（细胞生物学专业论文）拟南芥菜基因arabidillo1结构和功能的初步研究.pdf

兰州大学博士论文 拟南芥菜举冈a r a b i d i l l o ，结构和功能的初步研究 中文摘要 本文的主要内容是对拟南芥基因a r a b i d i l l o - 1 进行的初步研究。我们首先 从已公布的拟南芥基因组数据库中获得了a r a b i d i l l o - 1 的相关信息，并对该基 因进行了生物信息学相关的初步分析。该基因长4 0 4 4 b p ，m r n a 全长2 7 9 3 b p ，表 达产物包含9 3 0 个氨基酸，该蛋白在n 端包含一个f - b o x 结构域，另外该蛋白还 含有多个a r m 结构域。然后本文从拟南芥中将a r a b i d i l l o 一克隆了出来，并通 过测序确认了该基因的全序列，同时将该基因的e d n a 克隆到t 一载体中，作为后 面的实验中a r a b i d i l l o 一- 的模板。 本文将a r a b i d i l l o - - 1 的e d n a 与荧光蛋白y f p 的基因分别插入植物双元表达 载体p k y l 7 1 中，然后分别利用花序法和叶盘法转化南芥和烟草。通过对转基因 植物材料的观察，发现a r a b i d i l l o - 1 蛋白定位在细胞核上。然后我们又克隆了 a r a b i d i l l o 一1 的上游启动子，并将其插入植物表达载体p b l l 2 1 中与6 u s 基因相 连，花序法转化拟南芥后，通过g u s 染色初步发现该蛋白在拟南芥的根，顶端分 生组织和子叶中有表达。此外本文还用r t - p c r 的方法进_ 步对a r a b i d i l l o - i 的组织定位进行了研究，试验表明该蛋白在拟南芥的根，茎，叶，花中都有表达， 而且在根和花中表达最多。同时我们购买了针对该基因t - d n a 插入失活的拟南芥 突变体，通过对该突变体的初步研究，发现该蛋白在g a 3 处理下对拟南芥侧根的 发育有影响，而k t ，6 一b a ，i a a ，2 ，4 - d 处理对突变体和野生型的影响都没有明 显区别。此外，我们还分别用高盐( 高浓度n a c l ) 及c a 2 + 阻断刺异博定 ( v e r a p a m il ) 处理突变体和野生型拟南芥，也没有发现突变体与野生型的表型 区别。 本文将a r a b i d i l l o - i 的c d n a 的全长插入到含有叻( b i n d i n gd o m a i n ) 结 构域酵母双杂载体p g b k t 7 中，与己构建到含有a d ( a c t i v ed o m a i n ) 结构域的酵 母双杂载体p g a d t 7 中的a s k 家族共十七个成员分别进行酵母双杂交，结果显示 a r a b i d i l l o - i 与a s k 2 和a s k l l 酵母双杂结果呈阳性，表明它们之白j 存在蛋白间 相互作用。在此基础上，我们又将a r a b i d i l l o - 1 分为不同的九个片段，分别与 n 兰i 、1 1 人学博l 论义似州卯采特冈a r o d l c l l l l o - i 端俐柙l 圳f i g 们制, - y 卅r 9 6 a s k 2 和a s k l l 进行杂交，结果发现a s k 2 和含有f - b o x 结构域的所有a r a b i d i l l o - 1 的片段都存在相互作用，而a s k l l 则只与仅缺少c 端的a r a b i d i l l o - - 1 的大片断 ( 包含卜7 5 0 个氨基酸) 存在相互作用，而与其余片断都不存在相互作用。除此 之外，本文还发现a r a b i d i l l o - 1 的同源物a r a b i d i l l o _ 2 只与a s k 2 存在相互作 用，而与包括a s k l l 在内的其它1 6 个a s k 家族成员都不存在相互作用。 a r a b i d i l l o - i 不能形成二聚体，而且a r a b i d i l l o 一1 和a r a b i d i l l o - 2 不能形成 异源二聚体。 由实验结果我们推测，a r a b i d i l l o - i 对侧根发育的影响是通过将某些抑制 侧根发育的蛋白因子连接到泛素连接酶e 3 上，进而促使这些蛋白因子的泛素化 降解而实现的。由于a r a b i d i l l o l 定为在细胞核内，所以我们推测这种影响也 可能是a r a b i d i l l o - i 在细胞核内通过参与对某些基因表达的调控而实现的。但 是我们还不明白为什么a r a b i d i l l o - - 1 对侧根发育的影响需要g a 的参与。 关键词：a r a s i d i l l o - i ，侧根，y f p ，g u s ，酵母双杂交，a r a b i d i l l o - 2 n 兰州大学博t 论文 拟南芥菜基嘲a r a b i d i l l o - i 结构和功能的初步研究 a b s t r a c t t h i ss t u d yf o c u s e so nt h ea r a b i d i l l o jw h i c hi sa l la r a b i d o p s i sg e n e w ef i r s tg e t s o m ei n f o r m a t i o na b o u ta r a b i d i l l o 1f r o mm a n yd a t a b a n k so fa r a b i d o p s i s ，a n d a n a l y z e di tu s i n gm a n ys o f to fb i o i n f o r m a f i c s t h ed n a o f a r a b i d i l l o jh a s4 0 4 4 b p a n dt h em r n ac o n t a i n s2 7 9 3b p ，a n di te x p r e s s e sap r o t e i nw h i c hh a s9 3 0a m i n o a c i d s a r a b i d i l l o 1h a sa nf - b o xd o m a i ni nt h en - t e r m i n a la n dt h e r ea r e9a n n d o m a i n si nt h em i d d l eo ft h i sp r o t e i n w ec l o n e dt h eg e n eo fa r a b i d i l l o jf r o mt h e a r a b i d o p s i s , a n dc o n f i r m e dt h es e q u e n c eo ft h i sg e n e a tt h es a m et i m e ，w ei n s e r t e d t h i sg e n ei n t ot h ev e c t e ro f p u c m t ，a n dt h i sc o n s t r u c t e dv e c t o rw a su s e da st e m p l a t e o f a r a b i d i l l o ji nt h ef o l l o we x p e r i m e n t s t h ea r a b i d i l l o 1a n dy f pf u s i o np r o t e i nh a sb e e nc o n s t r u c t e di n t ot h e b i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o rp k y l 7 1a n dc o n t r o l l e db yc a m v 3 5 sp r o m o t o r t h e a r a b i d i l l o - 1 y f ph a sb e e nt r a n s f e r r e dt oa r a b i d o p s i su s i n gt h ef l o r a ls p r a y t r a n s f o r m a t i o nm e t h o da n dt o b a c c ou s i n gt h el e a fd i s cm e t h o d , a n dt h ey f p f l u o r e s c e n c ei nt h en u c l e ii nm a n yt i s s u e so f t r a n s g e n i cp l a n t sh a sb e e no b s e r v e dw i t h f l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e t h e nw ec l o n e dt h ep r o m o t e ro f a r a b i d i l l o - ja n di n s e r t e di t i n t op b l l 2 1w h i c hi sab i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o ra n dc o n t a i n sg u sg e n e a f t e r t r a n s f e r r e dt h i sv e c t o ri n t oa r a b i d o p s i su s i n gt h ef l o r a ls p r a yt r a n s f o r m a t i o nm e t h o d ， i ti sf o u n dt h a tt h i sg e n ew a sa l le x p r e s s e di nt h er o o t ，s t e m ，l e a f , a n df l o w e r ，a n di n t h er o o ta n df l o w e ri tw a se x p r e s s e dv e r ym u c h w ea l s op u r c h a s e dt h ea r a b i d o p s i s t - d n ai n s e r t i o n a lm u t a n tl i n e so fa r a b i d i l l o 一1 f r o mt h es t u d yo ft h i sm u t a n t ，w e f o u n dt h a ta r a b i d i l l o 一1c a na f f e c tt h ed e v e l o p m e n to fl a t e r a lr o o ti nt h eh e l po f g a 3 ，w h i l ek t ，6 - b a ，i a a ，2 , 4 一dh a v en od i f f e r e n te f f e tt ow i l da r a b i d o p s i so r m u t a n t w ea l s of o u n dt h a th i g nc o n c e n t r a t i o no fi o na n dv e r a p a m i lw h i c hi sc a 2 + b l o c k e rh a v en od i f f e r e n te f f c tt ow i l do rm u t a n tt o o i nt h i ss t u d y , t h ea r a b i d i l l o - 1w a si n s e r t e di n t ot h ev e c t o ro fp g b k t 7w h i c h c o n t a i n st h ed n a b i n d i n gd o m a i n ，a n dw a sh y b r i d i z e dw i t ht h e1 7m e m b e r so f a s k i v 兰州人学博i ：论立 拟南芥菜筚嘲a r a b i d d l o - 1 结构和功能的初步研究 f a m i l yw h i c hh a v eb e e ni n s e r t e di n t op g a d t 7 ( c o n t a i nt h ed n a a c t i v ed o m a i n ) t h e r e s u l ts h o w e da r a b i d i l l o 一1c a l li n t e r a c tw i t ha s k 2a n da s k l l t h e nw ed i v i d e d a r a b i d i l l o 一1i n t o9s e g m e n t s ，a n dt h o s e9s e g m e n t sw e r eh y b r i d i z e dw i t i la s k 2 a n da s k l1 i tw a sf o u n dt h a ta s k 2c a l li n t e r a c tw i t l la l ls e g m e n t so f a r a b i d i l l o - 1w h i c hc o n t a i nt h ef ，b o xd o m a i n ，b u ta s k llo n l yc a l li n t e r a c t 撕t h t h eb i gs e g m e n to n l yw i t h o u tt h ec - t e r m i n a lo fa r a b i d i l l o 一1 t h i ss t u d ya l s o f o u n dt h a tt h eh o m o l o g yo f a r a b i d i l l o - 1 a r a b i d i l l o - 2c a no n l yi n t e r a c tw i t h t h ea s k 2o f1 7m e m b e r so fa s kf a m i l y ，i no u rs t u d y , w ea l s of o u n d a r a b i d i l l o 1c a l l n o tf o r mh o m o d i m e ra n da r a b i d i l l o 1a n d a r a b i d i l l o 2c a l ln o tf o r mh e t e m d i m e rt o o f r o mo u rs t u d y w eg u e s st h a tt h ee f f e c to fa r a b 【d l l l o lt ot h ed e v e l o p m e n t o fl a t e r a lr o o ti st h r o u g hu b i q u i t i n p r o t e a s o m ep a t h w a y , b e c a u s ea r a b i d i l l o 1 m a y b ec a l ll i n ks o m ei n h i b i t o ro fd e v e l o p m e n t o fl a t e r a lr o o tt oe 3u b i q u i t i n p r o t e i n | i g a s e ，a n d t h e n p r o m o t e st h ed e g r a d a t i o no ft h i si n h i b i t o r w h i l e ，b e c a u s e a r a b i d i l l o 一1l o c a t e si nt h en u c l e u s ，i t s e f f e c tt ot h ed e v e l o p m e n to fl a t e r a lr o o t a l s oi sb e c a u s ei tc a na f f e c tt h ee x p r e s s i o no fs o m eg e n e b u tw eh a v en o tk n o w nw h y t h ee f f e c to fa r a b i d i l l o - lt ot h ed e v e l o p m e n to fl a t e r a lr o o tn e e d st h eh e l po f g a k e yw o r d s ：a r a b i d i l l o 1 ，l a t e r a lr o o t ，y f eg u s ，y e a s tt w o h y b r i d ， a r a b i d i l l 0 2 v 兰州凡学 尊i ：论空拟南芥菜罐l 捌a v a b m d l o - j 结构祁功能的初步研究 a m p a r c l a r m a r f a s k a t r o p 6 c b c f p c o p l d u b e l e 2 e 3 f a c t g a 6 f p g u s i a t s h d a c s h i s h k m t s h p l h u b h y g i p t g k a n l e u n l s p i k k s p c r s c f s d i o t r p u b u r m x g a l y f p 3 一a t a b b r e v i a t i o n s a m p i c i l l i n a r mr e p e a t - c o n t a i n i n g1 a r m a d i l l o a u x i nr e s p o n s ef c t o r a r a b i d o p s i s 。s k p i 1i k e a r a b i d o p s i sr h oo fp l a n t s6 c a r b e n i c i l l i n e y a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n c o n s t i t u t i r ep h o t o m o r p h 。g e n e s l s l d e u b i q u i t i n a t i n ge n z y m e s u b i q u i t i n a c t i v a t i n ge n z y m e u b i q u i t i n c o n j u g a t i n ge n z y m e u b i q u i t i np r o t e i nl i g a s e f a c i l i t a r e sc h r o m a t i nt r a n s c r i p t i o n g i b b e r e l l i n g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n d g l u c u r o n i d a s e h i s t o n ea c e t v n r a n s f e r a s e h i s t o n ed e a c e t v l a s e s h i s t i d i n e h i s t o n em e t h v l t r a n s f e r a s e s h e t e r o c h r o 日a t i np r o t e i n1 h o m o l o g o u st ou b i q u i t i n h y g r o m y c l n i s o p r o p y l b d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n a m y c i n l e u c i n e n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l p h o s p h a t i a y l i n o s i t o l 3 一k i n a s e l i k ek i n a s e s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s k p 吒u l l i n f b o x s m a l lu b i q u i t i n r e l a t e dm o d i f i e r t r y p t o p h a n e u b i q u i t i n u b i a u i t i n r e l a t e dm o d i f i e f 5 - b r o m o 一4 一c h o r o 一3 一i n d o l y l 一b 一一g a l a c t o p y r a n o s i d e y e ll o wf 】n o r e s c e n tp r o t e i n 1 。2 ，4 - t r i a z o l 一3 - a m i n e 氨苄青霉素 犰狳重复序列的蛋白1 犰狳 生长素应答因子 拟南芥s k p l 相关蛋白 拟南芥r h o 蛋白6 羧卞青霉素 蓝绿色荧光蛋白 组成性光形念发生l 去泛素化酶 泛素活化酶 泛素结合酶 泛素蛋白连接酶 染色质转录易化因子 赤霉素 绿色荧光蛋白 b 一葡萄糖醛酸酶 蛋白乙酰转移酶 组蛋白去乙酰转移酶 组氨酸 组蛋白甲基化转移酶 异染色体相关蛋白 泛索类似物 潮霉素 异丙基_ bd 一硫代半乳糖苷 卡那霉素 亮氨酸 核定位信号 类磷脂酰肌醇一3 一激酶 聚合酶链式反应 泛素相关小修饰 色氢酸 泛素 泛素相关修饰 5 一溴叫一氯一3 一吲哚 一d - d 一半乳糖营 黄色荧光蛋白 3 一氨基一1 h 一1 ，2 4 - 三氨唑 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下 独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或 未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经 注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：镡 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产 权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论 文的规定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸 质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以 将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使 用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名 单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：箍绉 饥一微 师签名：趔池么；蚓 2 珥铷s 阳 第一部分前言 一组蛋自修饰及其变异体的研究进展 染色质是非常稳定的，d n a 大分子包裹在染色质里以保持其完整性。染色质 的基本单位是核小体，它是由h 2 a ，h 2 b ，h 3 和h 4 这四种核心组蛋白聚合而成的 八聚体，而且已知每个核小体可容纳1 4 7 个碱基。组蛋白翻译后的共价修饰已发 现多年，而直到最近人们才逐渐认识到这种修饰对转录调节的重要作用。组蛋白 翻译后的共价修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、a d p 核糖基化和糖基 化等。这些修饰都发生在组蛋白的氮端，而氮端正是朝向核小体外面的一端。d n a 在核小体中的凝聚可以调节调控因子与d n a 的结合的难易，而组蛋白的共价修饰 可以改变核小体的动态结构，从而影响这种调节。研究表明组蛋白乙酰化可以降 低核小体之间相互作用以及核小体尾部与连接d n a 的相互作用，从而使d n a 更容 易被调控因子接近，所以组蛋白乙酰化与转录激活有关。与乙酰化不同，组蛋白 的甲基化并不引起核小体的这种变化。然而这两种修饰在调控调节蛋白与d n a 结合的作用中都起到重要的作用。由此发现了一种新的基因调控手段；通过对组 蛋白的共价修饰来调控众多的生物学过程( r o b e r t ，2 0 0 3 ) ，例如，如果h 4 的 l y s l 6 不能乙酰化的同时如果l y s 2 0 不能甲基化，往往是的癌症发生特征( m a r i o ， 2 0 0 5 ) 。各种肿瘤病人的d n a 甲基化和组蛋白修饰往往发生异常改变，这就为我 们研究和开发表观遗传新药( e p i g e n e t i cd r u g s ) 提供了方向( j u r g e n ，2 0 0 6 ) 。 研究表明储存在基因组中的遗传信息并不是被顺式元件严格地调控的，这将 人们研究的焦点集中在一个表观遗传的基础问题上：基因表达水平的可遗传的变 化是如何不通过d n a 序列变化而维持的。很多可以识别组蛋白共价修饰尾端的蛋 白己被发现，例如，一些蛋白能通过溴基结构域( b r o m o d o m a i n s ) 或发色结构域 ( c h r o m o d o m a i n s ) 特异的识别组蛋白乙酰化或甲基化的残基。这个发现进一步 证实共价修饰的组蛋白可作为一个标签或者结合位点来推动下游反应以改变基 因表达( t u r n e r ，1 9 9 2 ；s t r a h l ，2 0 0 0 ) 。组蛋白密码( h i s t o n ec o d e ) 理论也表明与基因表达有关的信息以共价修饰的形式储存在染色质内部，例如， 某些组蛋白的甲基化被证明是染色质上特定基因甚至是某个染色质区域激活或 抑制的信号。所以，和d n a 甲基化一起，组蛋白的共价修饰对表观遗传的维持与 控制具有决定性作用( r o b e r t ，2 0 0 3 ) 。 大部分生物体的主要组蛋白都有多个高度相似的基因拷贝，这些基因大都在 细胞的s 期表达，编码绝大部分的组蛋白。组蛋白是我们已知的进化最慢的蛋白 之一，然而己经发现与相应组蛋白在初级序列上有明显差异的非等位组蛋白变异 体( v a r i a n t s ) 。这些变异体的基因大部分是单拷贝的，而且它们的表达并不局 限于细胞的s 期，而是在整个细胞周期都有表达。与主要的组蛋白不一样，组蛋 白变异体基因含有内含子，而且转录产物经常是多聚腺苷化的，这些特征被认为 在相应蛋白的转录后调节过程中起重要作用( o l d ，1 9 8 4 ) 。在发育和分化过程中， 一些组蛋白变异体可以与原来存在的主要组蛋白发生交换而起到替代物的作用 ( b r a n d t ，1 9 7 9 ；b o s c h ，1 9 9 5 ) 。而这种取代经常导致在某些分化的细胞中这些 组蛋白变异体占据统治地位( p i n a ，1 9 8 7 ) 。所有这些都表明，组蛋白变异体在 细胞生物学中具有特异的功能。 在体内组蛋白经常由一系列的酶对其进行翻译后修饰，这种修饰巧妙而特异 的改变了染色质中组蛋白的特性。与核心组蛋白( c o r eh i s t o n e ) 的修饰一样， 组蛋白变异体的共价修饰也具有很多生物学功能。组蛋白变异体共价修饰的变化 可以帮助它们定位在染色质上或使它们从染色质上脱离。这种变化也可能影响染 色质的高级结构从而影响某些非组蛋白与染色质的结合。含有组蛋白变异体的核 小体的存在可能会改变染色质纤维的特点，而且组蛋白变异体的修饰甚至可能会 调节染色质的动态变化。尽管对组蛋白变异体修饰的研究很有限，但可以肯定的 是这些修饰对这些蛋白正常功能的发挥非常重要。 1 组蛋白的修饰 核心组蛋白尽管在进化上表现得很保守，结构也非常稳定，然而却含有一个 柔韧的氮端尾巴，而且氮端的许多氨基酸( 见表1 ) 可进行翻译后共价修饰如磷 酸化，乙酰化，甲基化，泛素化等( j e n u w e i n ，2 0 0 1 ；t u r n e r ，2 0 0 2 ) 。组蛋白 经过特异性修饰后与能够与识别此修饰残基的蛋白相结合。组蛋白翻译后的修饰 能够调节染色质的结构，例如，它能够降低组蛋白和d n a 的相互作用的程度以使 染色质结构变得松散，从而促进某些相关生物学反应；同时这种修饰在染色质遗 传过程中也具有重要作用( r o b e r t ，2 0 0 3 ) 。组蛋白密码理论( h i s t o n ec o d e t h e o r y ) 表明组蛋白修饰与其随后介导的蛋白结合共同参与某些特定的生物学 反应( s t r a h l ，2 0 0 0 ) 。这种理论同时认为染色体不同区域具有不同的功能与这 些区域具有不同的组蛋白修饰有关，因为不同的修饰会招募不同的染色质结合复 合物与其结合。 表1 各种组蛋白主要的共价修饰的位点 1 1 组蛋白甲基化 组蛋白的甲基化和d n a 甲基化一起建立了一个保证表观遗传稳定的长效机 制。研究表明组蛋白甲基化参与了短期和长期的转录调控，并且在维持大多数染 色体的结构稳定过程中起作用( r o b e r t ，2 0 0 3 ) 。最近人们还发现组蛋白甲基化 在双链d n a 的断裂修复中扮演重要角色( v i d a n e s ，2 0 0 5 ) 。赖氨酸( l y s ，k ) 的甲基 化修饰是最常见的甲基化修饰，而且它在转录调控中的作用非常重要，所以本文 以它为代表阐述甲基化修饰。 已知异染色质所介导的基因的表观沉默需要能与组蛋白结合的异染色体相 关蛋白( h p l ) 的参与。在此过程中组蛋白甲基转移酶( h k m t s ) ，组蛋白去乙酰 化酶( h d a c s ) 和h p l 相互作用，同时在h 3 一k 9 修饰的帮助下，形成异染色质 ( r o b e r t ，2 0 0 3 ) 。由于组蛋白前面发生的修饰往往能影响后续的修饰，所以组 蛋白共价修饰之间的相互影响是非常复杂的。已知h 3 一k 9 的甲基化与x 染色体( x i ) 失活有关( h e a r d ，2 0 0 5 ；p e t e r s ，2 0 0 2 ) ，而且失活的x 染色体往往还带有三甲 基化的h 3 一k 2 7 ，所以h 3 一k 2 7 - - 甲基化在x 染色体的失活过程中也扮演重要角色 ( p l a t h ，2 0 0 3 ) 。研究表明h 3 一k 2 7 和h 3 一k 9 甲基化分别是x 染色体的形成和维持两 个不同时期的特征。x 染色体失活是通过x i s tr n a 调解的r n a 依赖过程建立的， x i s tr n a 能促进含有e z h 2 的且具有h 3 一k 2 7 甲基化活性的复合体的形成( p l a t h ， - 3 2 0 0 3 ) ，而且这个复合体不光能将第2 7 位赖氨酸甲基化，而且能甲基化第9 位赖氨 酸( c z e r m i n ，2 0 0 2 ) 。这种修饰在转录抑制中的作用机制到目前还不清楚。 与异染色质所造成的组成型转录抑制不同，d n a 序列特异性的抑制可能需要 另外的特异性因子参与，这种因子有可能是一种d n a 序列特异性结合蛋白。例如 含有发色结构域( c h r o m o d o m a i n s ) 的聚合梳( p o l y c o m b ) 蛋白能与甲基化的h 3 - k 2 7 特异性结合( c z e r m i n ，2 0 0 2 ) 。由此而导致具有点特异性的聚合梳抑制复合体的 形成。尽管聚合梳和h p l 不能结合到同一个甲基化残基上，但它与同源修饰的组 蛋白尾巴( h 3 一k 2 7 ) 的结合和h p l 对h 3 一k 9 的识别具有相似的特异性。有趣的是， 报告基因与h p l 的结合发生在特异性的启动子区域，而且这种结合不会促进h p l 定位的扩散而促进异染色质的形成( a y y a n a t h a n ，2 0 0 3 ) 。所有这些都表明，尽 管在常染色质和异染色质的转录抑制区都存在h 3 - k 9 的甲基化以及h p i 的结合，但 它们是通过不同的途径调控下游的转录抑制的。体外和活体实验都表明h 4 - k 2 0 的甲基化能抑sj j h 4 一k 1 6 的乙酰化，而h 4 一k 1 6 的乙酰化正是果蝇雄性x 染色体活跃 表达的标志( t u r n e r ，1 9 9 2 ) ，也是人类细胞染色质活跃表达的标志( j o h n s o n ， 1 9 9 8 ) 。所以，甲基化的b 4 一k 1 6 可以看作是转录抑制的一个表观标记( n i s h i o k a ， 2 0 0 2 ) 。综上所述，到目前为止h 3 一k 9 ，h 4 一k 2 0 和h 3 一k 2 7 甲基化是组蛋白共价修 饰中与大范围或染色体水平上转录抑制相关的修饰( r o b e r t ，2 0 0 3 ) 。研究同时 表明，h 3 一k 9 和d n a 甲基化能共同作用而建立一个转录调解的长效机制( r o b e r t ， 2 0 0 3 ) 。 研究表明常染色质某些特殊区域的组蛋白甲基化能在一定程度上抵消真核 细胞内的多重转录沉默机制( r o b e r t ，2 0 0 3 ) 。h 3 - k 4 的甲基化能特异地削弱 s u v 3 9 h l 所介导的h 3 一k 9 甲基化，从而阻碍了异染色质形成的一个主要途径 ( n i s h i o k a ，2 0 0 2 ) 。研究同时发现h 3 一k 4 的双甲基化也能大规模破坏沉默机制， 理由是h 3 一k 4 的双甲基化是普遍存在于常染色质上的表观性标志，另外h 3 一k 4 的三甲基化也与转录激活相关( n g ，2 0 0 3 ) 。研究还发现，h 3 一k 7 9 的甲基化参与 了阻止异染色质扩散的过程。在酵母中沉默的交配型位点( m a t i n g t y p el o c u s ) 和端粒往往表现为h 3 - k 7 9 甲基化不足，而在转录活化区域则不存在这种现象 ( n g ，2 0 0 3 ) 。h 3 一k 7 9 甲基化能通过阻止沉默蛋白( s i f e n c i n gp r o t e i n s ) 的结 合而抑制基因沉默。所以，h 3 - k 4 和h 3 一k 7 9 的甲基化都能通过阻止异染色质的 扩散而有助于常染色质的形成。 除了在染色质上建立大范围的能促进转录起始复合物形成的转录激活区外， 组蛋白甲基化在转录延伸过程中也扮演重要角色( h a m p s e y ，2 0 0 3 ) 。染色质免疫 沉淀( c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n ) 试验表明h 3 一k 4 的三甲基化可以被积聚 在基因5 - m r n a 编码区的s e t l 所催化，同时发现它与转录的早期相关( n g ，2 0 0 3 ： s a n t o s r o s a ，2 0 0 2 ) 。研究还发现，s e t 2 特异性的与r n a p i i 的延伸形式相关( l i ， 2 0 0 2 ) ，而且s e t 2 介导的h 3 一k 3 6 甲基化与h 3 一k 4 双甲基化正是转录延伸后期阶段的 特征。s e t l 介导的h 3 一k 4 三甲基化在转录延伸后最多可以维持5 小时，这样就对最 近转录的基因建立了一个短期的记忆机制( n g ，2 0 0 3 ) 。据推测，某些特定的组 蛋白甲基化修饰可同时参与基因转录的短期和长期维持的调控，而且甲基化的水 平可能还参与调节下游事件。一方面h 3 一k 7 9 甲基化在成熟细胞和胚胎细胞中表现 出不同的作用方式，从而展现出这种修饰在不同的位点具有不同的动态分布的特 点( i m ，2 0 0 3 ) ；另一方面，h 3 一k 7 9 除了在限制异染色质的扩散方面起重要作用 外，还可作为一个基因特异性的标记。综上，h 3 一k 4 和h 3 一k 7 9 通过表观的，动态 的和短期的机制来界定染色质的转录激活区。 1 2 组蛋白乙酰化 组蛋白乙酰化是核心组蛋白氮端赖氨酸的一种可逆的共价修饰。已知组蛋白 氮端在基因被包裹进高度压缩的染色质纤维的过程中起作用，而它们的乙酰化则 可使染色质局部结构变得松散从而为d n a 的转录，复制，修复，重组以及配子形 成等生物学过程提供条件。例如，组蛋白h 4 一k 1 6 的乙酰化就在控制染色质的结构 和蛋白间相互作用中起作用( s h o g r e n k n a a k ，2 0 0 6 ) 。研究表明组蛋白乙酰化的 增强能提高基因的转录水平，而乙酰化的降低则可使基因处于抑制和沉默状态； 另外，最近的研究表明组蛋白乙酰化水平的转换与核小体重塑复合体 ( r e m o d e l i n gc o m p l e x e s ) 共同直接参与基因转录的调节。组蛋白乙酰转移酶 ( h a t s ) 和组蛋白去乙酰转移酶( h d a c s ) 的相互作用使染色质结构以及基因转 录水平处于动态的变化过程中，所以可以断定，h a t s 和h d a c s 在生物发育过程中 扮演非常重要的调节角色。 某些特殊的组蛋白乙酰化模式可以改变核小体纤维的折叠状态，而使染色体 某些区域的结构变得松散，从而为参与转录起始的相关因子与染色质的结合创造 一个有利的环境，以此增强转录起始的频率。研究同时发现染色体松散的结构也 有利于转录的延伸，因为在转录延伸过程中核小体能妨碍r n a 聚合酶与d n a 模板的 结合，r n a 聚合酶需要剔除核小体上的组蛋白八聚体结构才能起始转录延伸的过 程( s t u d i t s k y ，1 9 9 7 ) 。所以转录在组蛋白高度乙酰化的d n a 模板上所遇到的阻 力比在没有乙酰化的模板上的阻力要小得多( p r o t a c i o ，2 0 0 0 ) 。乙酰转移酶可 以通过两种方式促进转录延伸，一种是作为转录延伸因子复合体如f a c t ( f a c i t i t a t e sc h r o m a t i nt r a n s c r i p t i o n ) 的一种成份( j o h n ，2 0 0 0 ) ，另一种 是它自身可作为一个转录延伸的活性中心( w i t t s c h i e b e n ，1 9 9 9 ) 。即使在没有 紧密折叠的核小体纤维中，单个的核小体仍然能有效地阻碍许多转录因子与它们 的结合蛋白的相互作用( s t r u m ，1 9 9 8 ) 。高度乙酰化的核小体由于在某些情况 下对与其相互作用的因子限制较少( a n d e r s o n ，2 0 0 1 ) ，所以能降低核小体对与 其末端结合的d n a 的限制( k r a j e w s k ，1 9 9 8 ) 。研究表明，乙酰化本质上对核小体 结构的影响是非常有限的( w a n g ，2 0 0 0 ) , 除此之外，组蛋白特殊的乙酰化方式 能促进染色质结构的其它调节成分与染色质的结合。所以，伴随转录活性改变的 启动子结构的动态变化可能并不是乙酰化的直接作用结果，而应归因于很多因子 相互协调共同作用( e b e r h a r t e r ，2 0 0 2 ) 。这包括其它的共价修饰如磷酸化以及 由核小体滑动因子( r e m o d e l i n gf a c t o r s ) 所造成的组蛋白核小体相对于d n a 的重排。最近的研究也表明，k 5 6 乙酰化在d n a 双螺旋缠绕核小体过程中像开关一 样调节组蛋白与d n a 的相互作用( x u ，2 0 0 5 ) 。 尽管早期的实验就表明组蛋白乙酰化是一个快速且可逆的过程( d e l a n g e ， 1 9 7 1 ) ，但直到最近参与此过程的许多酶才被鉴定出来，而且发现许多乙酰转移 酶能够作用于特异的组蛋白，甚至能特异识别核心组蛋白氮端上特异的的赖氨 酸。去除乙酰化组蛋白上的乙酰基需要许多具有组蛋白特异性的去乙酰化酶的参 与，而且h d a c 已被证明在转录抑制以及基因和染色质沉默中扮演重要角色 ( b e r t o s ，2 0 0 1 ) 。另外，在核小体包装新合成的d n a 时也观察到了组蛋白h 4 的去 乙酰化( r i d g w a y ，2 0 0 1 ) 。一般来说，组蛋白乙酰化转换的速度和特征与组蛋白 的种类以及细胞的类型和特性等都密切相关( w a t e r b o r g ，2 0 0 2 ) 。组蛋白的乙酰 化被普遍认为是染色质状态的特征，它们参与调节基因的转录，激活和抑制。此 外，许多研究还表明，组蛋白高低乙酰化在肿瘤发生中起重要作用( y a n g ，1 9 9 6 ； l o p r e v i t e ，2 0 0 5 ) 。 根据组蛋白乙酰化的动态特征，我们可以将染色质分为三种功能状态 ( w a t e r b o r g ，2 0 0 2 ) 。第一种是即使用去乙酰化酶抑制剂处理染色质也不能高 度乙酰化的状态，这也是染色质最不活跃的一种状态。在复制过程中，新合成的 组蛋白进入细胞核时就需要染色质处于低水平的组蛋白乙酰化状态，然后染色质 与核内的乙酰转移酶和去乙酰化酶进行短期的相互作用。一旦核小体被装配成高 度压缩的异染色质状态，这种相互作用就停止而使组蛋白乙酰化处于静止状态 ( w a t e r b o r g ，1 9 8 3 ) 。异染色质高度压缩的状态妨碍了乙酰转移酶与染色质的相 互作用，此时即使用h d a c 抑制剂如丁酸盐或t s a 处理也无济于事。染色质的第二 种状态的特点是组蛋白乙酰化动态变化的速度非常慢，绝大部分细胞内的染色质 都处于这种状态。在此状态之下，当去乙酰化酶被丁酸盐或t s a 抑制时