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郑州大学硕士学位论文一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 摘要 尼古丁( n i c o t i n e ，烟碱) 是烟草中的主要生物碱和有害成分。某些微生物可以通 过不同的代谢途径利用尼古丁。本研究从河南烟区烟叶上分离到一株能以尼古丁为唯 一碳源和氮源的高效尼古丁降解菌株b 5 。 菌株b 5 在4 c 3 7 c ，p h 5 p h 9 范围内可以生长，其最适生长温度范围为 2 5 。c 3 0 c ，最适p h 范围为p h 6 p h 7 。 通过研究该菌株的常规形态学特征，生理生化特性和1 6 sr d n a 序列的测定及相 似性分析，将菌株b 5 鉴定为根癌土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) ，属于根瘤菌 科( r h i z o b i a c e a ep r i b r a m ) 中的土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 。并将它命名为根癌土壤 杆菌b 5 ( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sb s ) 。 对根癌土壤杆菌b 5 进行尼古丁浓度耐受性测试，该菌可在尼古丁浓度 5 0 0 m g l 4 0 0 0 m g l 内生长。当培养基中尼古丁浓度大于4 0 0 0 m g l 时根癌土壤杆 菌b 5 的生长受到严重抑制。为方便研究，本论文所使用的尼古丁培养基的浓度均为 2 0 0 0 m g l 。 在尼古丁液体培养基中接入根癌土壤杆菌b 5 ，3 0 ，2 0 0 r m i n 摇床培养，3 0 h 后尼古丁在2 5 9 n m 的紫外特征吸收峰完全消失，并逐渐在2 3 1 r i m 和2 9 2 n m 处形成新 的吸收峰，说明尼古丁被根癌土壤杆菌b 5 降解并生成新的物质。 根癌土壤杆菌b 5 在恒温培养箱中3 7 。c 培养4 周后转接在尼古丁固体培养基上， 发现该菌不能生长。说明经高温培养后，根癌土壤杆菌b 5 失去了降解尼古丁的能力， 推测根癌土壤杆菌b 5 降解尼古丁的基因可能编码在t i 大质粒上。 关键词：尼古丁，根癌土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) ，降解，生物学特性 郑州大学硕士学位论文 一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 a b s t r a c t n i c o t i n ei sap n n d p a la l k a l o i da n dt o x i cc o m p o s i t i o ni nb r e e d so ft o b a c c o s o m e m i c r o o r g a n i s m sa r ec a p a b l eo fd e g r a d a t i n gn i c o t i n ei nd i f f e r e n tp a t h w a y s i nt h ep a p e ra b a c t e r i a ls t r a i nb 5w h i d lw a sa b l et ou t i l i z en i c o t i n ea si t ss o l ec a l b o na n dn i t r o g e nw a s i s o l a t e df i o mt h et o b a c c ol e a v 姻f r o mh e n a n p r o v i n c e f o rs t r a i nb 5d e g r a d i n gn i c o t i n e , t h et e m p e r a t u r ea n dp hr a n g ei s4 c 3 7 c ，p h s - - p h 9 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp hr a n g ei s2 5 。c - - 3 0 c ，p h 6 p h 7 b yt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t so ft h em o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n ds t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c so f s t r a i nb 5a n db yt h ec o m p a r i s o no f i t s1 6 8r d n a a n a l y s i s ，t h es 打a i nb 5 w a si d e n t i f i e da sa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sb 5 t h es t r a i nb 5c a nt o l e r a t eh i 曲c o n c e n t r a t i o no fn i c o t i n eu pt o4 0 0 0 m g l i t sc a ng r o w i nc o n c e n t r a t i o no fn i c o t i n ef r o m5 0 0 m g b 4 0 0 0 m e g l i nt h i sp a p e rt h ec o n c e n t r a t i o no f n i c o t i n eu s e di s2 0 0 0 m g l 3 0 ha f t e rt h ei n o c u l a t i o no f b 5i n t on i c o t i n el i q u i dc u l t u r em e d i u ma t3 0 c 2 0 0 r r a i n i ns h a k e r , t h ee v i o l e tc h a r a c t e r i s t i ca b s o l bo f n i c o t i n ed i s a p p e a r e da t2 5 9 n m ，a n df o r mt h e n e w a b s o r b a t2 3 l n l n a n d 2 9 2 n m t h e r e s u l ts h o w t h e n e ws u b s t a n c e s a r e f o r m e d 4w e e k sa f t e rt h ei n o c u l a t i o no f s t r a i nb 5o nl bc u l t u r em e d i u mi nt h ec o n d i t i o no f c o n s t a n tt e m p c r a t u r ca t3 7 c ，t h eb a c t e r i as t r a i nc a r l tg r o wo nt h en i c o t i n ec u l t u r em e d i u m a g a i n t h er e s u l ts h o wt h a tt h eh i g ht e m p e r a t u e r ed i s a b l e dt h es t r a i nb 5t ou t i l i z en i c o t i n ea n d t h eg e n ew h i c hq u l i f i c a t et h es t r a i nb 5t od e g r a d en i c o t i n em a y b eo nt h eb i gp l a s m i d k e yw o r d ：n i c o t i n e , a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ，d e g r a d a t i o n ，b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s i i 郑州大学硕士学位论文一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 引言 尼古丁( n i c o t i n e ，烟碱) 是烟草中的主要生物碱，也是烟草中的主要有害成分之一。 它的化学名称为1 甲基2 ( 3 吡啶) 吡咯烷。它在室温下是一种难闻、味苦、无色透明 或淡黄色的油状液体，挥发性强，有强烈的刺激性，味辛辣。 尼古丁由一个毗啶环和一个氢化毗咯环两个氮杂环构成，属于杂环化合物。由于 尼古丁结构中的吡啶环和氢化吡咯环均呈碱性，所以尼古丁为碱性化合物，能与多种 无机酸和有机酸反应生成盐，并且不易分解。 尼古丁是一种中枢神经兴奋剂，使人的心理和生理产生依赖性，是使人吸烟成瘾 的物质。中等剂量的尼古丁可使人心跳加快，血压升高，心排血量减少，心电传导系 统功能失常；大量尼古丁则抑制中枢神经系统，甚至使心脏麻痹而死亡。此外尼古丁 还可增加血液粘稠度，使血流减慢，心脏供血量减少，发生心绞痛，严重时会引起心 脏病突发而死亡。尼古丁还是烟草和烟气中主要致癌成分亚硝胺( t s n a ) 的前体，长 期吸烟的人易患肺癌。 烟叶中尼古丁含量过高不仅严重影响烟叶的吸食品质，而且增加了烟叶的有害 性。我国大部分烟区上部烟叶质量和可用性偏低，主要是因为上部烟叶的内在化学成 分不协调，尼古丁含量过高，还原糖及糖碱比偏低，刺激性过强。这些高尼古丁含量 的烟叶不能用于生产，库存积压现象十分突出，给企业和国家造成了巨大的资源浪费 和经济损失。 尼古丁也是一种环境有毒物质，在烟草加工过程中会产生大量含高浓度尼古丁等 生物碱的固、液、气态废物，这种废物被认为是“有毒的危险废物”，如不经处理就 直接排放，会严重污染环境。 由此可以看出，把烟叶中的高含量尼占丁降低到合适的范围不仅有益于全人类的 健康，更是烟草工业发展的一个亟待解决的瓶颈问题。 为降低烟叶和卷烟中尼古丁的含量，国外很久就开始利用微生物在降解尼古丁方 面进行了大量的基础和应用研究。 到目前为止，人们已经发现的能降解尼古丁的细菌大致有p s e u d o m o n a ss p n o 4 1 ， p s e u d o m o n a sc o n v e x ap c ，p s e u d o m o n a sp u t i d a ，a r t h r o b a c t e ro x i d a n s ，a r t h r o b a c t e r o x i d a n sp - 3 4 ( 后来重新鉴定为4 n i c o t i n o v o r a n s ) ，a r t h r o b a c t e ro x i d a n sp a o l ( 后来重新 郑州大学硕士学位论文一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 鉴定为a n i c o t i n o v o r a n s ) ，c h r o m o b a c t e rn i c o t i n o p h a g u m 和c e l l u l o m o n a ss p 。真菌主 要有c u n n i n g h a m e l l ae c h i n u l a t a ，m i c r o s p o r u mg y p s e u m ，s e p e d o n i u mc h y r o s p e r u m a ， s t r e p t o m y c e s g r i s e u s ，s r e p o m y c e s p l a t e n s e s 和p e l l i c u l a r i a f i l a m e n t o s a 。 不同的微生物代谢尼古丁的途径也不同。在这些不同的途径中，不同种的微生物 有不同的酶系参与尼古丁的代谢。因此，人们对于微生物代谢尼古丁的途径还不完全 清楚。 一般认为它们主要沿着三种不同的途径代谢尼古丁：第一种途径是吡啶途径 口y r i d i n ep a t h w a y ) ，以氧化节杆菌为主“r t h r o b a c t e ro x i d a n s ) ；第二种是毗咯烷途径 ( p a y r r o l i d i n ep a t h w a y ) ，主要有假单胞菌和刺孢小克汗霉菌( c u n n i g h a m e l i ae c h i n u l a t a ) ： 第三种是脱甲基途径( m ep a t h w a y ) ，主要是烟草植物和真菌( p e l l i c u l a r i a f i l a m e n t o a a ) 。 近年来微生物代谢尼古丁的分子生物学机理已经有了较深入的研究，这些研究主 要围绕细菌展开，集中在节杆菌属细菌。在微生物代谢尼古丁途径的研究中，嗜尼古 丁节杆菌似r t h r o b a c t e rn i c o t i n o v o r a n s ) 降解尼吉丁的代谢途径研究得比较清楚，尼古 丁代谢过程中的主要5 个步骤共涉及到6 个酶的作用。假单胞菌属细菌只有初步的研 究报告，而有关真菌方面的研究还未见报道。 迄今为止，相对于国外较为成熟的利用微生物降解尼古丁的研究，国内的同类研 究较为欠缺。并且集中在尼古丁降解菌的筛选、鉴定方面，对于不同的微生物降解尼 古丁的途径和机理方面的研究与国外发达国家相比还有较大差距，并且将具有降解尼 古丁能力的微生物用于烟草工业生产及环境污染治理上的研究则更为欠缺。 本研究在国内外相关研究的基础上，参照已有的经验和方法，分离获得了大量微 生物菌株，并从中筛选出了对尼古丁有较强分解作用的目标菌株( 尼古丁降解菌) ；研 究了尼古丁降解菌的生理生化特性，测定了该菌降解尼古丁的能力，为分离、提纯尼 古丁降解菌代谢途径中的酶，分析尼古丁分解代谢途径机理和产物，构建尼古丁降解 菌的遗传图谱和基因图谱，构建高效尼古丁降解工程菌奠定理论基础，最终目的是采 用生物工艺技术来降低烟叶中尼古丁的含量。通过高活性降解尼古丁的菌株在烟草工 业中的应用，可以显著改善烟叶的品质，降低吸烟的危害性，减少烟草废弃物对环境 的污染，提高烟叶资源的利用率，具有良好的应用前景。 本研究从河南烟区的烟叶表面上分离筛选出一株能利用尼古丁做为唯一碳源和 氮源的根癌土壤杆菌b 5 ，具有较强的分解尼古丁的能力。目前国内外还没有类似文 2 塑型盔兰翌主堂垡堡壅二堡星直! 堕坚望塑坌塞堕垄墨基竺塑兰鲎丝塑婴窒 献报道，根癌土壤杆菌b 5 的发现丰富了降解尼古丁的细菌种类。研究了菌株b 5 的 生理生化特性及其降解尼古丁的能力，发现经过长期高温培养后的菌株b 5 ，失去了 降解尼古丁的能力。初步认为根癌土壤杆菌b 5 降解尼古丁的基因可能编码在t i 大质 粒上。 郑州大学硕士学位论文一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 第一章文献综述 1 1 尼古丁的化学结构及其理、化性质 1 1 1 尼古丁的化学结构 烟草生物碱是一个类群，含有将近5 0 种物质，存在于约6 0 多个不同种的烟草中 0 1 。烟草生物碱根据分子结构可分为两类：一类是毗啶与氢化吡咯相结合的化合物， 以尼古丁为代表；另一类是吡啶与毗啶或氢化吡啶环相结合的化合物，如假木贼碱， 新烟草碱等。在烟草生物碱中以尼古丁最为重要，它是烟草中的主要生物碱，占烟草 生物碱总量的9 5 以上【2 j 。 1 8 2 5 年，瑞士化学家a p i k e t e 首次从烟草中分离出尼古丁。尼古丁的化学名称 是l - 甲基一2 ( 3 吡啶) 吡咯烷。分子式为c i o h l 4 n 2 ，分子量为1 6 2 2 4 。 结构式： 1 1 2 尼古丁的物理、化学性质 尼古丁在室温下是一种难闻、味苦、无色透明或淡黄色的油状液体。它挥发性强， 有强烈的刺激性，味辛辣。在空气中极易氧化成棕黄色，并且在阳光下易分解，颜色 变深，有特殊的烟臭味。其沸点为2 4 7 ，比重1 0 0 9 ( 2 0 ) ，具有左旋性。尼古丁 有潮解性，6 0 以下能与水以任何比例互溶，具有随水蒸汽挥发而不分解的特殊性质， 因此可以用水蒸汽蒸馏法从碱性溶液中蒸出尼古丁。尼古丁不仅易溶于水，还可以溶 于许多有机溶剂，如四氯化碳、氯仿、乙醚、苯、煤油、三氯乙烯和三氯乙烷等。 尼古丁是由一个吡啶环和一个氢化吡咯环两个氮杂环构成的，属于杂环化合物。 其中一个是吡啶环，此环中的氮原子由于芳香化的结果，与芳胺的碱性相近，它的碱 性很弱，其p k b 值为8 左右。而尼古丁分子中的另一个氮杂环属于吡咯环，此环中的 氮原子还连接着一个甲基，属于叔胺。由于此环没有芳香化，其碱性与脂肪族叔胺碱 性相近，在水溶液中其p k b 值为4 左右。虽然尼古丁分子中含有两个碱性相差很大的 4 郑州大学硕士学位论文 一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 碱性基团，不过与强无机碱相比都是弱碱，在强碱的作用下很容易被分离出来。 在尼古丁分子中，毗啶环由于芳香化的作用，比较稳定，反应活性较低，而吡咯 环由于没有芳香化，比较不稳定，易发生反应，当受紫外光照射或浓硝酸作用时，易 被氧化。因此，尼古丁的降解在多数情况下是从先打开吡咯环开始的。 由于尼古丁结构中的吡啶环和氢化吡咯环均呈碱性，所以尼古丁为碱性化合物， 能与多种无机酸和有机酸反应生成盐，这些盐大多易溶于水和有机溶剂。烟草植株中 大部分的尼古丁与草酸，苹果酸，柠檬酸，芳香族酸结合生成相应的盐类。尼古丁也 能和无机酸结合生成盐，因此可以用盐酸或硫酸吸收尼古丁p j 。 1 2 降解尼古丁的必要性与紧迫性 烟草是一种特殊的经济作物，并且烟草之所以用作各种形式的消费品，是由于人 们可以从吸烟的过程中得到心理和生理上的享受。这主要是因为烟草中的尼古丁作用 于中枢神经系统，使人感到兴奋。因此品质好的烟叶含有适量的尼古丁，能给吸烟者 以适当的生理强度和好的香气和香味。 尼古丁占烟草的次生代谢产物生物碱总量的9 5 以上，对烟叶的品质有很大影 响：尼古丁含量过高，生理强度大，吃味变劣，刺激性增强；尼古丁含量低，则吃味 平淡，不能满足吸食需要。 烟草的品质的好坏是由烟草中的各种成分的比例组合决定的。2 0 世纪3 0 年代前 后，烟草科技工作者对烟草化学成分的研究做了大量的分析工作，大致弄清了烟草化 学成分与烟叶品质的关系。烟叶品质的鉴定是通过燃吸产生的烟气反映到人们的感官 通过感觉来评价的。 烟叶在燃烧过程中通过热解、合成、蒸馏、干馏各种反应而形成复杂的烟气，烟 气中部分成分与烟草中原来的成分相同，但大部分是在烟丝燃烧过程中产生了大量化 合物，并且这些化合物之问也可能又产生极其复杂的作用。对烟支的燃烧状态和烟气 的性质进行分析发现卷烟烟气是一种多相混合物的气溶胶，其化学成分非常复杂。正 在抽吸时产生的烟气被称为主流烟气，两次抽吸的间隔时间内烟丝燃烧产生的烟气为 侧流烟气。两种烟气由于产生的条件不同其成分也有很大差异。进入吸烟者鼻腔的主 要是主流烟气，主流烟气分为粒相部分和气相部分，气相部分占主流烟气的9 2 ， 而粒相占8 左右。气相部分主要是来自空气的各种气体以及烟气中易挥发的组分； 3 郑州大学硕士学位论文 一抹尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 粒相部分含有尼古丁、焦油和水分。 在烟草中，尼古丁大部分是以与有机酸，如柠檬酸和苹果酸结合成盐的状态存在 的，也有少量的自由状态尼古丁存在。卷烟燃烧时烟丝中的一部分尼古丁完整地转移 到主流烟气中( 约1 5 ) ，一部分转入侧流烟气中( 约3 0 ) ，一部分沉积在烟蒂内( 约 1 8 ) ，还有一部分发生在热懈合成反应中( 约3 0 ) ，产物为3 - 甲基、4 一甲基和3 - 乙烯 基吡啶和吡咯等，尼古丁是主流烟气中具有毒性的粒相成分。 尼古丁通过口、鼻支气管粘膜很容易被机体吸收，不仅可以通过鼻腔和口腔的嗅 觉神经带给吸烟者强烈的生理感受，还可以作用于中枢神经系统，使人感到兴奋的刺 激。适度地吸烟具有兴奋和松弛，抵御厌烦情绪的心理作用。但尼古丁是一种中枢神 经兴奋剂，可使人产生心理和生理上的依赖性，是使人吸烟成瘾的物质。中等剂量的 尼古丁可刺激肾上腺释放肾上腺素和去甲肾上腺素，兴奋中枢神经和交感神经，使心 跳加快，血压升高，心排血量减少，心电传导系统功能失常，增加了心脏的负担。大 量的尼古丁则抑制中枢神经系统，甚至使心脏麻痹而导致死亡。此外尼占丁还可增加 血液粘稠度，使血流减慢，心脏供血量减少，发生心绞痛，严重时会引起心脏病突发 而死亡。此外，尼古丁在人体内还会破坏人体吸收的维生素c ，从而减弱人体的免疫 功能。吸烟越多越能增加身体和心理对尼古丁的依赖性。研究发现人们长期吸烟会使 小血管产生收缩，引起心血管病变：削弱心脏的收缩力和损害脑细胞，降低机体的活 力；从而造成多种器官受累的综合病变。过量吸烟则会抑制中枢神经，麻痹心脏，甚 至有致命的危险，有人认为尼古丁是烟草和主流烟气中的n 亚硝胺( t s n a ) 的前体。 而该物质是致癌的主要物质州，长期吸烟的人患肺癌的几率远大于不吸烟的人。同时 尼古丁也是一种环境有毒物质，在烟草加工过程中会产生大量含高浓度尼古丁等生物 碱的固、液、气态废物，这种废物被认为是“有毒的危险废物”【5 】，如不经处理就直 接排放，将会严重污染环境。 另外，我国虽然是世界上烟叶和卷烟生产的大国，但并不是强国。我国烟叶和卷 烟的质量与国外发达国家比起来还有很大距离。尽管近年来我国部分烟区的烟叶外观 质量已接近国际水平，但就其内在质量而言还存在差距，其中一个突出的问题就是我 国大部分烟区的上部烟叶尼古丁含量偏高导致质量和可用性偏低【6 】，特别是上部烤烟 更加明显，尼古丁达到3 4 ，白肋烟尼古丁含量甚至高达6 1 7 ；而国外烤烟的 尼古丁含量在1 5 3 5 之间，白肋烟的尼古丁含量约2 9 【s 】，一般优质白肋烟的 6 郑州大学硕士学位论文一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 尼古丁含量在1 5 4 0 之间。这是由于我国的自然气候条件，土壤条件，施肥量 的多少等因素造成的。我国卷烟企业一般贮存的上部烤烟较多，却因为这些烟叶的尼 古丁含量较高而难以较多用于叶组配方中，造成库存积压现象十分突出，给企业和国 家带来了巨大经济损失和资源浪费。这与国外上部烟叶在卷烟配方中占到整个烟叶使 用率高达4 0 的比例相比差距较大。这个问题已引起有关方面的高度重视。如何降 低这些烟叶中的尼古丁的含量是各卷烟企业所面临的现实问题。 因此，降低烟叶和环境中尼古丁的含量，对于维护人类的健康和保护生态环境有 着极为重要的意义。控制烟叶中的尼古丁的含量到一个适度的范围不仅是降低吸烟危 害的重要途径之一，也是国际烟草业持续发展和满足多元化消费者需求的必然趋势。 从2 0 世纪5 0 年代开始，人们对“吸烟与健康”问题的认识逐步加强。自从1 9 5 4 年英国皇家医学学会和1 9 6 4 年美国医政总署先后根据流行病学的统计资料，提出吸 烟与肺癌有关的报道以来，一方面在当时抑制了烟草及其制品的生产和消费，一方面 激起了人们对“吸烟与健康”这个问题的普遍关注和广泛研究。除许多国家的卫生部 门和医学部门进行研究外，世界烟草行业更把这个问题看做是自身兴衰的关键，一直 在不遗余力地采取各种措施，减少吸烟对健康的危害。经过几十年地努力，取得了巨 大进展。1 9 7 0 年以前，关于“吸烟与健康”的论文有1 4 5 0 0 多篇p j 。而从1 9 7 0 年到 2 0 0 0 年的3 0 年间，研究人员发表了超过l o 万篇的论文，研究水平向更高的层次发 展。美国科学家霍夫曼等发表的关于卷烟烟气中4 4 种有害成分的确定，即著名的霍 夫曼清单，对降低卷烟有害成分的研究起到了较大推动的作用。 世界卫生组织从开始的广泛宣传“吸烟有害健康”，逐步发展力量不遗余力地开 展全球范围内的控烟工作。2 0 0 3 年5 月，第5 6 届世界卫生大会通过了烟草控制框 架公约，其主旨是对全世界烟草的生产经营实行严格的控制，各国政府均表示支持。 中国政府业已签署了 9 8 山东潍坊三强集团有限公司 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 x i a m e ns a n l a n dc h e m i c a l sc o ，l i m i t e d 天津市医药公司 开封化学试剂总厂 河南焦作市化工厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 上海浦东化学品有限公司 天津市医药公司 天津市医药公司 天津市医药公司 合肥工业大学化学试剂厂 中国医学科学院生物科学工程研究所 宝生物工程( 大连) 有限公司 杭州天和微生物试剂有限公司 2 1 4 所需主要培养基的配制 尼古丁固体培养基( 尼古丁浓度为2 9 l ) ，k 2 h p 0 4 3 h 2 01 3 3 9 ，k h 2 p 0 44 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，0 5 m l 的微量元素溶液，琼脂1 5 9 ，定容至l l ，p h7 0 。 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0m i n 后，加入过滤除菌后的尼古丁2 9 ，4 c 保存。 尼古丁液体培养基( 尼古丁浓度为2 9 l ) ，k z h p 0 4 3 h 2 01 3 3 9 ，k h z p 0 44 9 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，0 5 m l 的微量元素溶液，定容至l l ，p h7 0 。1 2 1 c 高压蒸汽灭菌 2 0m i n 后，加入尼古丁2 9 ，4 c 保存。 微量元素溶液：0 0 5 9c a c h 2 h 2 0 ，o 0 5 9c u c e 2 h 2 0 ，o 0 0 8 9m n s 0 4 h 2 0 ，o 0 0 4 9 f e s 0 4 7 h 2 0 ，o i g z n s 0 4 ，o 1 9 n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 用0 1 m h c i ，溶解定容至1 l 。 2 2 方法 2 2 1 尼古丁降解菌的初步筛选、富集 将取自河南烟区的8 个烟叶样本依次标为样品l 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 号。各 称取l g ，分别放入装有3 0 m l 尼古丁液体培养基的容量为1 0 0 m l 的锥形瓶中。3 0 y 2 ， 2 4 郑州大学硕士学位论文一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 1 2 0r m i n 摇床振荡，4 8 h 后从每个锥形瓶中吸取l m l 溶液转移至新鲜尼古丁液体培 养基中继续振荡。如此反复操作数次。 2 2 2 尼古丁降解菌的分离纯化 分别以上述8 个锥形瓶中的溶液为菌源，无菌操作条件下用接种环进行平板划线 转接于尼古丁固体培养基上，放入培养箱中3 0 c 培养，待单菌落形成后挑取单个菌 落反复平板划线进行分离。 2 2 3 尼古丁的定量检测 2 2 3 1 尼古丁紫外吸收标准曲线的绘制 用o 4 的h c l 将尼古丁标准样配成不同浓度的溶液，以o 4 的h c i 为参照， 在2 3 6 n m 、2 5 9 n m 和2 8 2 n m 处测定尼古丁标样溶液的吸光值，调整尼古t 浓度使吸 光值范围处在o 2 o 8 之间，以尼古丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制尼古丁 紫外吸收标准曲线。 2 2 3 2 尼古丁的含量的测定 以o 4 的h c i 为参比液，检测菌液在2 3 6 n m 、2 5 9 n m 和2 8 2 n m 处紫外线的吸 光值，对照尼古丁的标准曲线和稀释倍数来计算菌液当中尼古丁的含量。 2 2 3 3 尼古丁降解菌株的筛选 将筛选出来的2 1 种菌分别挑取单菌落，接种到装有1 0 m l 尼古丁液体培养基的 加塞试管中，在3 0 。c ，2 0 0 r m i n 条件下摇床培养。每隔6 h ，吸取l m l 菌液检测该液 在2 3 6 n m 、2 5 9 n m 、2 8 2 n m 处的吸光值，对照尼古丁的标准曲线和稀释倍数计算菌液 中尼古丁的含量，检测尼古丁的降解情况。挑选出能够使尼古丁液体培养基浓度降低 的菌株，即有降解尼古丁能力的菌株。 2 2 4 尼古丁降解菌株的常规鉴定 根据伯杰细菌鉴定手册第八版7 5 1 和东秀珠常见细菌系统鉴定手册 7 6 1 对 试验菌株的特征进行测定。 2 2 4 1 降解菌株的菌落形态特征 1 ) 菌落形态 挑取单菌落用平板划线法分别接种到l b 平板和尼古丁固体平板上，3 0 。c 培养 郑州大学硕士学位论文一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 4 8 h 后，观察菌落的大小、形状、表面、质地、颜色和透明度等方面。其中，菌落的 大小可量取其直径；形状指圆形或不规则形等；表面指凸起或平展、有无光泽以及是 否光滑等；质地指粘、脆而言，可用接种针挑取菌落，试验是否容易挑取。 2 1 尼古丁降解菌的单染色法 挑取培养4 8 h 后的菌落，用结晶紫染色后，在显微镜下观察细菌的形态。 3 ) 革兰氏染色 挑取单菌落接种到l b 平板，3 0 c 培养4 8 h ，革兰氏染色后，在光学显微镜下观 察细胞形态。以苏云金杆菌为阳性对照，以大肠杆菌为阴性对照菌。 铆芽孢观测试验 挑取适量菌株经革兰氏染色法涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液和番红复染，在光 学显微镜下观测，有绿色则证明有芽孢。 5 ) 菌株运动性试验 用直针穿刺接种菌株于l b 半固体培养基( 加琼脂粉0 3 ) 内，3 0 c 培养4 8 h 后， 目测细菌的运动性。若生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰整齐，则表示试验无 运动性；如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示试验菌有 运动性。如试验菌是好氧菌，则穿刺线上生长物较少，表面生长物较多。 6 1 温度试验 将待鉴定菌株接入l b 液体培养基中，分别在l o 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、 3 5 、4 0 。c 下培养4 8 h 后，观察菌的生长情况。 7 ) 初始p h 影响生长实验 分别用浓度为l m o l l 的h c i 和n a o h 调整l b 液体培养基的初始p h ，使培养 基的初始p h 分别为4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、8 5 、9 0 、 9 5 ，1 0 0 ，3 0 培养4 8 h ，观察菌的生长情况。 2 2 4 2 待鉴定菌的生理生化特征 1 ) 过氧化氢酶试验 挑取3 0 ( 2 培养4 8 h 后的单菌落涂于干净的载玻片上，然后在其上加一滴3 过 氧化氢，于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。 2 ) 糖类发酵试验 用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖的氧化发酵培养基，以4 8 h 的菌种穿刺接种。3 0 。c 郑州大学硕士学位论文一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 下培养观察结果。 3 ) 硝酸盐还原试验 将实验菌种接种于硝酸盐培养基，3 0 c 培养4 8 h ，加入甲液( 将对氨基苯磺酸o 8 9 溶解于1 0 0 m l 5 m o l l 乙酸溶液中) 和乙液( 将甲萘胺o 5 9 溶解于1 0 0 r a l 5 m o l l 乙酸溶 液中) 各一滴，硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数分钟内呈红色。 4 ) 明胶液化试验 取培养4 8 h 的单菌落穿刺接种，并有两支未接种的空白对照，于2 0 c 恒温培养 箱中分别培养2 、7 、1 0 天。在2 0 c 以下的室温观察生长情况和明胶是否液化，若明 胶凝块部分或全部在2 0 c 以下变为可流动的液体，为明胶水解阳性。 5 ) 产硫化氢试验 将新鲜的培养物接种于培养液后，用无菌的镊子夹取一乙酸铅试纸条悬挂于接种 管内，下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧。试验中设空白对照，在 未接种的试管培养基上悬挂乙酸铅试纸条，另外，接种己知菌的阴性反应作为对照， 置于3 0 士1 培养，进行观察比较，纸条交黑为阳性反应。 6 ) 淀粉水解试验 将培养4 8 h 的单菌落接种于l b 平板上，3 0 1 2 培养2 5 d ，形成明显的菌落后， 在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳性， 仍是蓝黑色为阴性。 2 2 5 尼古丁降解菌株1 6 sr d n a 的p c r 扩增及序列测定 2 2 5 1 细菌的总d n a 的制备 细菌总基因组的提取参照文酬7 7 1 的方法，稍做改进。 1 ) 挑取生长2 4 h 的单菌落接种到l b 液体培养基中，3 0 c ，1 8 0r m i n 摇床培养过夜。 2 ) 收集l m l 菌液，1 0 0 0 0 r m i n 离心3 0 s ，弃上清，然后加入去离子水洗涤两次，离心 弃上清。 3 ) 将沉淀悬浮于1 0 0 此的l o m mt r i s - h c i ( p h 8 0 ) ，煮沸1 5 m i n ，1 2 0 0 0 r m i n 离心2 m i n ， 弃沉淀，转移上清于新的离心管中，_ 2 0 4 c 保存备用。 2 2 5 2 配s a j p c r 反应体系 用于1 6 sr d n a 的p c r 反应的一对通用引物【7 8 】( 由上海生工生物工程技术服务有 限公司合成。正向引物b r ：5 a g a g r 盯g a t c c t g g c t c a g 3 ( e s c h e r i c h i ac o i l 对应 郑州大学硕士学位论文一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 位置8 2 7 ) 和反向引物b l ：5 从g g a g g t g a t c c a g c c g c a 3 ( e s c h e r i c h i a c o i l 对应 位置1 5 4 1 - 1 5 2 2 ) 。 p c r 反应体系( 5 0 幽：去离子水4 lp l ，( 含m 9 2 + ) 1 0 x p c r 缓冲液5 旺，0 0 r a m ) d n t p 4 f l ；1 0 阻n o l l 引物b r 和b l 各l 止，；模板d n a 2 此；e x t a q 酶o 2 5 p l 。 p c r 条件：9 4 c 5 m i n ；9 4 c 1 m i n ，5 2 c l m i n ，7 2 。c 2 m i n ，循环3 0 次；7 2 延伸 l o m i n ，1 0 保温。 p c r 扩增产物经l 琼脂糖凝胶( 含o 5 1 l g m l 溴乙锭) 电泳后紫外灯下观察结果。 如果在1 5 0 0 b p 处有明显d n a 条带，则能证明已扩出该菌的1 6 sr d n a 。p c r 产物的 纯化回收测序工作均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。登录到n c b i 的 g e n b a n k 数据库，利用b l a s t n 程序中的b l a s m 在非重复的g e n b a n k + e m b l + p d b 基因库中进行序列相似性检索及比对并将其鉴定到种。 2 2 6 长期高温培养对菌株b 5 生理生化特性的影响 用接种环无菌操作挑取适量待鉴定菌种b 5 划线到l b 固体培养基平面上，3 7 ( 2 恒温培养4 周后，再划线接种到尼古丁固体培养基上，观察菌的生长情况。 2 2 7 菌株b 5 的生长曲线的测定 挑取菌种b 5 的单菌落接入到l b 液体培养基中，3 0 c ，1 5 0 r m i n 摇床培养。采 用紫外分光光度法测菌株在6 0 0 n m 波长处的吸光度，以o d 6 0 0 吸光度表示菌体的生 长量。 2 - 2 8 菌株b 5 的降解能力的测定 将分离纯化得到的单菌落接种到尼古丁液体培养基中，3 0 c ，2 0 0 r m i n 摇床培养， 用不接菌的尼古丁液体培养基做空白对照。每隔6 i l 取适量培养液，用0 4 的h c i 稀释后在紫外分光光度计上2 0 0 n m 4 0 0 n m 问进行扫描，观察尼古丁在2 3 6 n m 、 2 5 9 n m 、2 8 2 n m 处特征波峰的变化情况。 2 2 9 菌株b 5 的尼古丁降解特性的研究 将尼古丁固体培养基( 浓度为2 0 0 0 m g l ) 分别配制成p h 为3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、 1 0 、1 l 、1 2 的培养基。挑取b 5 单菌落划线培养，放置在恒温培养箱中分别在4 0 c 、 3 5 。c 、3 0 c 、2 5 、2 0 c 、1 5 、1 0 温度下培养，观察菌落的长出情况。 2 r 郑州大学硕士学位论文 一株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 2 2 1 0 菌株b 5 与嗜尼古丁节杆菌和根癌土壤杆菌c 5 8 的降解性能的对比 挑取菌株b 5 、嗜尼古丁节杆菌a r t h r o b a c t e rn i c o t i n o v o r a n s ) 和根癌土壤杆菌 c 5 8 ( a g r o b a c t e r i u mt u r n e f a c i e n sc 5 8 ) 的单菌落，分别平板划线接种于l b 固体培养基和 尼古丁固体培养基上，3 0 c 恒温培养4 8 h 后观察平板。同时将菌株b 5 、嗜尼古丁节 杆菌似r t h r o b a c t e rn i c o t i n o v o r a n s ) 和根癌土壤杆菌c 5 8 ( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sc 5 8 ) 菌株在l b 液体培养基中培养到对数期，以5 的接种量接入到2 0 0 0 m g n 。尼古丁液 体培养基中，3 0 c ，2 0 0 r m i n 振荡培养，每隔6 h 取培养液，用o 4 的h c l 稀释后在 紫外分光光度计上2 0 0 n m 4 0 0 n m 间进行扫描，观察尼古丁在2 3 6 n m 、2 5 9 n m 、2 8 2 n m 处尼古丁的特征波峰的变化。 2 2 11 菌株b 5 降解烟叶中尼古丁的试验 ( 实验方法参照f 7 9 1 ) 将采自河南烟区的2 种烟叶标号为y l 、y 2 。先将y l 、y 2 放 入微波炉中火烘烤3 0 r a i n 经过灭菌处理后取出放入超净工作台用紫外线照射 2 0 m i n t 帅j 1 1 。 无菌操作取4 只广口瓶分别标记为g i 、g 2 、d 1 、d 2 。按2 0 的量约4 m l 的 o d 6 0 0 - - 2 0 的菌株b 5 培养液用喉头喷雾器均匀喷洒到加入到装有2 0 9 烟丝y l 、y 2 的广口瓶中。作为对照，同时喷洒4 m l 的0 9 的生理盐水至另外分别装有2 0 9 烟丝 d 1 、d 2 的广口瓶中。瓶口用数层棉纱做的棉垫封好，置于3 0 c 恒温培养箱中。每隔 4 8 h 无菌取l g 烟丝，将烟丝移至5 0 0 m l 开氏瓶中，加入n a c i2 5 9 ，n a o h3 9 ，再加 蒸馏水2 5m l 左右，使样品全部沉在瓶底，然后将开氏瓶连接于蒸汽蒸馏装黄( 如图 2 - 1 ) ，用蒸汽蒸馏，用装有1 0 m l 的2 m o l h 2 s 0 4 溶液的2 5 0 m l 三角瓶，收集2 2 0 m l 2 3 0 r a l 馏出液，并检查尼古丁是否蒸净( 方法：用小试管接少量馏出液加入1 2 硅钨 酸和2m o l l h 2 s 0 4 各一滴，若混浊是还没有蒸彻底，清澈时即可停止蒸馏。蒸净后 转移到2 5 0 m l 容量瓶稀释定容至刻度( 体积v ) ，同时吸取上述溶液2 5 m l 到第二个容 量瓶中( 体积为l o o l 儿) ，并用o 0 5 m o l l h 2 s 0 4 溶液稀释至刻度，将1 0 m l 的 2 m o l l h 2 s 0 4 溶液用蒸馏水稀释至2 5 0m l 做空白。同理，进一步将空白稀释至1 0 0 m l ，用紫外分光光度计在2 3 6 n m 、2 5 9 n m 和2 8 2 n m 处测吸光值。 郑州大学硕士学位论文株尼古丁降解菌的分离筛选及其生物学特性的研究 图2 - l 尼古丁的蒸馏装置 f i 9 2 1t h ed i s t i l l a t o r yo f n i c o t i n e 尼古丁o ： i 0 5 9 x f a 2 5 9 1 2 ( a 2 3 6 + a 2 8 2 ) 】x v x l 0 0 样品重x ( 1 一含水率) 3 4 3 1 0 0 0 式中1 0 5 9 为校正值 3 4 3 为尼古丁的吸光度，即1 0 0 0 m l 中含有l g 纯尼古丁溶液，按测定值计为3 4 3 f 为稀释倍数 a 2 ma 2 ”a 2 在紫外分光光度计上2 3 6 n m 、2 5 9 n m 、2 8 2 n m 处测定的吸光值 v 为蒸馏液的总体积 烟丝样品干重的计算：样品重x ( 1 一含水率= 烟丝干重 利用常压恒温干燥法可以测得烟丝样品的干重。原理是利用水在1 0 0 1 2 沸腾蒸发 的性质，使烟丝样品处在1 0 0 0 1 0 5 的条件下，经过一段时问，烟丝中的水分即 蒸发散失( 严格说散失的是水和挥发性物质的总量) ，得到无水的干物质。 步骤：取一只干净的培养皿在1 0 5 。c 的烘箱中烘半个小时，取出冷却后，称量。 重复数次，即再烘半个小时，再冷却称量。直至前后两次称量不超过o 0 0 2 0 0 0 3 9 为止，此为培养皿重。用此培养皿为容器称取l g 烟丝，放入1 0 5 c 的烘箱中烘2 h 后， 取出冷却后称量值减去培养皿的重量即为l g 烟丝的干重。 2 3 结果与讨论 2