结构顺 序更加保守 ( d e s h a i e s等人，1 9 9 9 ; b o r d e n等人，2 0 0 0 ) 。这些特征表明 r i n g指结构的功能主要并非化学催化， 而是其分子支架结构拉近其它的 蛋白。在泛素的生化研究中，大量的发现证明r i n g指结构在非r i n g序 列的帮助下，可以 与以一种其催化作用的特殊方式与 e 2结合 ( d e s h a i e s 等人，1 9 9 9 ; p i c k a rt , 2 0 0 1 ) 。这一点上，每种不含h e c t结构的e 3 必然 都含有r i n g指结构。但是目 前并不清楚是否所有的r i n g蛋白 都是e 3 r i n g e 3主要分两大类 ( d e s h a i e s 等人，1 9 9 9 ; t y e r s 等人， 2 0 0 0 ; p a g e 等人，1 9 9 9 ; j o a z e i r o等人， 2 0 0 0 ; p i c k a r t , 2 0 0 1 ) ，一是被称为单一 亚基e 3 ，许多这种 e 3 可以与其它非底物蛋白 形成复合物，但是对于底物 泛素化过程，它们只与单一e 2相互合作。而另外一种 e 3 ，是多聚体的聚 合物中的一个亚基。 相对于h e c t e 3 而言，r i n g e 3 更具可调节性: r i n g 及其相邻区域可以与特殊的球蛋白作用， 以促进 e 2依赖性底物泛素化过 程 ( j o a z e i r o等人，2 0 0 0 ; p i c k a r t , 2 0 0 1 ) 。有两种证据可以表明相当数量 的r i n g蛋白可能是e 3 :首先，双杂交实现检测到一些 r i n g蛋白 与e 2 酶相互作用( f a n g 等人， 2 0 0 0 ) 。 另 外， 一些e 2 或是在体外， 或是 在体内， 可以与相当的r i n g蛋白 形成复合物 ( w a t k in s 等人，1 9 9 3 ) 。另一种证据 来自 体外实验， 许多r i n g蛋白 催化相应的e 2 泛素化 ( k a o 等人， 2 0 0 0 ) 0 在多数情况下，这种自 动泛素化 r ing结构或 e 3的其它区域可作为邻近 底物。 二、 醉 母d n a的 损 伤 修 复 在高等真核生物中，有关 d n a损伤修复的路径大致有三种，核酸损 伤修复 ( n e r ) ，后复制修复 ( p r r )和双链损伤修复 ( d s b r ) ，如图 2 所示。以下我们将以酵母s a c c h a r o m z c e s c e r e v i s i a e 为例加以详细论述。 d n a d a m a g e r e p a ir p a t h w a y s n u c l e o t id e e x ic is io n r e p a ir b a s e e x ic i s i o n r e p a i r p o s t r e p lic a t io n r e p a i rd o u b le s t r a n d b r e a k r e p a ir r a d 6 e p is t a s is 岁 / r ad 6 1 8 r a d s u b c 1 3 州ms 2 h o m o lo g o u s r c o m b i n a t i o n n o n h o m o lo g o u s e n d 一 o in i n g r a d 2 rad3 了尸 r ad 3 0 色 t e 、 r e v1 r e v s e t c r a d s 2 e p is t a s is r a d s o - r a d s 9 a t le a s t 1 0 g e n e s y k u 7 0 ,y k u 8 0 已t c e r r o r - p ron e ( m u t a g e n i c ) r a d s o , m r e i 1 , x r s 2 e t c a r e t h e c o m m e n g e n e s o f b o t h p a t h w a y s 图2 : d n a损伤修复路径简图。 ( p r a k a s h等人， 2 0 0 0 : l e w i s 和r e s n i c k , 2 0 0 0 b r o o m f i e l d 等人， 2 0 0 0 ) 1 . 复制后修复 ( p r r ) d n a作为生物体遗传信息的载体，是相对稳定的，但是仍然会因各种 环境因素的影响而被损伤或改变，从而引起遗传的修饰，或致死性影响。 一般而言， 致死性损伤会被核酸损伤修复 ( n e r ) 或碱基损伤修复机制修 复。在这两种复制修复机制中已发现 r a d 2 . r a d 3 ，及其它相关蛋白的 上 位作用( p r a k a s h等人， 2 0 0 0 ) 。 但是 如果 损伤不能 或因 某 种原因 错过了 这 些修复路径，可能会导致细胞死亡， 在这种情况下，为防止细胞死亡， 所 有的细胞都有d n a损伤的忍耐途径， 在s 期来临时，d n a可以 在存在损 伤的情况下，仍然启动复制， 这些损伤会保留 到复制后由复制后修复路径 修复 ( p r r ) ( w a l k e : 等人，1 9 9 5 ) 0 在细菌和酵母中都存在p r r现象，受到紫外辐射会打断 d n a复制， 产生 单 链 缺口( r u p p 等 人， 1 9 7 1 ; l e h m a n n , 1 9 7 2 ; p r a k a s h , 1 9 8 1 ; c a p r io 等人，1 9 8 1 ) 。通过碱性蔗糖梯度法检测大量酵母突变品系对 u v辐射造 成的单链缺 口的修复能力，人们鉴定出了许多 p r r 相关基因 ( p r a k a s h , 1 9 8 1 ; c a p r i o 等人，1 9 8 1 ; g a n e s a n 等人，1 9 7 4 ; s a r a s i n 等人， 1 9 8 0 ) 。这些研究的最终结果表明，酵母 s . c e r e v i s i a e中 p r r主要依赖于 r a d 6 和r a d 1 8 ，部分依赖于r a d 5 2 ( p r a k a s h , 1 9 8 1 ) 。相对于细菌p r r , 人们对于真核生物 p r r的了解还很少，例如，如何解决对于复制叉暂停， 人们知之甚少。碱性蔗糖梯度法检测的单链损伤可能主要来自复制损伤受 阻后复制叉远下游新复制叉的启始，而非受阻复制叉的重新启动，下游合 成可以 通过相邻复制子来完成 ( c a p r i 。等人，1 9 8 1 ) 。目 前并不清楚到底 是通过哪种机制来修复缺口:是通过跨损伤旁路复制模式还是重组介导的 模板转换模式?另一个问题是细胞是如何界定转换突变机制 ( 有错修复) 和无错修复。 在筛选 u v敏感性突变酵母菌种时，r a d 6和 r a d 1 8突变同时被鉴定出 共有三种辐射修复上位途径， r a d 1 8 属于r a d 6 上位途径 ( c o x 和p a r r y , 1 9 6 8 ) 。后来人们研究还表明r a d 6 和r a d l 8 双突变酵母菌对大量d n a损伤 致剂敏感， 并且没有p r r活性 ( p r a k a s h , 1 9 8 1 ; c a p r i o 等人，1 9 8 1 ) ， 先行 于对 r a d 6的生化研究，r a d 6突变细胞表现出自 发突变率增加，而失去了 u v诱导突变 ( l a w r e n c e等人，1 9 7 4 ; l a w r e n c e等人，1 9 7 6 , p r a k a s h等 人 1 9 7 4 ) 。这些研究都表明r a d 6上位于 ( r a d 6修复路径)促进损伤诱导 突变。随后的研究进一步证明了 损伤诱导突变的确依赖于r a d 6 和r a d 8 上位路径 ( c a s s i e r - c h a u v a t 和f a b r e , 1 9 9 1 ; a r m s t r o n g 等人，1 9 9 4 ) 0 r a d 6 同时也是s . c e r e v i s i a c 中的1 3 个泛素缀合酶e 2 / u b c之一， 在多 种 细 胞功 能中 起 重要 作 用( d u b ie l 等 人， 1 9 9 9 ; s u n g 等人， 1 9 8 8 , 1 9 9 0 ; r o b z y k 等人， 2 0 0 0 ) , r a d 6 零突变( r a d 6 a ) 导 致无p r r 活性， 对大量d n a 损伤剂的极端敏感性， 和可诱导突变率的 大幅下降( p r a k a s h 等人，1 9 9 3 ) . r a d 6 同 时 在抱子形 成 ( m o r r i s o n 等人，1 9 8 8 ) ， 端粒钝 化 ( h u a n g 等 人， 1 9 9 7 )和基于n端规则的蛋白降解 ( 属于泛素蛋白降解系统) 等过程中起 作用 ( d o h m e n等人，1 9 9 1 ) 。 r a d 6的u b c活性位点第 8 位半肤氨酸， 突变表型同 于r a d 6 零突变 ( s u n g 等人，1 9 9 0 ) ， 这说明所有的r a d 6 的 所 有生物活性都离不开它的u b c活性，但是对于r a d 6 的u b c 活性是如何在 p r r抱子形成和端粒纯化中 起作用的，人们还一无所知。 与r a d 6 广泛的生 物活性不同， r a d 1 8 被发 现只 在p r r中 起作用( g e i g l 等人，1 9 9 1 ) , r a d 1 8 是单链结合蛋白，保护受损d n a产生的单链和线性 d n a的完整性， 这一点在r a d 1 8 菌株中得以证明:y 射线造成的大量d