（细胞生物学专业论文）小鼠子宫nk细胞的特性研究.pdf

中国科学技术大学硕士毕业论文 吴晓妍专业：细胞生物学 缩略词表 英文缩写英文全称 c dc l u s t e ro f d i f i e r e n t i a t i o n f c mf l o wc y t o m e t r y f c f r a g m e n to fc r y s t a l l i n e f c sf e t a lc a l fs e r l l m p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e i gi m m u n o g l o b u l i n i li n t e r l e u k i n n kc e l l sn a t u r a lk i l l e rc e l l s p b m c p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l f i t cf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e p e p h y c o e r y t h r i n m l a pt h em e s o m e t r i a ll y m p h o i da g g r e g a t eo fp r e g n a n c y u n ku t e r i n en a t u r a lk i l l e rc e l l s n kn a t u r a lk i l l e r n k tn a t u r a lk i l l e rt a p c s a n t i g e np r e s e n t i n gc e l l s i f n f f i n t e r f e r o ng a m m a t n f nt u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l f a g a g e s t a t i o nd a y p b l p e r i p h r e a lb l o o dl e u k o c y t e h l ah u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n k i l lk i l l e r - c e l li m m u n o g l o b u l i n l i k er e c e p t o r m i c am h c im o l e c u l e sr e l a t e dp r o t e i na p a s p e r i o d i ca c i ds c h i f f s e l i s a e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 5 中文全称 分化群 荧光激活细胞计数仪 可结晶片段 胎牛血清 磷酸盐缓冲液 免疫球蛋白 白细胞介素 自然杀伤细胞 外周血单个核细胞 异硫氰酸荧光素 藻红蛋白 子宫中膜淋巴细胞汇集区 子宫n k 细胞 自然杀伤细胞 自然杀伤t 细胞 抗原递呈细胞 干扰素叫 肿瘤坏死因子 妊娠天数 外周血白细胞 人类白细胞抗原 杀伤细胞免疫球蛋白样受体 m h c i 类分子相关蛋白a 糖原染色 酶联免疫吸附实验 中国科学技术大学硕士毕业论文吴晓妍专业：细胞生物学 摘要 目的：哺乳动物正常妊娠时，母体子宫内膜植入位点周围淋巴细胞中出现大 量n k 细胞，该群细胞被称为子宫n k 细胞( 心细胞) 。尽管它们有着潜在的微 弱细胞毒性作用，但在正常妊娠过程中并没有杀伤胎盘滋养层细胞，推测u n k 细 胞是一种对母胎免疫起调节作用的n k 细胞亚群，并通过分泌细胞因子在维持母 胎免疫耐受中发挥作用。因此，分离和鉴定u n k 细胞，并检测u n k 细胞上t h l 、 t h 2 型细胞因子表达的研究显得尤为必要。这对于发现具有负调作用的n k 细胞类 群及其功能以及相关免疫性疾病有十分重要的意义。方法：利用流式细胞术检 测不同怀孕天数的小鼠子宫蜕膜淋巴细胞各亚群的比例；检测不同组织来源( 子 宫，肝脏，脾脏和外周血) n k 细胞表面抑制受体n k g 2 a 以及c 5 7 b l 6 j d 、鼠妊娠 过程中t h l 、t h 2 型细胞因子的表达谱动力学变化；e l i s a 法检测不同组织的组织 匀浆液上清以及血清中细胞因子的表达：免疫组织学方法观察i f n - t 清除对小鼠 u n k 细胞数量的影响；通过细胞转输实验检测妊娠对局部n k 细胞的招募能力。 结果：经流式细胞术检测，妊娠早期的孕鼠u n k 细胞i f n y 和t n f 的表达与相 应肝脏组织相比有显著增加，而i l 4 和i l 5 的表达则基本维持在原有水平，并且 各组织中n k 细胞n k g 2 a 的表达在妊娠前后无显著性变化。u n k 细胞清除鼠中， 转输的外源n k 细胞能进入子宫母胎界面，可能会代偿性行使u n k 细胞的部分功 能。e l i s a 检测后发现子宫分泌的i f n - t ：和t n f 与u n k 细胞数的动力学变化特征 呈伴随关系，并且其绝对量均低于肝脏的分泌能力。由于i f n 吖对u n k 细胞的扩 增有重要的作用，i f n - t 清除鼠的心细胞数量明显少于对照鼠。结论：我们的 实验结果揭示：u n k 细胞作为重要的天然免疫淋巴细胞，其数量和功能与外周血、 肝脏和脾脏n k 细胞有明显的差异。u n k 细胞通过分泌t h l 型和t h 2 型细胞因子参 与母体对胚胎的免疫应答反应。从妊娠早期到妊娠中期，i f n - y 和t n f a 的分泌 量会持续升高，而妊娠后期有所降低。而t h 2 型细胞因子的量基本保持在一个稳 定的水平。n k g 2 a 作为n k 细胞的抑制性受体仅参与部分的母胎免疫耐受体系的 构建。 【关键词】子宫n k 细胞( u n k 细胞) ；妊娠；i f n - 丫：t n f a ：i l - 4 ；i l 5 6 中国科学技术太学硕士毕业论文吴晓妍 专业：细胞生物学 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：p r e g n a n c yi sau n i q u es i t u a t i o nf o r t h em a t e r n a li m m u n es y s t e m t h e f e t u si sc o n s i d e r e dt ob ea n a l l o g r a f tt h a t ，p a r a d o x i c a l l y ，s u r v i v e sd u r i n gt h e p r e g n a n c yd e s p i t et h el a w so fc l a s s i c a lt r a n s p l a n t a t i o ni m m u n o l o g y i np r e g n a n tm i c e a n dh u m a n , f u l l yd i f f e r e n t i a t e du t e r i n en a t u r a lk i l l e r ( u n k ) c e l l sa r ea b u n d a n tw i t h i n e a r l yd e c i d u ab a s a l i s i nv i e wo ft h e i ra c c u m u l a t i o na tt h em a t e r n a l f e t a li n t e r f a c e u n kc e l l sa r et h o u g h tt ob ee s s e n t i a ld u r i n gp r e g n a n c y a l t h o u g ht h e s ec e l l sa r e p o t e n t i a l l yc y t o l y t i e ，t h e yd on o tk i l lt h et r o p h o b l a s tc e l l sd u r i n gt h en o r m a l p r e g n a n c y ，s u g g e s t i n gt h a tu n kc e l l sm a yn e g a t i v e l yr e g u l a t et h em a t e r n a lf e t a l i m m u n er e s p o n s ea n dp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h em a i n t a i n i n go ft h em a t e r n a lf e t a l t o l e r a n c e a sau n i q u en kc e l ls u b s e t ，u n kc e l l sr e c o n s t i t u t i o nw a sd i f f e r e n tf r o m o t h e rn kc e l l sd u r i n gp r e g n a n c y i ti sr e a l l yi m p o r t a n tt oi n v e s t i g a t et h en e g a t i v e r e g u l a t i o nr o l eo fu n k c e l l sf o rt h ec l i n i c a la p p l i c a t i o no fp r e g n a n c yf a i l u r e ，a sw e l l a st h er e s e a r c ho ff u n d a m e n t a li m m u n o b i o l o g y s ow ef u r t h e rs t u d i e dt h ec y t o k i n e s p r o f i l eo f n kp o p u l a t i o ni nv a r i o u st i s s u e sa td i f f e r e n tg e s t a t i o ns t a g e m e t h o d sj m e c h a n i c a ld i s s e c t i o n a p p r o a c h e s w e r eu s e dt o p r e p a r ec e l l s u s p e n s i o n t h ep r o p o r t i o na n dp h e n o t y p i cc h a r a c t e r so fd i f f e r e n to r g a n - d e r i v e d m u r i n en kc e l l sa n dtc e l l sw e r ea n a l y z e d l y m p h o c y t e sf r o mu t e r i n ee n d o m e t r i u m ， l i v e r , s p l e e na n dp e r i p h e m lb l o o do fp r e g n a n tm i c eo ng d8 ，g d1 0 ，g d1 2w e r e i s o l a t e d ，t h e i rp h e n o t y p ea n dt h en a t u r a lk i l l e rc e l li n h i b i t o r yr e c e p t o rn k g 2 aa n d i n t r a c e l l u l a rc y t o k i n e sw e r ea n a l y z e db yf a c s t h ec y t o k i n e sp r o d u c t i o no fi f n - 1 , a n dt n f 一i nd i f f e r e n tt i s s u e s d u r i n gn o r m a lp r e g n a n c yw e r e d e t e c t e d b y e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s m s p l e n o c y t e sf r o mc 5 7 b l l 6 jm i c e d o n o rw e r el a b e l e dw i t hc f s e ，t h e nt r a n s f e r r e dt ot h ep r e g n a n tr e c i p i e n t sw h i c hw e r e p r o c e e d e dw i t hn kc e l l sd e p l e t i o n , b yt a i lv e i n si n j e c t i o n ，t h e nt h ep e r c e n t a g eo f c f s ep o s i t i v en k l 1 + c e l l sw a sa n a l y z e db yf a c s h i s t o l o g i c a ls t u d yw a sa l s o c o n d u c t e dt oc o n f i r mt h eu n kp o p u l a t i o na f t e ra n t i - i f n yb l o c k i n g ，b yp e r i o d i c a c i d - s c h i f f ( p a s ) s t a i n i n g r e s u l t s ；i tw a ss h o w e dt h a tt h en u m b e ro fu n kc e l l s n k l i + c d 3 h a d 7 中国科学技术大学硕士毕业论文 吴晓妍 专业：细胞生物学 s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da tg d8 ，p e a k e da tg d1 0 ，a n dd e c l i n e df r o mg d1 2 t h e r ew e r e n oc o n s i d e r a b l ec h a n g e si nt h en kp o p u l a t i o no fl i v e r , s p l e e na n dp e r i p h e r a lb l o o d ， o nd e s i g n a t e dg e s t a t i o nd a y a n dt h en k l 1 c d 3 + tc e l l sh a dn os i g n i f i c a n ti n c r e a s e ， e i t h e rf o rd i f f e r e n tt i s s u eo rg e s t a t i o nd a y o n l yo n et h i r do fm u r i n eu n kc e l l se x p r e s s t h en kc e l li n h i b i t o r yr e c e p t o rn k g 2 a w es t u d y e dt h ed i f f e r e n c e so fc y t o k i n e s s e c r e t i o np r o f i l eb yu n kc e l l si nu t e r i n ee n d o m e t r i u m ，c o m p a r e dt h a tf r o ml i v e r ， s p l e e na n dp e r i p h e r a lb l o o d i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fi f n ya n d t n f q i nu t e r i n ee n d o m e t r i u mo fp r e g n a n tm i c ew e r el o w e rt h a ni nl i v e r , b u t i n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yd u r i n gp r e g n a n c yt i l lm i dg e s t a t i o nd a y u t e r i n en k c e l l sh a d m o r ei f n va n dt n f c cp r o d u c t i o na b i l i t yt h a no t h e ro r g a n d e r i v e dn kc e l l s ，a n d t h e ya l s os e c r e t e dm i n o ra m o u n to fi l - 4a n di l 一5 + a n t ii f n - yt r e a t m e n td e c r e a s e dt h e l o c a lu n k c e l l sn u m b e ri np r e g n a n tm i c e ，a n dp e r i p h e r a ls p l e n o c y t e sc a nm i g r a t ei n t o u t e r u so f p r e g n a n tm i c e c o n c l u s i o n ? t h e r ew a sl a r g en u m b e ro f n kc e l l sl o c a t e di nt h ef e t a l m a t e r n a l s u r f a c ed u r i n gt h ep r e g n a n tp r o c e s s o u rd a t as h o w e dt h a tt h er e c o n s t i t u t i o no fu n k c e l l sw a sd i f f e r e n tf r o mp e r i p h r a ln kp o p u l a t i o nd u r i n gp r e g n a n c y u t e r i n en k c e l l s h a dap o t e n t i a lr o l eo fp r o d u c i n ga b u n d a n ti f n - ya n dt n f 一0 l ，b u taf e wi l l 4a n di l 5 s e c r e t i o n ，i no r d e rt oe n s u r eas u c c e s s f u lp r e g n a n c yp r o g r e s s i tw a sr e v e a l e di f n - ? a n dt n f ai sm o r ei m p o r t a n td u r i n ge a r l yp r e g n a n c y n k g 2 a ，a sa ni n h i b i t o r y r e c e p t o r ，m a yb ei n v o l v e di ni n h i b i t i o no f c y t o t o x i c i t yo f u n k c e l l si nt h ed e c i d u a - k e yw o r d s ；u t e r i n en a t u r a lk i l l e rc e l l s ( u n kc e l l s ) ；p r e g n a n c y ；i f n 。y ；t n f a ；i l 一4 ； i l - 5 8 中国科学技术大学硕士毕业论文吴晓妍专业：细胞生物学 刖吾 妊娠是一个困惑了免疫学家半个世纪的末解之谜，许多假说曾试图解释发生 在这个“种植点”的复杂现象【l 】。胚胎作为半同种移植物不被母体免疫系统排斥， 受多种因素影响，其中子宫内膜局部免疫因素起着重要的调节作用【2 j 。目前所知， 予宫局部对滋养层的免疫反应不同于其它种植点发生的反应。据报道，在滋养层 细胞侵入点能看到许多免疫细胞围绕其周围，然而，尽管它们有着潜在细胞毒作 用，但在正常妊娠时，并没有杀伤这些滋养层细胞3 ，”。母体免疫系统对作为半 同种移植物的胚胎调节作用是一个非常复杂的过程。自然杀伤细胞( n k 细胞) 大量存在于子宫内膜分泌期并于孕早期与胎盘绒毛外滋养细胞密切接触，提示 n k 细胞在受精卵的种植过程和胎盘生长发育中起重要作用。通过对人类子宫内 膜植入位点周围淋巴细胞的研究，人们将表型为c d 5 6 叶。0 t c d l 6 d ”的n k 细胞称为 子宫n k 细胞( u n k 细胞) ，它们在子宫淋巴细胞中的比例占有绝对多数，达n t o 以上。利用组织学的方法也可观察到孕鼠子宫植入位点周围蜕膜区中存在大量 u n k 细胞【5 , 6 1 。但对其细胞表型变化的研究仅来源于人类正常妊娠和不明原因流 产患者子宫蜕膜的观察。有关小鼠子宫蜕膜局部淋巴细胞亚群及u n k 细胞表型的 报道更为有限。 1 子宫n k 细胞的生物学特性 1 1u n k 细胞的来源 n k 细胞一般认为来源于骨髓造血干细胞，其发育成熟依赖于骨髓的微环境。 未孕时的u n k 细胞一般认为也来自外周。在妊娠期，它们在含有造血干细胞前 体和淋巴细胞前体的胎儿肝脏中存在，与胎儿肝脏n k 细胞拥有许多相同的，却 有别于外周血n k 细胞的特性。因此推测：u n k 细胞也有可能是从胎儿肝脏而 来。但妊娠时期在子宫局部大量扩增的u n k 细胞究竟是分化过程中处于原始状 态的n k 细胞，还是子宫特有的一种n k 细胞，目前尚无定谢”。 1 2u n k 细胞的免疫调节活性 妊娠时，绒毛外滋养层细胞与其他所有体细胞有所不同，它不表达多态性丰 9 中国科学技术大学硕士毕业论文吴晓妍专业：细胞生物学 富的经典h l a i 类分子h l a a 、h l a b 以及h l a i i 类分子，却表达多态性有限的 非经典h l a i 类分子h l a e 和h l a g ，以及低水平表达的经典h l a i 类分子 h l a c 。人类正常u n k 细胞表面能表达h l a i 类分子的受体。其中n k g 2 d 基因 是首先被确认的在同类n k g 基因中优先表达的基因，而n k g 2 a 、n k g 2 c 和 n k g 2 e 的互补d n a 链中在n k g 2 基因中是被隔离的。它们的相应受体都是与c 型 凝集素有近似序列的i i 型跨膜受体。n k g 2 a 、n k g 2 c 和n k g 2 e 蛋白在氨基酸序 列上非常近似，它们和另一种蛋白( c d 9 4 ) 结合形成异二聚体，可识别非经典 的m h ci 类分子如人类的h l a e 和鼠的q a l 。n k g 2 a 在功能上属于免疫抑制性 受体，由于循环中的母体细胞和滋养层细胞均表达h l a e ，c d 9 4 肺g 2 a 与 h l a e 相互作用，其结果是阻止n k 细胞对组织的溶解j 。关于l i n k 细胞上是否 有受体或是何种受体与滋养层表达的h l a i 类分子相互作用，这种作用的结果是 抑制n k 杀伤活性还是导致有利于妊娠的细胞因子的分泌，现在还没有确切的解 释。种种研究预示着u n k 细胞是一类具有免疫调节活性的细胞。 1 3u n k 细胞与外周n k 细胞的区别 n k 细胞表达众多表面分子，立0 c d 5 6 、c d l 6 、c d 5 7 并 i c d l 6 1 等。通常将 c d 5 6 + c d l 6 + c d 3 。t c r b c r - 的淋巴样细胞认为是n k 细胞。在外周血中，以c d 5 6 表达密度不同，n k 细胞分为c d 5 6 晰出( 约占5 ) $ f l c d 5 6 d “( 约占9 5 ) 两群。 c d 5 6 晰曲n k 细胞高表达c d 5 6 、c d 9 4 n k g 2 a 和c d 6 2 l ；低表达c d l 6 和k i r ( k i l l e r c e l li m m u n o g l o b u l i n - l i k er e c e p t o r s ，r ) ；表达高亲和力的i l 一2 受体( i l 一2 r c t 3 7 ) 。 而c d 5 6 “”n k 细胞高表达c d l 6 、p e n 5 、k i r 和l f a 1 ；低表达c d 5 6 和 c d 9 4 n k g 2 a ；仅表达中亲和力的i l 2 受体( i l 2 r p 7 ) 。c d 5 6 ”1 9 h t n k 细胞在i l 1 2 、 i l 1 5 或i l 1 8 的作用下分泌大量的细胞因子，女i i i f n - 7 、t n f a 、t g f d 、i l 1 0 、 i l 1 3 和g m c s f 等，且i l 2 的作用下表现出较强的增殖作用，杀伤活性较低：而 c d 5 6 m r a n k 细胞几乎不分泌细胞因子，且i l 2 不能促其增殖，表现出较强的杀伤 活性( 9 1 0 1 。 子宫n k 细胞表型上类似c d 5 6d i “n k 细胞，但在功能上和c d 5 6 b r i 曲l n k 细胞相 似。另外u n k 细胞还表达淋巴细胞共同抗原c d 4 5 + ，少量细胞表达c d l l b 和 c d 5 4 。c d i l b 和c d 5 4 是细胞粘附分子，两者在细胞连接和细胞溶解中起重要作 1 0 中国科学技术大学硕士毕业论文吴晓妍 专业：细胞生物学 用【】。从形态学上观察，u n k 细胞与外周血n k 细胞不同的是：这群细胞的胞浆 内存在一些膜包绕的特征性颗粒，这些颗粒内含有穿孔素、颗粒酶等，穿孔素等 细胞毒性分子转炉和翻译依赖一氧化氮合酶2 ( n o s 2 ) 的表达。颗粒的出现提 示u n k 细胞具有潜在的溶解细胞的特性。 通过比较u n k 细胞与外周血n k 细胞，以确定u n k 细胞的特异性标志，为进 一步发掘调节性n k 细胞提供宝贵的线索。表一从细胞分布比例、表面分子、基 因表达以及细胞因子的分泌等方面，集中比较了外周血n k 细胞与u n k 细胞，着 重强调- f u n k 细胞的特异性【1 2 , 1 3 1 。 中国科学拄术大学硕士毕业论文吴晓妍专业：细胞生物学 表一外周血n k 细胞与l i n k 细胞比较 p n k ( c d 5 6 d 油) p n k ( c d 5 6 6 “g h t ) u n k ( c d 5 6 b a g l l ) 比例占外周血n k 细胞占外周血n k 细胞占蜕膜n k 细胞9 0 筹欺9 5 5 以上 占蜕膜总淋巴细胞数 占外周血淋巴细胞总数 1 5 7 0 表面分子 c d l 6+ + c d 9 4+ + + n k g 2 a 部分表达所有l i n k 均高表达 n k g 2 c+ k t+ + l s e l e c t i n七 一+ + c d 3 s+ c d 6 9+ c d 9+ c d l 5 1+ 基因表达水平 l v 一4 9 l+ t l r 1+ c d 6+ n f k b g r a n z y m eb + g r a n z y m ea + + p e r f o r i n+ j - 细胞因子 g m c s f+ + c s f 1+ + i f n - y + a n g i o g e n i c + g r o w t hf a c t o r l i f+ “一”：阴性；“+ ”：阳性：“+ + ”：强阳性 1 2 中国科学技术大学硕士毕业论文吴晓妍 专业：细胞生物学 2 子宫n k 细胞与妊娠免疫调节 u n k 细胞在妊娠前3 个月最为丰富，能产生n k 细胞的活性标志物，如穿孔素 和丝氨酸酯酶；还能表达相应受体和分泌多种细胞因子，它们在着床期大量浸润 子宫蜕膜，与胎盘的滋养层细胞紧密接触，可能与控制滋养细胞的侵蚀，识别胎 儿抗原有关，对着床过程及以后的胎盘生长和分化起着一定的作用。正常妊娠时， 蜕膜可能通过分泌某些免疫抑制物，使u n k 细胞对滋养细胞的杀伤作用受到抑 制。u n k 细胞与滋养层相互作用，对胚胎植入和胎盘形成，胎儿生长发育起调节 作用。l i n k 细胞的功能尚不十分明确，但它们保证了母胎的免疫耐受状态，维持 着妊娠的顺利进行【1 4 j 。 2 1 细胞毒性作用 u n k 细胞的一个常见功能是细胞毒性作用，n k 细胞的细胞毒性将限制胎儿 的滋养细胞侵入子宫肌层的深度，避免滋养细胞过度侵润引起的子宫破裂而威胁 母体。s t a l l m a c h 等在穿孔素剔除小鼠模型中发现：u n k 细胞的杀伤功能不是其主 要功能。这些小鼠脾细胞悬液含有正常的n k 细胞数量，且有限制性溶解y a c 1 细胞的活性i ”1 。在移植位点，这些小鼠n k 细胞与正常组相似，妊娠结局也无胚 胎死亡。在正常妊娠过程中，母胎界面免疫一般处于抑制状态，可以推测：l i n k 细胞的活性也应处于抑制状态。 人外周血n k 细胞一些家族受体己阐明：如细胞表面存在的杀伤抑制受体 ( r ) ，n k 细胞表面特定的k i r 能识别靶细胞h l a - i 类分子，相互接触时可 导致种抑制信号的传递，从而阻止靶细胞的溶解。u n k 细胞具有与外周血n k 细胞类似的k i r ，具有一定的结构特征：由细胞外区域、跨膜区域、细胞浆内部 分组成，但表达k i r 的n k 细胞的比例和表达密度不同。所有n k 细胞可表达 一种可溶性k i r ( k i r 2 d l 4 ) ，它们在外周血n k 细胞表面的表达水平较低，伴 有一定的个体差异。而其在u n k 细胞表面的表达水平较高，它们与靶细胞表面 h l a - g 结合，滋养层细胞有h l a g 的表达，在妊娠期母胎界面与u n k 细胞结 合，从而抑制u n k 细胞溶解滋养层细胞的特性【坼l 。正常妊娠过程中子宫 c d 5 6 + n k 细胞与表达有h l a - g 的滋养层细胞接触后数量减少，并且发生形态学 改变，出现凋亡特征。用其抗体将k i r 2 d l 4 受体激活后，将导致静息n k 细胞 1 3 中国科学技术大学硕士毕业论文吴晓妍专业：细胞生物学 表达i f n 吖的量升高，但并不表现为对n k 细胞细胞毒活性的促发。人类n k 细 胞表达k i r 2 d l 4 ，是h l a g 的特异性受体。而其在h l a g 的识别位点至今不 明。 c d 6 9 是蜕膜c d 5 6 + c d l 6 n k 细胞的早期激活标志，人类白细胞抗原d r ( h l a d r ) 是晚期激活标志。c d 5 6 + 大颗粒淋巴细胞表面c d 6 9 在未妊娠子宫 内膜增生期表达最强，妊娠早期抗原水平逐渐下降 。在体外实验中，小剂量 i l - 2 的加入可使蜕膜c d 5 6 + c d l 6 n k 细胞表达c d 6 9 、h l a d r 、c d 7 l 抗原增 加，这表明蜕膜细胞c d 6 9 抗原的表达强度低，细胞处于未活化状态。 2 2 细胞因子分泌能力 细胞因子是由激活的免疫细胞及其他类型基质细胞合成和分泌的小分子多 肽，分子量介于6 0 0 0 6 0 0 0 0 ，主要以局部的自分泌和旁分泌方式进行免疫细胞 间的信息传递。蜕膜和胎盘由上述众多免疫及基质细胞组成，它们可分泌许多细 胞因子，通过相互诱生、相互调控、受体表达以及生物学效应的相互影响( 增强 或拈抗) ，组成了母胎界面微环境的特殊的细胞因子网络，使母体对胎儿产生 免疫耐受以维持妊娠【1 8 】。 子宫蜕膜组织中含有大量免疫职能细胞，如n k 细胞、t 细胞和m $ 细胞等， 其中最丰富的是u n k 细胞。正常妊娠时，它们可能分泌某些免疫抑制物，使u n k 细胞对滋养细胞的杀伤作用受到抑制。在妊娠前3 个月u n k 细胞最为丰富，它 们在孕期类固醇激素的影响下，会发生一系列生理变化，通过分泌多种细胞因子， 对子宫内膜起免疫调控作用，并参与胚胎着床、生长、发育及早期胎盘形成等调 节。研究表明：小鼠、大鼠和人类的l i n k 细胞能产生多种类型的细胞因子，如： i f n f f 、t n f 队t g f b 、m o c s f 、l i f 、i l 1 、i l 4 和i l - l o 等。表达细胞因子受 体有i l 2 r ( 、口、y ) 、i l 1 5 r 、t n f 。o t r 、t g f p r 等。现就其主要细胞因子 加以介绍。 2 2 1i l - 2 妊娠时在胎盘种植处活化的t 细胞和合体滋养细胞可产生i l 2 ，活化的 t h 细胞、部分b 细胞、单核细胞、n k 细胞可产生i l 2 r 。i l 2 与其受体结合 1 4 中国科学技术大学硕士毕业论文 吴晓妍专业：细胞生物学 后可刺激n k 细胞增殖与杀伤能力，但是否影响其对滋养层细胞的杀伤尚无定 论。i l 一2 可促进母胎t 、b 细胞增殖、分化和多种细胞因子与抗体的产生，并可 活化m 十、增强c t l 细胞、l a k 细胞的杀伤活性，在刺激胎儿造血、局部抗感 染及局部特异性免疫屏障的构成方面等有重要意义。i l - 2 可刺激t s 细胞增殖， 对抑制母体免疫排斥有一定作用。然而，i l 2 在母胎界面的过度表达可刺激滋养 细胞表达i f n - y ，而i f n y 可上调经典的h l a 2i 类抗原在胎盘的表达，倾向于 免疫排斥。h a m a i 等在体外实验中发现非经典型h l a 2i 类抗原( h l a 2 g ) 的 表达减少，增强了i l - 2 对滋养细胞的破坏，说明i l - 2 可以加强因h l a 2 g 表达 减少所致的免疫排斥作用【1 9 1 。 2 2 2i l - 4 i l 4 在胎盘上表达，滋养细胞、羊膜细胞及t 淋巴细胞均可分泌i l 4 。i l 4 可抑制t h l 型细胞因子对u n k 细胞的活化作用，还能抑制l a k 细胞的产生， 减少人t 细胞上i l 一2 生成，调节单核细胞功能，减少i l 1 、t n f o 【的作用，从 而减轻n k 细胞激活对滋养层的损伤。除此之外，i l 4 可调节胎盘的生长，并有 抑制炎症反应和抗早产的功能口耵l 。 2 2 3l l - 6 i l 6 是宿主对感染及组织损伤反应的主要调节因子，它由合体滋养细胞、内 皮细胞、内皮基质细胞、单核巨噬细胞、纤维母细胞和基底细胞对上述反应产生。 m a t s u x a k i n 等报道，妊娠时i l 6 能调节胎盘人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 的 生成，还可和t g f - d 共同参与i g g 分子的糖基化调节，从而调节i g g 分子中不 对称i g g 即封闭抗体的比例，使父方抗原免遭母体排斥。此外，i l 6 还与诱发分 娩有关f 2 l 】。 2 2 4i l 1 0 i l 1 0 来自单核细胞、t 细胞或母胎界面的其他炎症细胞，此外许多学者通 过免疫组化法、原位杂交技术证实各期胎盘滋养细胞均可分泌i l 1 0 。i l 1 0 在免 疫系统有广泛的生物学活性，既有激活作用又有抑制作用，并且抑制作用为主要 中国科学技术大学硕士毕业论文吴晓妍专业：细胞生物学 作用。i l 1 0 最初被描述为“细胞因子合成抑制因子”，它通过抑制一氧化氮( n o ) 的产生来抑制m m ，同时由于n o 的减少，导致胎儿、胎盘的血循环减少，间接 抑制了母体对胎儿的免疫排斥。i l 一1 0 可抑制i l 一2 、t n f a 、m c s f 等t h l 型免 疫反应。i l 一1 0 还可通过作用于a p c ，抑制抗原递呈及其与t 细胞共刺激信号的 产生，从而抑制异体抗原的排斥反应，增强免疫耐受。另一方面，i l 1 0 亦具有 神经内分泌活性，小鼠垂体细胞可产生i l 1 0 ，而i l 一1 0 又可诱导小鼠垂体细胞 和脾细胞产生促肾上腺皮质激素( a c t h ) 。现已证实a c t h 通过促进肾上腺糖 皮质激素的产生及减弱胎儿组织上h l a 2i 、i i 类分子的表达，抑制免疫应答介 导免疫耐受i 捌。 2 2 5 i 刊f a n 盯吨可由胎盘局部蜕膜与纤维组织中大量的m 扒中性粒细胞、内皮细胞 及细胞滋养细胞和合体滋养细胞产生，存在于妊娠各期。t n f a 可刺激细胞滋养 细胞合成和分泌孕酮及h c g ，而适量的孕酮和h c g 在维持蜕膜稳定，抑制t 淋巴细胞活性及防止母体对胎儿的免疫排斥方面有重要作用。适量的t n f a 能促 进分解代谢并参与胎儿及胎盘组织的生长、分化调节。但过量的t n f c t 可激活人 类羊膜细胞及合体滋养层细胞的凋亡，刺激子宫血管内皮表达绝1 2 共同和组织 因子启动凝血过程，引起血栓形成和炎症反应，损伤血管致胚胎死亡f 2 3 1 。 2 2 6i f n - 7 i f n y 主要来自活化的n k 细胞、t 细胞、胎盘滋养层细胞及绒毛间质细胞， 但其在胎盘的受体主要分布于细胞滋养层，说明i f n - t 可能调控滋养细胞的生长。 适量i f n v 对于维持蜕膜的完整性和促进螺旋动脉血管的重建有重要的作用。大 量i f n - y 可激活蜕膜中的m m 及其他细胞，使它们释放某些细胞毒物质，从而对 妊娠造成危害 2 4 1 。 2 3n k 细胞受体系统与母胎耐受 目前有研究表明c b a j ( 雌) 与d b a 2 j ( 雄) 杂交鼠高流产率的原因是因 为杀伤活化性受体l y 4 9 d 被激活，局部i l 一1 0 合成减少，n k 细胞活性增强，造 1 6 中国科学技术大学硕士毕业论文 吴晓妍专业：细胞生物学 成妊娠失败。极大的提示了n k 细胞活化性受体的大量激活与自发性流产的关 系。从表一中可以看出人类u n k 细胞高表达免疫细胞抑制性受体n k g 2 a ，这与 外周只有部分n k 细胞表达n k g 2 a 形成鲜明对比。此外，u n k 细胞可高水平表 达c d 9 4 。它们在子宫蜕膜处形成c d 9 4 n k g 2 a 异二聚体，表达于滋养层细胞 表面的h l a e 分子是免疫细胞抑制性受体c d 9 4 n k g 2 a 的主要配体，故两者相 互作用可保护靶细胞免受n k 细胞的溶解破坏，抑制u n k 细胞的活性，对胎儿 滋养层与母体组织融合起到重要的作用【2 5 】。 最近研究表明h l a - g 的a l 结构中的m e t 7 6 和g i n 7 9 参与了k i i l 2 d l 4 对 h l a g 的识别【2 6 】。总之，h l a e 分子和h l a g 分子一起成为维持母胎界面稳 定的重要机制之一。 3 本课题的研究意义 小鼠作为一种方便的实验材料来源，适合开展各种体内实验。所以建立有效 的小鼠子宫淋巴细胞分离方法并对小鼠u n k 细胞进行研究，是研究各种关于子 宫的生殖免疫问题的前提，有重要的临床意义。 由于分离和培养小鼠子宫淋巴细胞的难度较大，过去对于此群细胞的研究多 是采用组织形态学的方法。如免疫组化( i m m u n o h i s t o c b _ e m i s t r y ( i h c ) ) ，这就 受到抗体灵敏度的限制，而且需要较长时间的处理以及相当的技能。免疫组化的 另一个主要的弊端是，各实验室之间难于统一实验流程的标准。所以假阳性和假 阴性的可能性比较大。 流式细胞术是对处在快速直线运动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、 快速的定量分析和分选的方法。多参数流式细胞术分析可以用于研究细胞参数 ( 如核酸含量、酶活性、p h 值等) 、细胞表面受体的密度和分布，并且可以分 析不同的功能性细胞亚群。利用流式细胞术对小鼠子宫u n k 细胞的分析检测与 传统的方法相比具有较强的优势。在本实验中，我们用机械法分离了小鼠子宫淋 巴细胞，并用流式细胞术检测小鼠u n k 细胞的表型和分泌的细胞因子。这将有 助于我们了解子宫内膜植入位点附近免疫微环境，为探讨母体对半同种异体胚胎 的免疫耐受机制，尤其是高比例u n k 细胞所发挥的作用，奠定重要的实验基础。 1 7 中国科学技术大学硕士毕业论文吴晓妍 专业：细胞生物学 材料与方法 1 主要试剂 1 1 实验动物 8 1 0 周龄清洁级c 5 7 b l 6 j 小鼠，由中国科学院上海实验动物中心提供。实 验动物由中国科学技术大学实验动物中心饲养( s p f 级，2 2 。c ，5 5 湿度) 。 1 2p a s 染色试剂 1 2 1 m o d i f i e dh a r r i sh e m a t o x y l i n 购于s i g m ac h e m i c a l ；c a t a l o g u e 撑h h s 1 6 1