（细胞生物学专业论文）植物双抗表达载体的构建及其功能鉴定.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：至篮色 日期：塑堕、垒- 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：邋导师签名：醴日期：兰! ! ! ：苎：! 出盔太生殛茔缸量幺窑 摘要 本工作利用d n a 重组技术构建了三个植物表达载体：p c a m b i a l 3 0 0 - a t n h x l a l s 、p c a m b i a l 3 0 0 一b e t a a l s 和p r o k 2 一a s p l d t - a l s 。基因a t n h x i 编码拟南 芥液泡膜上的n a + h + 反向转运蛋白。在盐胁迫条件下，n d h + 反向转运蛋白被激活， 将n a + 泵入液泡储存起来以消除离子毒害，从而提高植物耐盐性。b e t a 基因来自大肠 杆菌，编码胆碱脱氢酶( c d h ) ，它能够催化胆碱形成甜菜碱。转b e t a 基因的植物 积累甘氨酸甜菜碱的能力增强，因而抗逆性得到提高。a s p l d t 基因来自蓖麻，是p l d y 的反义基因，p 研编码磷脂酶d ，该酶活性降低可减轻细胞遭受胁迫后的膜结构损 伤和正常代谢功能的下降。乙酰乳酸合成酶( a e e t o l a e t a t es y n t h a s e ，a l s ) 是分支氨基 酸合成中的关键酶，也是磺酰脲类除草剂的作用位点。拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 的a l s 基因中特定碱基发生突变，使之对该类除草剂表现出抗性。 用c a m v 3 5 s 启动子启动的a s 基因代替p c a m b i a l 3 0 0 - a t n h x 1 和p c a m b i a l 3 0 0 b e t a 上的潮霉素抗性基因( 助f ) 作为选择标记，得到p c a m b i a l 3 0 0 - a t n h x l a l s 和 p c a m b i a l 3 0 0 - b e t a - a l s 。另外，根据p a c t l a l s 的序列设计引物，用l ap c r 的方法 扩增质粒p a c t l a l s 得到由来自水稻的a c t i n l 启动子启动的a s 基因。以a c t l - a l s 为选 择标记基因代替p r o k 2 一a s p l d t 中的卡那霉素抗性基因( n p t i i ) ，得到植物表达载体 p r o k 2 a s p l d y - a l s 。 这三个植物表达载体上携带的目的基因分别为耐盐相关基因a t n h x i 、b e t a 、反 义凡所，选择标记基因为抗除草剂的口b 基因( 同时也可作为目的基因) 。本工作将 两个具有重要农艺价值的基因( 抗逆基因和抗除草剂基因) 重组入一个植物表达载体 中，为获得双抗转基因植株提供适宜转化质粒。得到的转基因植株不仅表现出转入主 要目的基因的预期性状如耐盐性，而且还表现出除草剂抗性。用除草剂筛选转化植株 有效减少了转基因植株检测工作量，而且提高了转基因食品的安全性。从生物安全性 的角度看，人们对转基因作物中存在的抗生素抗性基因往往有顾虑，选用抗除草剂基 因代替抗生素抗性基因作为选择标记具有积极的意义。 采用农杆蘸介导法转化烟草叶盘，获得了双抗( 抗除草剂、耐盐) 转基因植株。 p c r 检测结果表明，同一载体上的两个基因转入到大部分转化植株中。 p c a m b i a l 3 0 0 - a t n h x i a l s 、p c a m b i a l 3 0 0 b e t a - a l s 转化的烟草再生植株耐盐性和除 草剂抗性均有显著提高。与对照植株相比，耐盐性提高了i ( p an a c i 浓度，除草齐q 抗 鬻奎叁冀堑圭黧垡婆壅 ：= 瞧提囊了约t 0 0 0 整。s o u t h e r n 杂交结暴表明，a t n h x l 基鑫邑缝整合墅l 爆草数染色锩 上。对转a t n h x l 基因的t 1 代烟草植株喷洒5 0 0 m g l 的除草剂绿黄隆，其存活率为 7 2 。7 ，瑟霹照攘拣在1 0 0 m g l 豹除荤裁浓疫下羧已经全寒死亡，表绢a l s 基因在转基 因植抹后代中正常表达。关于植物表达裁体p r o k 2 a s p l d 7 一日妇的在转基因植株中的 表达磷究强蓊溺在迸孪予。 关疆诵：植物表达载体，基因藏组，a t n h x i ，b e t a ，a s p l d 7 ，a b ，遗传转他 2 当奎奎茎堡圭茎堡垒塞： = ： a b s t r a c t w i t ht h et e c h n o l o g yo fd n ar e c o m b i n a t i o nt h r e ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r sw c r e c o n s t r u c t e d ：p c a m b i a l 3 0 0 - 4 t n h x i a s ，p c a m b i a l 3 0 0 - b e t a - a l sa n dp r o k 2 一a s p l d y a l s t h ea t n h x ig e n e ，w h i c he n c o d e sn a + i ra n t i p o r t , w a sc l o n e df r o mt h ev a c u o l a r m e m b r a n ei na r a b i d o p s i s u n d e rs a l ts t r e s s ，t h en a + h * a n t i p o r tt r a n s p o r t sn a + i n t ot h e v a c u o l et oa v e r tt h ed e l e t e r i o u se f f e c t so f n a * i nt h ee y t o s o la n dm a i n t a i n so s m o t i cb a l a n c es o t h a tt o i m p r o v e t h es a l t - t o l e r a n c e o f # a n t s t h eb e t ag e n e ，w h i c h e n c o d e sc h o l i n e d e h y d r o g e n a s e t h a tc o n v e r t sc h o l i n ei n t og l y c i n e b c t a i n e ，h a sb e e nc l o n e df r o me s c h e r i c h i a c o l i t h et r a n s f o r m a t i o na n de x p r e s s i o no f 施“g e n em a k e sp l a n t sh a v eh i g h e ra b i l i t yt o a c c u m u l a t eg t y c i n e b e t a i n ea n ds u s t a i ns a l i n i t ys t r e s s p l d tt h a te n c o d e sp h o s p h o l i p a s e d c o m e sf r o mc a s t o r - o i lp l a n ta n da s p l d ti si t sa n f i s e n s eg e n e a c e t o l a c t a t es y n t h a s ei st h ek e y e n z y m ei nt h eb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f b r a n c h e dc h a i na m i n oa c i d s i ti sa l s ot h et a r g e to f s u l f o n y l u r e a h e r b i c i d e s t h em u t a t i o no f s p e c i f i cb a s ei na so f a r a b i d o p s i st h a l i a n ae n a b l e s t h ep l a n tt or e s i s tt h eh e r b i c i d e p c a m b i a l 3 0 0 - 4 t n h x l - a l s a n d p c a m b i a l 3 0 0 - b e t a a s w e r eo b t a i n e d b y r e p l a c i n gh p tg e n ew i t h a sg e n ed r i v e nb yc a m v 3 5 s p r o m o t e r t h ep l i l l l e r sw e r ed e s i g n e d a c c o r d i n g t ot h es e q u e n c eo f p a c t l - a l sa n d t h eg e n ea l sd r i v e nb yp r o m o t e ra c t ld e r i v e d f r o mr i c ew a sa m p l i f i e db yl ap c r t oc o n s u u c tp r o k 2 - a s p l d t - a l s ，t h em a r k e rg e n e n p t l ii np r o k 2 一a s p l d r w a ss u b s t i t u t e db ya c t l - a l s i nt h et h r e ep l a n te x p r e s s i o nv e e t o r s ，t h et a r g e tg e n e sa f ea t n i t x l ，b e t aa n da n t i s e n s e p l d 、r e s p e c t i v e l y a l s i sas i n g , l ed o m i n a n tn u c l e a rm u t a t e dg e n e , w h i c hi sn o to n l ya s e l e c t i o nm a k e rg e n eb u ta l s oa t a r g e tg e n e t oo b t a i nd o u b l er e s i s t a n tt r a n s g e n i cp l a n t s ， a p p r o p r i a t ep l a s r n i d sw e r ec o n s t r u c t e db yi n s e r f i n n gt w ok i n d so fg e n et h a th a si m p o r t a n t a g r o n o m i cv a l u ei n t oo n ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r t h en a n s g e n i cp l a n t sh a v e n o to n l yt h e e x p e c t e dt a r g e tc h a r a c t e r s u c h8 ss a l t - t o l e r a o e eb u ta l s oh e r b i c i d er e s i s t a n c e u s i n ga l sg e n e a ss e l e c t i o nm a r k e rg e n ec a nd e c r e a s et h ew o r k l o a do fs c r l ：e i l i n gt r a n s g e n i cp l a n t sa n d i m p r o v et h eb i o l o g ys e c u r i t yo ft r a n s g e n i c f o o d i na d d i t i o n , p e o p l eo f t e nw o r r ya b o u tt h e a n t i b i o t i cr e s i s t a n tg e n ei nt r a n s g e n i cc r o p s s or e p l a c i n ga n t i b i o t i cr e s i s t a n tg e n ew i t h h e r b i c i d er e s i s t a n tg e n ea ss e l e c t i o nm a k e r g e n e h a sm o r e p o s i t i v em e a n i n g d o u b l er e s i s t a n c e t r a n s g e n i c t o b a c c ow a sa c h i e v e db ya g r o b a c t r i u mm e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n n er e s u l t so fp e ra s s a yi n d i c t e de x o g e n o u st a r g e tg e n e sh a v eb e e n t r a n s f e r r e di n t om o s to fp l a n t s i nt r a n s g e n i et o b a c c ot h ec h l o r s u l f u r o n - r e s i s t a n c ea n d s a l t t o l e r a n c e i n c r e a s e d1 0 0 0 f o l d a n d1 o n a c ic o n c e n t r a t i o n r e s p e c t i v e l y s o u t h e r n a s s a y 3 = = ：= 粤奎查差堡圭差堡鎏毫 i n d i c a t e dt h a ta t n h x l g e n e s h a db e e n i n t e g r a t e di n t ot o b a c c og e n o m e h e r b i c i d er e s i s t a n c e o ft tp r o g e n yw a sa s s a y e db ys p r a y i n gl v h u a o g l o n g ( 绿黄隆) o f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n + c o n t r o lp l a n t sd i e do i l t o o m e _ 霓l v h u a n g l o n g ( 缘黄隆) ，h o w e v e 毛t h es u r v i v o rr a t i oo ft i p l a n t ss t i l la c h i e v e d7 2 7 o n5 0 0 m g ll v h u a n g l o n g ( 绿黄隆) c o n c e r n i n gt h er e s u l t ，a s g e n ee x p r e s s e d i nt 1p r o g e n y o b v i o u s l y 。t h er e s e a r c ho f e x p r e s s i o no f p r o k 2 。a s p l d t s i nl r a n s g e n i cp l a n t si su n d e rt h ew a y k e yw o r d s ：p l a n te x p r e s s i o nv e c t o r , g e n er e c o n s t r u c t i o n ，a t n h x l ，b e t a ，a s p l d y ， a s , g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 4 堂塞查耋夔圭茎堡笪圣 编略词表 6 - b a 6 - b e n z y l a d e n i n e6 一苄基腺嘌呤 a c c 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 一c a r b o x y l i ca c i d 氨基环丙烷羧酸 a l s a c e t o l a c t a t es y n t h a s e 乙酰乳酸合成酶 a m pa m p i c i l l i n 氨苄青霉素 a s r n a a n t i s e n s e r n a 反义r n a b a d h b e t a i n e a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e 甜菜碱醛脱氢酶 c a m v c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s 花椰菜花叶病毒 c d h c h o l i n ed e h y d r o g e n a s e 胆碱脱氢酶 c i a p c a l f i n t e s t i n a la l k a l i n ep h o s p h a t a s e 小牛肠碱性磷酸酶 c m o c h o l i n em o n o o x y g e n a s e 胆碱单加氧酶 c o d c h o l i n eo x i d a s e 胆碱氧化酶 c t a b c e t y l t d m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e 十六烷基三甲基溴化铵 d h f r d i h y d r o f o l a t er e d u c t a s e 二氢叶酸还原酶 d i g d i g o x i g e n i n 地高辛 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 f a o f e d e r a la n d a g r i c u l t u r eo r g a n i z a t i o n 联合国粮农组织 g u s g l u c u r o n i d a s e 葡萄糖苷酸酶 h p t h y g r o m y e i np h o s p h o t r a n s f e r a s e 潮霉素磷酸转移酶 i a a i n d o l e a c e t i ca c i d 吲哚乙酸 i p t g i s o p r o p y l1 3 一d - t h i o g a l a e t o p y r a n o s i d e 异丙基硫代t 3 一d 一半乳糖苷 k a n k a n a m y c i n 卡那霉素 l ap c r l o n g a n da e c u r t a t ep c r m e s 2 - f n m o r p h l i n e ) - e t h a n e s u l f o n i c a c i d 2 - f n 一吗啉) 乙基磺酸 n p ti i n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s ei i 新霉素磷酸转移酶h p a t p h o s p h i n o t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s e 膦化麦黄醺乙酰转移酶 p c p h o s p h a t i d y l c h o l i n e 磷脂酰胆碱 p c r p o l y m e r a s ec h a i n 瑚州佃聚合酶链式反应 p e p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e 磷脂酰乙醇胺 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二醇 p g p h o s p h a t i d y lg l y c e r o l 磷脂酰甘油 p l d p h o s p h o l i p a s ed 磷脂酶d p p t p h o s p h i n o t h r i c i n 草丁膦 t r i s t r i s - h y d r o x y m e t h y l a l n i n om e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 w h o w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n 世界卫生组织 x g a l 5 - h m m o - 4 - - c h l o m 一3 i n d o l y l 1 3 - d g a l a c t o s i d e 5 - 溴一隼氯一3 一吲哚一1 3 一d 一 半乳糖苷 ， 璺奎查墓堑圭震堡墼蒸 萋懿言 1 1 羹组d n a 技术及植物基因上程的发展 1 9 7 2 年，b e r g 等首次用限制性肉切酶e c o r i ，实现病毒s v 4 0 的d n a 和x 噬菌 体d n a 的重缎。t 9 7 3 年，c o h e n 等邋过d n a 体外重组和遗传转化，嶷现了细菠闯性 状转移，这一年也标志着基因工程的诞生。 麓缝d n a 技术从阚世到到今天邑毒3 0 多年懿历史，不仅饺整令= 墼会秘学的磅究 发生了前所未有的深刻变化，而且给工农业生产和国民经济发展带来了巨大的社会效 盏。我国是一个农翌大国，农渣是国鼹经济懿藿荟窭。在我莺这样人1 5 1 众多、入臻可耩 地面积较少的国家里，如何培育出高产、优质、抗逆的农作物品种，是农业科研中最 关穗豹阀题，基因工程技术鹣广泛瘦弱键迸了这个领壤酌迅猿发展。 檬物基因工程的内容主要包括以下几方馘：目的基因的获得：基因分离与克隆， 即从宽隆数戳庞大的簇因组文库或c d n a 文群中分离出含有硝的基困的克隆，进而获 得爨的基因。植物遗传转化：剥蹙d n a 爨缀技术拘建含鸯基的基魄的载钵，通过 农杆黼介导、基因枪轰击等方法将目的基因导入植物受体细胞，并整合到受体染色体 上，声生豢豢终潺基瓣基医懿撞携缍脆或转蘩嚣撞拣，遘瑟磷究肇熬罄强弱轰这及葵 调节的分子机理。转基因橡株的后代分析：研究转旗因后代植株中外源基因的遗传 稳定经、基鬟流襄现象鞋及蒸因表达调控戆瓿理、培寅转基潮终耱凝磊穆等。 随着转基因植株的获得和利用，应用重缎d n a 技术培育具有改良性状的作物新 品种的工作穗初觅成效，不仅培育出了重要农艺性欹得到改懿的转基阂植株，还培育 出了其有生物反应器功能的转基因植椿。从1 9 8 7 年到1 9 9 9 年1 月底美豳共批准了4 7 7 9 项基阑工程农作物进入大田试验。在这些转基因植物试验中，涉及较多的作物商烟草、 滔菜、玉米、番燕、大豆、墨铃薯秘攘芯；缮剥改良麴嚣标靛状多数为除草剡抗性、 抗虫性、品质改良和抗病毒特性等。1 9 9 5 年以来，转旗因农作物在全球范围内迅速推 广，耱翟覆竣逐年上野。1 9 9 5 年垒球秘棱瑟获缓为1 2 0 万公竣，1 9 9 9 每秘援瓣积这蘩 3 9 9 0 万公顷，2 0 0 0 2 0 0 3 年的播种面积年增长率在2 3 以上。转基因作物中以抗除草 裁终貔酌瑟积最大，其次为魏盎、双抗( 抗虫稻抗豫孳齐j ) 弱赫质改懿的转基因作耱。 1 2 植物耐盐基因工程 在全世界范围内，存在麓严重的土壤盐碱化现象，大约2 0 的耕地和一半左右的 灌溉函被盐渡诬赝影嚷。我灏约有一亿多妻簸碱地，曩鸯逐镲扩大的趋势。壤盐碱 6 当奎奎堂堡圭耋堡堡茎 化严重阻碍了农作物的生长，降低了农作物的产量，是制约农业生产发展和影响生态 环境的重要因素之一。世界农作物种类约有2 0 0 余种，占有较大经济地位的作物约有 2 0 余种，这些作物大都不抗盐。因此，利用植物基因工程培育耐盐农作物品种具十分 重要的意义，这是提高农作物产量、改善生态环境、开发后备土地资源的必由之路。 自然界中植物对盐的适应有明显的差异，既有盐敏感的非盐生植物，也有耐盐的 盐生植物。1 9 8 0 年g r e e n w a y 等提出了一个较科学的盐生植物的定义，即可在土壤溶 液单价盐含量在7 0 m m 以上环境中生长并能完成其生活史的一类植物。而绝大多数植 物在土壤盐分达到5 0 m m 时正常的生长发育便会受到严重的干扰，当盐分达8 5 m m 时 就会导致植株死亡。 盐生植物通常采取两种方式去适应盐分胁迫避盐和耐盐。1 ) 避盐：盐生植 物的避盐方式主要有三种：稀盐、泌盐和拒盐。稀盐的盐生植物在盐渍生境中生长时， 不断从外界吸收大量盐离子，同时其叶、茎不断肉质化，通过大量水分的储存，使吸 收和运输到植物体内的盐离子被稀释到不会产生伤害的浓度。泌盐盐生植物的叶片或 茎部的表皮细胞可以分化成盐腺( s a l tg l a n d ) ，其分泌细胞逆浓度梯度积累盐分并不断 将细胞内盐分分泌到胞外( 体外) 。拒盐盐生植物采取的策略是不让外界盐分进入植 物体，或进入植物体后贮存在根部而不向地上部分运输或只运输一部分，从而降低整 体或地上部分的盐浓度，免遭离子伤害，同时大量合成有机可溶性渗透剂以吸收和贮 存一定量的无机离子，通过降低植物组织水势来避免渗透胁迫。2 ) 耐盐：主要是指 植物对盐分胁迫的忍耐特性，其中包括对渗透胁迫的忍耐和对离子胁迫的忍耐。植物 的耐盐机制十分复杂，去除毒害和离子均衡占有重要位置。高盐浓度对植物的伤害涉 及到多个层面：细胞膜的完整性、酶活性和光合作用元件等受到破坏，一些养分缺乏， 特别是各种活性氧的产生导致细胞结构受损。植物通过产生各种胁迫蛋白和可溶性渗 透物质，来清除活性氧或阻止活性氧对细胞结构的毒害。同时大量盐离子和一些可溶 性有机物质的吸收和积累，可阻降低细胞水势，使细胞水势低于外界环境中的水势， 避免细胞脱水，并不断地从外界吸收水分，以维持其正常的生长发育。离子均衡包括 离子细胞吸收，区隔化作用，外排和长距离转运等，离子区域化可有效降低胞质中有 害离子的浓度，使细胞内正常代谢能够进行。 植物的耐盐基因工程应根据植物的耐盐机制，采用相应的策略来提高转基因植物 的耐盐性。 = = = = = = = = = = ； 坦奎奎鲞堑圭麓婆婆塞 1 2 。1 渗透憋鼷的饯谢工程 撼物受到渗透胁迫，通常在细胞内积累渗透保护物质( o s m o p r o t e c t a n t ) 降低细胞 憨渗逡势，赉予这些物痍不予藏细稳癌正常懿生纯爰疲，嚣魏将它们统称鸯秘容往溶 质( c o m p a t i b l es o l u t e ) ”l 。渗透保护物质大致可分为三类，即氨基酸及其衍生物( 甘氨 酸甜菜碱、脯氮酸、曾氨酸、1 3 一丙氨酸、y 氮基丁酸、苏氨酸等) 、糖类教菸衍生 物( 如山梨糖醇、甘油、甘嚣糖醇、赤藓糖管、异赤藓糖苷等) 和叔硫酰化合物( 如 8 一二甲基硫代丙酸) 掰。这些小分子渗透保护物质在耐盐中怒到重要的作用，知多元 醇类化合物的积累可以清除滋性氧的伤害f 引，挂氨酸黼菜碱可以使蛋白质处于稳定状 态，并可有效保护细胞膜系统。鉴定与分离渗透保护物质合成的相关基因并对其进行 逮镄攥 睾，遂过遗传转位来撵寒毒壹黪辩盐性。这些甥矮在撞甥体痰黪会成帮辍累还可 提高植株对其他非生物胁迫的耐受能力。 曹露醇( m a n m i t 0 1 ) 藩予多元醇，亲承浚强，貔有效遗缀挎纲稳鑫每彩莲，是一耱 重要的渗透保护物质，与植物的耐早耐盐性有关。大肠杆菌中甘露醇代谢的关键酶为 甘露醇一1 一磷酸脱氢酶( m t l d ) ，由m t l d 基函( 甘嚣醇一i 一磷酸驻氢簿基因) 编码嘲。 t a r c z y n s k i 等【5 】 艮道转m t l d 撼因烟草耐盐性提高；t h o m a s 等 6 1 将m t l d 导入拟南芥， 转基因植株的种子因积累甘露醇在高盐下能萌发，而对照植株的种子则不能萌发。但 是，表达m t l d 豹转蘩因植拣耐盐性不2 持久，且与发寅除段相关【7 】。 脯氨酸( p r o l i n e ) 是植物中主要的渗透调节物质之一，它不仅是生物大分子的保 护裁或羟基豹清除裁，还是棱凌麸耱涟条终强复正豢过程孛逡速毒效的氮源、碳潺秘 还原剂。许多物种，包括细菌、真菌和植物等，在渗透胁迫条件下通过积累脯氨酸来 逶 亍渗透灞节弼。蜀翁已觚绥菡、酵母、承稻、黑麦、大豆、损南芬、蓄蓿等孛壳隧 出多个髓氨黻合成酶或与之相关的基因。一吡咯啉5 + 羧酸合成酶基因( p 5 c s 7 ，d y r r o l i n e 一5 c a r b o x y t a t e s y n t h a s e ) 是从豌豆中分离得到豹，萁编码蛋白催化谷氯酸转变 为a 。二氢哦咯一5 一羧羧，是麟氮酸合成的关键酶编码慕因。k a v ik i s h o r 等归l 将p 5 c s 基 因导入烟草，转基因槭株脯氨酸含量比对照尚1 0 1 8 倍，并证明是该旗因表达的结果。 燕等蓬黪一般赘不裁合成海藻糖( t r e h a l o s e ) ，它侵存农予一些避旱弱猕秘中。 细菌和酵母农盐胁迫下发现斑物体中积累大嫩的海藻糖，对生物体起着抗逆保护作 霜。秘蓊已获缓菌、襄藿、瓣受干警静塞等掇物中竞隆窭了海藻糖含藏酶羹鬻。与海 藻糖合成有关的重要藻因有：乃嗒l ：酵母6 一磷酸海藻糖合成酶基因；d 脂a ：细菌 6 一磷酸海藻糖台酶基因；o t s b ：缁蔼6 - 磷羧海藻稽磷酸纯酶基嚣。将t p s i 辱入滔 一： ：些垄奎耋堡圭兰堡婆塞 草，转基因植株表现出多种性状的改变，植株体内有海藻糖积累，同时耐旱性和保水 性也得到了提高 t o j 。 甜菜碱是目前人们研究较多的一种渗透保护物质，植物在诸如高盐、干旱、低温 等逆境胁迫下都积累甜菜碱，它不仅作为无毒害的渗透调节剂维持细胞渗透压，而且 还能稳定酶和细胞膜结构，清除自由基等【l i t 。1 。甜菜碱还有保护光合系统h 复合物的 作用盼1 。另外，它还参与一般的代谢，如甜菜碱的甲基掺入植物生物碱的合成【15 1 ， 掺入哺乳动物和微生物的蛋氨酸 ，以及微生物的维生素b 1 2 17 1 。甜菜碱及其前体胆 碱还可作为一些微生物的碳、氮来源【1 8 】。 在盐分胁迫条件下许多藜科和禾本科植物细胞中甜菜碱的积累水平与植物抗胁 迫能力成正比，而番茄、马铃薯、水稻、烟草等重要的经济作物不具备此能力呻1 ，因 此以增加甘氨酸甜菜碱合成为目标的代谢工程受到重视。 己知自然界存在两条催化甜菜碱合成的途径，涉及的酶主要有4 种，即胆碱单加 氧酶( c h o l i n em o n o o x y g e n a s ec m o ) 、胆碱脱氢酶( c h o l i n ed e h y d r o g e n a s ec d h ) 、甜菜 碱醛脱氢酶( b e t a i n ea l d e h y d ed e h y d r o g e n a s eb a d h ) 和胆碱氧化酶( c h o l i n eo x i d a s e c o d ) 分别催化以下反应： 叩竺竺甜菜碱醛竺甜犁 甲一甜菜碱醛斗甜铲 i! ! ! l 在高等植物中，甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成，分别由c m o 和b a d h 催化 阻2 l 】；在哺乳动物和一些微生物中，则由c d h 催化胆碱形成甜菜碱醛，再由b a d h 催化合成甜菜碱2 习；还有一些微生物如球形节杆菌叫r t h r o b a c t e r g l o b i f o r m i s ) 和滋养节 杆菌( 4 ，t h r o b c t e r p a s c e n s ) ，胆碱可不经过甜菜碱醛而在胆碱氧化酶c o d 的催化下 直接生成甜菜碱1 2 3 ，2 4 1 ，到目前为止c o d 只在微生物中发现。 大肠杆菌的c d h 由b e t a 基因编码，催化胆碱形成甜菜碱醛，也能催化甜菜碱醛 脱氢产生甜菜碱，只是催化后一步的效率较低0 2 2 2 5 1 , 即c d h 兼具胆碱单氧化物酶和 甜菜碱醛脱氢酶的功能，此特性使转移单一酶基因的基因工程即可赋予植物积累甘氨 酸甜菜碱的能力。l i l i u s 等( 1 9 9 6 ) 将b e t a 基因转入烟草( n i c o t i a n a t a b a c c u m ) ，转 基因植物的耐盐性与对照植株相比有明显的提高，但他们没有报道甜菜碱的积累水 平。在_ h 氨酸甜菜碱过量表达的转基因拟南芥植株中，一个改造的编码胆碱氧化酶的 细菌基因被导入叶绿体中，使得甘氨酸甜菜碱在叶绿体中积累，最终转基因植株耐盐 t = = = = = = = 。= = = = = = 辇釜奎：奎；垄= 鍪羹耋蕉羹壅 性和冷脐迫酌耐受性均高于好生型稽株按，2 6 j 。h a y a s h i 等发现，尽管转基因烟草檀株 能提高耐盐性到3 0 0 r m m n a c i 的水平，但甜菜碱的含量较低，仅为4 0 8 0 r i m o i gf f w ) ， 还不足以产生渗透涧节，因此他们认为转基因植株揽性的增强很可能是出于甜菜碱的 渗透保护作用 2 7 】。 l 。2 ，2 裹子乎摄的基闲工程 一些到盐毽物已逐步发矮了特定的复杂娓媳割馊植物适应盐胁遗，其中一个援；划 裁楚离孑平衡。离予平衡桷耋建祆赣予可完成离予流动静跨骥蛋囱、搭。a t p a s e 、 p p i a s e 、c f + a t p a s e 、次缀转运蛋自和各种离子逶邋蛋白5 2 8 , 2 9 1 。商盐环境打破了离子 1 f 衡状态，由n a c ! 引起的虢胁迫不足破坏了n a 十、c i 。韵平衡状态，雨且k + 和c a 2 + 的 细胞内分却电被破坏弘“。外部过量的n a 十减少了植物对k 十的吸收，1 从丽k 营养疑阻。 细胞内n a 。积累可阻褥许多酶类的正常作用，保持细胞质邪缁胞器中较低的n a 浓 度是非常重疆的。 细胞质膜和渡溅膜上h + 泵( p 趔h + - a t p a s e 、v 型i f + - a t p a s e 和p p i a s e ) 产生的 囊子电化学揆度提擞物矮转运黪羹卧3 2 1 ，包括站等蘩养物质被动趣胞爨内运竣和 n a * 泵入滚泡内或舞缀艟羚转运。n 矿透过贮蕊a 十共转运遽遂进入缨腿艨，缨熙 i5 p a s e 鞠n a 蕊+ 反淘转运蝥自被澈活，二者协调佧蠲使n 矿辨摊或泵入滚逡，最 终形成细胞内与缅飘外、胞质与液泡闯静n f 平衡。 质膜外精n a + 和液泡n a * 区隔化是维持离予均衡的关键过程。这是一个问接的主 动运输过程，主要由n a + h + 反向转运蛋白来完成。n a + ，h + 反向转运蛋白对植物而于盐有 重要作用，它利用质膜h + a t p a s e 和液泡膜i 4 - a t p a s e 及p p i a s e 产生的驱动力把n a + 搀出缨照或在液泡中区隔化以演除n a + 的毒害，从甜提商植物耐盐雠陬3 4 j o 离子区隔 纯不但可以勰除缨l 魁屡凌n a - i 鲍毒寮，蠢旦可为缎瓤膨胀和扩张提供廉价的渗透剂。 滚澎中盐分熬积累产生黟甄瘩势有助子承黝吸牧，崧等植物戈其如此。 高簿植物捧n a + 梳铺主要密质膜n a + 是h 。反商转运蛋臼完成，曩黢珏十* a t p a s e 是水 解a t p 的能量祀h + 从销胞质中泵嵩缅胞，产生跨膜酌掣电纯学势睇度，提供篷爨5 ， 驱动质膜上的n a + h5 反向转运蜇自，使h 顺其电纯学势进入缅胞，同时n a 逆萁电仡 学势排出细胞。最初，质膜上的n a + h + 反向转运蛋白基因是从酵母中克隆得到韵。在 植物q s h i 等从拟南芥中克隆劐s o s i 基因( s a l to v e r l y s e n s i t i v e1 ) 3 6 1 , 它编码的 蛋囱与鳃毽积真蘸的质膜n 矿h + 反向转运蛋白具有非常高的同源性。至今已经发现的 s o s 基爨家族包括s o s l 、s o s 2 、s o s 3 、s o s 4 捌s o s 5 耐盐基因。其中对s o s 、s o s 2 1 0 鍪鏊螫鳖鹜譬叁篓羹塞 和s o s 3 的作用机理的研究比较溃楚e s o s t 基因编码魇膜上类似的n 8 + 珏 + 反懿转运蛋 白，s o s 2 基闽编码丝氮酸，苏氮酸蛋囱激酶f 3 7 t 3 鄱，s o s 3 编码一个带裔三个e f 臂的钙 结合爨自3 9 ，螂t 当撞甥受到胁追终恩黠，缨臆趣款c a 2 + 浓度壤鸯瑟歇嚣激活影姆。s o s 3 与s o s 2 相互作用，激活其丝氨酸苏氨酸蛋囱激酶活性，然后作用予s o s l ，后者将 n a + 箨窭缨庭羚瑟懿。 在盐渍条件下，大量n a + 流入细胞，除了把n a + 通过质膜上的逆向转运蛰白排出 缨臆外班井，大多数穗物还采爝把n a + 储存入液淹静策路。在植物缓藏的蓠液泡和液 泡膜上驱动n a + 进入液泡的主簧转运爨自是n a + h + 反向转运黉自。自第次在甜菜贮 藏组织的液泡膜囊泡稳测到液泡n a + i t + 反向转运蛋自的活住 4 l 】后，已在许多横物中发 现滚泡膜具农n a + 孵交换援性， 壹跬车前( p l a n t a g om a r i t i m a ) 1 4 2 1 ，冰叶日中花 ( m e s s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i m u m ) ，拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) f 4 3 1 ，滨藜( a r t i p l e x g m e l i n i ) 【4 4 l 等。薅嚣，零器、球睁墨皆芯、碱蓬等嘉簿德物豹滚遗骥n 办矿菠每转运 蛋白基因相继得到了巍隆。来自拟南芥的a t n h x l 与啤酒酵母n i - i x l 非常相似。a p s e l 4 3 证锅a t n h x l 编鹞一个滚迩貘n 矿黯茇囱转运蛋自，：蓬塞表透a t n h x i 愆檀罄i 渡瀣骥 的n a + h + 交换率比野生型植椿要高得多。转纂医植株照高的n a + 】旷反向转运餐白活性 和a t n h i 蛋商量的升高是一致的，在2 0 0 r a m 的n a c l 胁遥下，转鍪嚣植袜舱生长采 受到影响。利用基匿工程的警段，b l u m w a l d 等在番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 和 油菜( b r a s s i c an a p u s ) 中过懿表达a t n h x l ，得到了批真溅意义上的耐盐作物，用 2 0 0 r a mn a c l 浇灌转蒺透植栋，植株仍可正常生长帮开花结实【4 ”。 1 3 基于反义技术的植物抗逆基因工程 l 。3 1 殛义r n a 及箕在整耪蒸愆工麓串静应掰 阃某种m r n a 反向互补的r n a 分子称为反义r n a ( m r n a ) ，像是由双链d n a 中的无义链转录产生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存程的与之趸脊m r n a 静转 译港性。反义r n a 袋初发现于细裁中，它程 是一些较短的、散布的转录产物，本身 缺乏编码能力，但可以通过碱基配对的方式尚靶r n a 的特定互静毯域结合，从而黻 热基爨豹正褰表达，霆姥夏义r n a 燕裹度黪巽蛙的基因表达掷制禹子 反义r n a 可以从d n a 复制水平、转录水平和翻译水平上对基因袭达起调控作用- 它与凝序列之滴静巍凄特舅径结会，镬霉剥霜鼗鼓寒进行蒸因调控磅窕戆够耪确送 行。反义r n a 技术不仅可以应用予植物基因功能及植物代谢途径及调控研究，而且 渣奎查蓬墼薹鏊垒垄塞 还可以应用子植物基因工程中一虽然殷义r n a 豹 乍蹋机理鸯德进一疹阐释，瞧在攘 物遗传改良中反义r n a 技术融被广泛的应用。 程对1 3 - c o n g l y c i n i n 一大受琢蛋是) 基盈戆磷变中，f u j i w a r a 等采n r 曼y ：r n a 技 术，将此基因的启动予与反向的g u s 基因相连接，用于转化烟草细胞，结果发现，在 转证 黉撩中g u s 基嚣鹃表这笈生了秘子特算瞧簿鞠，麸露证实了1 3 - c o n g l y c i n i n 基因静 启动子为种子特异性启动子删。在果实成熟过程