（细胞生物学专业论文）水溶性cdte量子点的制备、应用及其生物安全性的初步研究.pdf

厦门大学学位论文原创i 炉明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ：衣、【午 纠年) 月哆e l 厦门大学学位论文著佑权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权 保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权 将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 保密( ) ，在年解密后适用本授权书。 ， 2 不保密( v ) ( 请在以上相应括号内打“一) 日期：7 年 日期：唧年 7月) 弓日 7 月弓日 眸珐 m 珏一a 形 名名签签者师阼导 水溶性c d t e 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 摘要 水溶性量子点是一种光学性质良好的半导体纳米晶体，在生命科学研究 领域有着广泛的用途。本文选择碲化镉( c d r ) 量子点为研究对象，改进 其水相合成方法，对其分子光谱性质进行了考察。在应用方面，将其用于光 催化处理溴化乙锭水溶液。通过a m 鼹实验和体外细胞培养，对其生物学效 应进行了初步的考察。全文共分为四章。 ( 1 )第一章是全文的绪论，分为两个部分。前半部分对近年来量子 点的研究进展做了概括，介绍了量子点的基本特性，量子点的合成方法，以 及量子点在分子、细胞和组织水平的应用最后，对量子点的研究前景做了 展望。后半部分主要围绕纳米毒理学的研究进展，对纳米材料的生物安全性 作了概述。 ( 2 )第二章是水相合成c d t e 量子点的研究。在参照文献的基础上， 对制备量子点时前驱体的合成方法，前驱体组分的比例，及制备后粗产品的 光学修饰，都进行了改进，最终得到具有较好光谱性质，易于保存，稳定的 水溶性c d n 量子点 ( 3 )第三章的工作是将c d t e 量子点用于光催化剂，处理溴化乙锭 水溶液。并初步考察了照射时间，催化剂的用量以及反应p h 对处理效果的影 响。实验表明，以紫外光作为光源，对水相和固相中溴化乙锭的处理，与经 典光催化剂二氧化钛相对比，取得了较满意的结果。 ( 4 )第四章利用经典的a m e s 致突变实验和m t t 比色法，来初步 探讨自制的水溶性c d t e 量子点的生物效应。实验表明，一定浓度范围内 的量子点水溶液，对a m e s 菌株无致突变作用，对体外培养细胞的生长， 无明显影响。 关键词量子点；光催化；a m e s 实验 水溶性c d t e 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 a b s t r a c t s e m i c o n d u c t o rq u a n t u md o t s ( q d s ) a r el u m i n e s c e n tn a n o p a r t i c l e st h a ta r e u n d e ri n t e n s i v ed e v e l o p m e n tf o ru s ea san e wc a l s so ff l u o r e s c e n c ep r o b e sf o r b i o m e d i c a la p p l i c a t i o n s i nt h i sa r t i c l e ，w ep r e p a r e dt h ec d t eq d si na q u e o u s s o l u t i o n u s i n gt h i o g l y c o l i c a c i d a s s t a b i l i z i n ga g e n t a f t e ra p p r o p r i a t e i l l u m i n a t i o nb yt h es u n s h i n ea n ds t o r a g e ，w eg o tt h em a t u r eq d sw h o s e p h o t o l u m i n e s c e n c ec h a r a c t e r i s t i c ( p l ) a n ds t a b i l i t yw e r ei m p r o v e do b v i o u s l y e t h i d i u mb r o m i d e 衄) ，ai n t e r c a l a t i n gf l u o r e s c e n c e p r o b e f o rt h e r e c o g n i t i o no fn u c l e i ca c i d s ，h a sb e e nw i d e l ya p p l i e di nb i o - m e d i c a lr e s e a r c h , i s a l s ok n o w n 嬲af a m o u sc a r c i n o g e n w et r i e dt oi n v e s t i g a t et h ed e g r a d a t i o no f e bu s i n gn a n oc d t eq u a n t u md o t ss y n t h e s i z e di na q u e o u sp h a s ea sa p h o t o - c a t a l y z e r f a c t o r st h a to o n c c l nw i t hap h o t o c a t a l y s i sr e a c t i o ni n c l u d i n gp h a n di r r a d i a t i o nt i m ew e 他a l s oi n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yw a ss a t i s f i e dw h e nt h ep h o t o c a t a l y z e d r e a c t i o nw a s c a r r i e do u tu n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s t h i sm e t h o da l s oh a se m p l o y e di nt h e p r o c e s so fe bp r e s e n t e di nd n ae l e c t r o p h o r e s i sg e lw i t hs a t i s f y i n g r e s u l t s t h e r ei ss t i l ll a c ko fs u f f i c i e n ta n a l y s i so ft h en a n o t o x i c i t yo fq d s t h i sl e a d t ot h ew o r ki nt h ef o u r t hc h a p t e rt h a tw ep e r f o r m e da m e st e s ta n dm t ta s s a yt o d e t e r m i n et h eb i o a c t i v i t i e so fc d t eq d s t h er e s u l t ss h o w e dl e s sm u t a g e n i c i t y o fc d t eq d sc o m p a r e dw i t ht h a to fc d c l 2 ，w h e t h e rw i t hs 9m e t a b o l i co rn o t i t a l s os h o w e dt h a tt h eq d sw c r eb i o c o m p a t i b l ew i t hh e l ac e l l si na p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o ni nv i t r o c e l lv i a b i l i t yo n l yd e c r e a s e dw i t hah i i g hc o n c e n t r a t i o no f t h en a n o p a r t i c l e s i tm a yb es u g g e s t e dt h a tc d t eq d sm o d i f i e dw i t hl i g h tw e r e s a f ef o rb i o l o g i c a la n dm e d i c i n a la p p l i c a t i o n s k e y w o r d sq u a n t u md o t s ；c d t e ；p h o t o - c a t a l y s i s ；a m e st e s t 2 水溶性c d t e 量子点的制各、应用及生物安全性的初步研究 第一章绪论 1 1 量子点的研究进展 1 1 1 量子点概述 半导体纳米晶又称量子点( q u a n t u md o t s , q d s ) ，是一种由i i 一族或 一v 族元素组成纳米颗粒，目前研究较多的是c d x ( x _ s 、s e 、t c ) 型， 粒径一般在2 1 0 n m 范围内，与绿色荧光蛋白大小相当( 如图1 1 所示) 。 由于它的物理尺寸小于激子的波尔半径，导致了一种量子限制效应，使量子 点具有独特的光学和电学性质【n 。光学特性主要体现在以下几个方面： ( 1 ) 与传统荧光染料相比，量子点的激发光谱宽且呈连续分布，荧光发射 光谱的半宽峰高( f w h m ) 窄，典型的为3 0n m ，发射峰尖锐对称且无拖尾。 同时，量子点激发和发射光谱之间的斯托克位移较大。如图1 2 所示，这样 的纳米晶用于荧光标记物时，对激发光选择的灵活性更大，可以尽量避开对 生物体本身有激发作用的波长，降低荧光信号检测时的背景噪音。 ( 2 ) 量子点具有量子限制( q u a n t u mc o n f i n e m e n t ) 效应，通过控制粒径的 大小和材料组分，可对其荧光发射波长进行连续调谐，光谱范围覆盖了从近 紫外光( 4 0 0r i m ) 到近红外光( 2 0 0 0r i m ) ( 涵盖了可见光) 圆。最重要的是， 不同颜色的量子点，能够被单一波长的光激发，而使用传统荧光染料，很难 达到单波激发多色发射的效果。这有利于实现多元高通量的实时检测。 ( 3 ) 量子点有很好的耐光漂白特性，可经受反复长时的光激发，如图1 3 所示，4 种量子点经过4 0 0 0 秒的脉冲激发，荧光没有减弱，而传统荧光染 料罗丹明的荧光却迅速下降。 ( 4 ) 普通有机染料的寿命仅为几个纳秒，而量子点的荧光寿命一般高达 2 0 - 4 0 纳秒。如果采用脉冲激光和时间f - j i 燹q 控技术，就能有效地减少图像信 号的背景噪音，大幅度提高荧光图像的质量。 这些都展示了量子点广泛应用前景，特别是作为多元实时检测的荧光标 记物，优势明显。 水溶性c d t e 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 轴oooo o 图1 1 量子点与g f p 和d s r e d 粒径大小的比较1 f i g1 1t h eq d sr a d i u sc o m p a r e dw i t ht h a to fg f pd s r e d 罄 a b 图1 2 量子点与传统荧光染料荧光特性的比较1 a ：传统荧光染料r h o d a m i n er e d 和d s r e d 2 的激发和发射光谱：b ：不同尺寸量子点的激发和发射光谱 f i g1 2t h ec o m p a r i s o no f q d sa n dt r a d i t i o n a lf l u o r e s c e n td y e s a ：t h ee x c i t a t e ds p e c t r u ma n de m i s s i o ns p e c t r u mo f t r a d i t i o n a lf l u o r e s c e n ts t a i n , r h o d a m i n er e da n dd s r e d 2 ； b ：t h ee x c i t a t e ds p e c t r u ma n de m i s s i o ns p e c t r u mo fq d si nd i f f e r e n ts i z e s t i n 砣i l 图i 3 量子点的抗光漂白性质” f i g1 3t h eq d sw i t hq u a l i t yo f a n t i p h o t o b l e a c h i n g 1 1 2 量子点的合成 制备纳米材料的方法很多，总体上可分为物理方法和化学方法两大类。 物理方法包括蒸气冷凝法、气相沉积、溅射沉积、低温等离子法和机械粉碎 4 水溶性c d t e 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 等，此类方法制得的纳米离子粒径易控，但因所需设备昂贵，限制了它的广 泛使用。化学方法主要有溶胶凝胶法、微乳法、l b 膜法、泡囊法、化学沉 淀法、醇解法、回流法、水热法等。用于荧光标记的量子点，主要通过胶体 化学法来合成1 3 1 ，所使用的原料主要包括前驱体类和配体类，前者是组成纳 米晶的核心部分，后者用于防止纳米晶的团聚。根据制备过程中溶剂的不同， 可将合成方法分为两种：一种是在高沸点的有机溶剂中利用前驱体的热分解 来合成，简称为有机相合成；另一种是利用巯基小分子作为稳定剂在水溶液 中直接合成，简称为水相合成。 有机相合成时，将有机金属前驱体溶液注射进高温( 2 5 0 3 0 0 ) 的配体 溶液中，前驱体在高温条件下迅速热解并生成核，接着晶核缓慢生长为纳米 晶。前驱体主要是烷基金属( 如二甲基铬) 和烷基非金属( 如2 - 3 甲基硅烷 基硒) 化合物，主配体是三辛基氧化膦( t o p o ) ，溶剂兼次配体是三辛基膦 ( t o p ) 。1 9 9 3 年b a w e n d i 等人1 4 1 用( c h 3 ) 2 c d 和t o p s e 为母体，将其依次 注入剧烈搅拌的t o p o 溶液中，合成了高荧光量子产率的c d s e 量子点。此 后，不断有人对此方法进行改进，陆续报道了在z n s 等包裹下核壳型量子 点的制备方法，其荧光量子点产率已经超过5 0 t 5 】。目前，用有机相合成半 导体量子点的工艺已经比较成熟，光学性质较好( 量子产率高且荧光半峰宽 窄) ，得到的一般是立方晶体，荧光效率可以达到3 0 - 5 0 , 经表面修饰后 甚至可达8 0 。 但是，有机相合成使用的原料价格昂贵，易燃易爆，毒性很大，而且在 室温下不稳定，对环境条件的要求苛刻( 大多数的过程都要在手套箱中完 成) ，不易控制和重复实验。更关键的问题是，这种方法制备的量子点上包 裹着大量的疏水基团，如果要将其溶于水中，就要进行一系列的处理，方法 繁琐，极有可能造成量子点的团聚，甚至丧失荧光效应。 目前，水相合成的常见方法是采用巯基小分子作为稳定剂，合成水溶性 量子点，而且巯基小分子中含有羧基、氨基、羟基等功能性基团，利于量子 点再藕联上其它的分子。合成的前驱体常常是离子型，如阳离子z n 2 + 、c d e + 、 水溶性c d t e 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 h 矿、阴离子s e 2 、1 e 2 、s 二等，配体多选用多官能团巯基小分子如巯基乙 酸、巯基丙酸、巯基乙胺等，通过回流前驱体混合溶液形成纳米晶核并逐渐 生长。自1 9 9 3 年首次报道直接合成巯基甘油包裹的c d t e 量子点【6 】以来，水 相合成的方法发展迅速。 但是此法合成的量子点，粒径分布不如有机相合成的均匀，量子产率 也低，需要进一步修饰来增强光学性质，方法包括分级离心沉淀，光蚀刻， 表面修饰，高温高压处理等等。即便水相合成有这些“先天不足一，但成本 低，条件易控，水溶性好，无污染，都是它的绝对优势，成为大势所趋。 1 1 3 量子点的应用 早期的量子点研究，主要集中在光电方面，甚至认为有可能制成量子计 算机，但一直无大的建树。随着量子点基本电子结构和理化、光学性质逐渐 清楚，量子点制备技术也随之不断提高。2 0 世纪9 0 年代后，量子点逐渐被 用作荧光探针，进行生物成像。涉及的领域包括活体动物标记、离体细胞成 像、生物分析阵列、固定细胞成像和生物传感器等。偶见以其作为光敏剂进 行光动力治疗的报道。 1 1 3 1分子水平的体外检测 在生物分子相互作用的研究中，荧光共振能量转移( f r e t ) 是一种常 用而有效的方法，它可以检测到小于纳米的距离变化。f r e t 技术需要选择 合适、理想的供体、受体分子，来保证高效的能量转移率和可测量的参数。 传统荧光染料和荧光蛋白由于吸收光谱较窄，发射光谱宽并且拖尾，光淬灭 域限非常低，造成f r e t 过程的吸收和发射峰之间无法存在大的斯托克位 移。量子点( q d s ) 的发射波长可以根据需要方便地调整，来保证供受体之间 合适的光谱交错，其发射波长窄且对成不拖尾、抗光漂白性很好、这些都优 良的光学性质，使其成为比传统荧光分子更好的f r e t 供体或受体【7 】。由于 量子点的激发寿命较长，而其它荧光分子的发射时间短暂，实际应用中，量 子点一般是用作f r e t 的供体。 除了上述优点，量子点在水溶液中的稳定且保持良好的分散性，这也有 水溶性c d t c 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 利于增强f r e t 的效果。n a g a s a k i 等人璐】在水溶液中利用c h o p e g p a m a 共沉淀方法制备得到c d s 量子点，即便水相环境的盐浓度很大，制备的量 子点也保持了很好的稳定性。再将生物素粘附在量子点上，将蔷薇花红染料 分子与链霉亲和素相连作为f r e t 受体，通过生物素亲和素之间特定而牢 固的相互作用来识别链霉清和素。 m e d i n t z 等人【9 】给量子点连接上抗体片段，组装成为液相纳米尺度的传 感器，基于f r e t 对液相环境的2 ，4 ，6 - - - - 硝基甲苯( n 汀) 进行了检测。 作为生物传感器来检测分子只是量子点初步应用，在f r e t 技术的支持 下，它还可用于分子构像的研究。例如将链霉亲和素包裹的量子点作为能量 转移的供体和连接基底的支架，与c y 5 之间发生的f r e t ，证实了交叉连接 构像的改变【l o l 。w a r g n i e r 等人l l l 】利用水溶性c d s e z n s 量子点与纳米金胶 体之间发生f r e t 。在另外的研究中【1 2 1 ，将链霉亲和素连接的量子点作为能 量的供体，生物素连接的金纳米粒子作为能量的受体，构成了f r e t 体系。 当外源性地加入抗生物素时，由于抗生物素与链霉亲和素竞争地结合生物 素，减少了链霉亲和素连接量子点的荧光淬灭，从而检测抗生物素，检测限 达到1 0n m o l l ，动力学的检测范围也升到2m o f l 。 在f r e t 中，常用多聚物或蛋白等来表面修饰量子点，使量子点与生物 分子相连后，还保持稳定性和高量子产率。但随量子点的粒径也随之增大。 f r e t 的能量转移对分子之间的距离变化非常敏感，距离的增加就相应减少 了f r e t 产生的可能性。为了减小偶极一偶极中心之间的距离，可以尝试把 蛋白直接连接在量子点上，使能量转移发生在量子点和蛋白质色氨酸残基之 间【1 3 l ，或者使量子点连接到一个基因控制的髓磷脂基本蛋白上，使能量转移 发生在外层髓磷脂基本蛋白和量子点之间【1 4 1 。总之，就是使量子点和其作 用靶分子之间的距离尽可能得短。 在免疫荧光分析中，关键是通过什么样的信号来表示并放大抗原抗体反 应的发生。无论采用放射性物质标记、酶标记、化学发光或是荧光标记等， 高效的标记物永远是人们所需求的。 水溶性c d t e 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 g o l d m a n 等人【”】将核壳层结构的c d s e z n s 量子点与抗体结合，用于荧 光免疫分析。他们首先将工程重组蛋白通过静电作用结合到量子点上，然后 再与抗体相连接，使用这种探针，成功的对葡萄球菌肠毒素和2 ，4 ，6 一三硝 基甲苯进行了荧光免疫分析。后来，他们又借助亲合素一生物素系统使量子 点更容易的与抗体结合，成功检测了葡萄球菌肠毒素( s e b ) 、霍乱毒素 ( c h o l e r a t o x i n ) 等毒素，灵敏度可与有机染料标记相媲美【1 6 1 。当采用4 种不同 颜色的量子点分别标记抗蓖麻毒素、霍乱毒素、志贺菌毒素1 和葡萄球菌肠 毒素b 的抗体，在同一块免疫微孔板上实现了对这4 种物质的同时检测【i r l 。 此外，在对b 型葡萄球菌肠毒素的免疫测定中，灵敏度达到了1 0n # m l 1 朝。 量子点作为荧光标记物，另一个显著的优势是，可以较易地实现同一环 境下的多色标记，这是传统的荧光染料很难做到的。 2 0 0 1 年，聂书明等人【1 9 1 首次利用量子点对聚苯乙烯微球进行多色荧光 编码，并通过d n a 杂交实验证实了该编码技术在生物检测中的巨大潜力。 他们预测，将6 种颜色、1 0 种浓度的量子点装载到树脂微球内部，可以对 多达1 0 6 个树脂微球进行编码。如果将量子点的荧光发光强度增加到1 0 种， 那么就可以提供1 0 0 万种的编码微球，这样理论上就可对1 0 0 万种的d n a 和蛋白质进行识别。x u 等人【2 0 】利用量子点编码微球成功标记了9 4 个基因 d n a 标本中的1 0 种不同s n p s ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ) 基因类 型。目前，这种基于微载体( m i c r o c a r r i e r ) 的筛选分析技术，已经成为量子 点在生物分析中的应用热点之一。 1 1 3 2亚细胞水平( 细胞器水平) 的荧光成像 在亚细胞结构中，量子点荧光成像技术与激光共聚焦扫描显微镜结合， 可观察细胞内三维空间中蛋白质之间或与其它分子( 如激素) 的相互作用。 如m a t s u n o 等人【2 1 】利用量子点的特性和激光共聚焦扫描显微镜对生长激素 和泌乳刺激素及它们的m r n a 进行了三维成像。 表皮生长因子是由5 3 个氨基酸残基组成的小分子单链多肽，是人体内 分泌的一种重要的生长因子，在癌症和肿瘤的研究中有着重要的地位。l i d k e 水溶性c d t e 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 等圈将量子点标记到表皮生长因子上，通过激光共聚焦显微镜，观测到肿瘤 细胞通过胞吞途径特异性摄取这种表皮生长因子的全过程。 k i n e s i n - 1 是一种微管内的分子马达蛋白，它依靠a t p 水解提供的动力 来进行物质运输。欧洲分子生物学实验室( e m b l ) 的a m e 等人，将单个 量子点标记到k i n e s i n - 1 上，研究其在胞内复杂的环境下，如何与其它微管 结合蛋白相互竞争并在微管内运动的情况瞄1 。 1 1 3 3细胞水平的荧光成像 量子点用于细胞成像的两大突出有点是：( 1 ) 荧光稳定，可长时间( 几 小时至数月) 的定位示踪；( 2 ) 同一激发光下，可多色标记 w u 等 2 4 1 采用荧光免疫法，先用改良的聚丙烯酸包被7 4 - 1 0n m 的量子 点，再标记上i g g 和链霉亲合素相结合，借此与抗h e r 2 的抗体和抗核抗原 抗体相结合，使其具备同时识别细胞表面的h e r 2 、胞浆微管蛋白和核抗原 的能力，并可结合在细胞表面、细胞支架和细胞核，与有机荧光染料a l e x a 4 8 8 比较，量子点显示出较强且稳定的荧光信号。 除了细胞膜蛋白的定位外，量子点也生物分子的藕联物也可进入细胞核 进行蛋白的示踪。这方面的首次报道见于c h e l a 等人的研究【2 5 】，他们将量子 点与s v 4 0 ( 猴病毒4 0 ) 大的t 抗原核定位信号( n l s ) 结合，通过荧光成 像系统监测到复合物由细胞质到细胞核的运动过程。这一工作首次将量子点 用在细胞核中进行长时程观测生物现象，提供了一种新的无细胞毒性成像技 术来研究细胞核的交换机制及过程。 1 1 3 4组织水平的活体成像 聂书明等人在这个领域做了许多前沿的工作，他们首次实现了量子点用 于的活体组织内的荧光成像i 蚓。他们先将量子点包裹上a b ct d b l o c k 聚合物 纳米颗粒层和聚乙二醇，再与单克隆抗体偶联，形成的抗体一量子点复合物 可以特异地识别前列腺肿瘤细胞上的前列腺特异性抗原并与之结合。诱导裸 鼠生长出前列腺肿瘤，将抗体一量子点复合物量子点注射入其血液循环系 统，观察到在肿瘤细胞周围聚集有荧光信号，通过使用不同颜色的量子点， 水溶性c d t c 量子点的制各、应用及生物安全性的初步研究 可得到肿瘤细胞的多色荧光图，同时获得肿瘤大小和位置等信息。 h o s h i o n 等鲫通过细胞的内吞作用将量子点导入小鼠的淋巴瘤细胞。结 果显示量子点不会影响细胞的活动和功能，其荧光信号也很稳定。b y r o n 等 田】将一组量子点分别用4 种不同的分子修饰表面，注射入动物体内后发现， 不同表面修饰的量子点在体内的半衰期也不同。在体内4 个月后，这些用于 定位的量子点仍能发出荧光。 活体成像的重要应用之一是用于癌症和肿瘤的早期诊断。如s t r o h 等【2 9 1 将量子点、多光子成像技术和表达绿色荧光蛋白的转基因老鼠结合，研究肿 瘤血管周围的细胞和组织，可从血管周围的细胞和组织中区分出肿瘤血管。 他们还利用量子点标记成功地检测到了干细胞由骨髓补充到肿瘤脉管系统 的过程。在肿瘤转移的研究中，v o u r a 等【3 0 】通过量子点标记和多光子激发、 光谱成像，观察到了肿瘤细胞转移到肺组织中的5 个入口。 与细胞成像相比，活体成像的难题之一并不是保证其特异性识别，而是 确保发生阳性反应后，光信号能够穿透组织被检测到。为此，荧光探针的发 射波长应在7 0 0 n m - - 20 0 0 n m 之间。这个范围内的近红外光在生物组织内具 有低吸收和散射的特点，从而可以获得较大的穿透深度。使用发射近红外荧 光的量子点，可以穿透深层组织而且背景噪音较低。例如，在鼠的前肢皮下 和猪的腹股沟皮下注射近红外荧光量子点做为肿瘤细胞淋巴示踪，可以观察 到量子点被引流到前哨淋巴结。该方法是确定癌症是否扩散到身体其它部分 的第一步，若将其用于显现外科手术区域和淋巴液排泄途径及节点，可指导 外科切除术的定位【3 l 】，克服了许多现有技术的局限性。 1 1 4 量子点的前景 在生命科学发展道路上，研究手段的突破和创新，往往带来学科的进步。 有人预测，量子点将成为生命科学的常规研究手段之一。虽然现在量子点还 远不能取代传统荧光染料的地位，但它的深入研究和应用，一定能帮助更多 研究者实现自己的想法，为生命科学带来重大的新发现。 1 2 纳米材料的生物安全性纳米毒理学的研究进展 水溶性c d t c 量子点的制各、应用及生物安全性的初步研究 1 2 1纳米毒理学概述 由于纳米科技的迅速发展，越来越多的纳米材料被投入实际使用，其 应用广泛地涵盖了人类文明的各个领域，如日用品、制药、化妆品、生物医 疗产品和各种工业用品等等，并以惊人的速度发展。与传统的体相材料相比， 纳米尺度的材料有新颖独特的物理化学性质，但同时对人体的健康，也可能 构成影响。人工合成的纳米材料对环境的潜在风险，与人体相互作用的机理 和结果，目前大都是不为人知和很难评估的。这些不但吸引了研究者的目光 阮3 3 ，3 4 , 3 5 , 3 6 ，3 7 ，翊，而且公众的关注程度也日益增高，包括相关的企业和政 府部门，也逐渐将更多的注意力投向这个领域。在2 0 0 3 年1 0 月，美国政府 增拨专款6 0 0 万美元启动了纳米生物效应的研究工作。次年7 月在伦敦，英 国皇家学会和皇家工程院应英国政府的要求，对纳米技术可能造成的伦理和 社会问题，发布了研究报告 3 9 1 。2 0 0 4 年1 2 月，欧共体公布了“纳米安全性 综合研究计划 ( n a n o s a f c t yi n t e g r a t i n gp r o j e c t s ) ，旨在支持有关纳米颗粒与 生物体系相互作用机制的基础研究，其内容包括纳米材料可能对生物、环境 和健康产生影响的各个方面，如纳米颗粒对人体神经系统、心血管系统、呼 吸系统、免疫系统等的生物学效应，以及如何防护纳米颗粒。我国于2 0 0 3 年1 1 月由中科院主持召开的第2 4 3 次香山会议，讨论的主题是“纳米尺度 物质的生物效应及毒性( 安全性) 一。总之，这是一场在世界范围内不断地扩 大和深入的研究浪潮。 由此而生的纳米毒理学( n a n o t o x i c o l o g y ) ，是- - i 7 交叉型的新兴学科， 研究的内容包含或涉及了其它众多的学科领域，如材料学、毒理学、医学生 理学、药理学、病理学、生物化学、免疫生物学、细胞生物学、发育生物学、 遗传和分子生物学等等。它的涵盖面很广，发展的深度却还远远不够，整个 体系中的各个部分之间，存在着相当多的断层甚至缺陷，研究的思维模式和 实验手段，也需要大的突破和创新。正如化学家v i c k ic o l v i n 所说，在这一 领域尚处于早期阶段，并且人类受纳米材料的影响还比较有限的时候，必须 现在就对纳米材料的生物毒性给予充分的关注，而不是等到完全广泛地使用 水溶性c d t e 量子点的制各、应用及生物安全性的初步研究 纳米技术之后，才开始面对这个问题【3 2 1 。这也预示了纳米毒理学有着相当 大的拓展空间和良好的前景。 纳米毒理学不仅仅指发现并避免纳米材料的毒性，它还应当也必须去探 求纳米材料与有机体的相互作用，以及所引发的一系列生物学效应，其中也 包括那些有益的能被人们所利用的现象。因为，在无法回避使用纳米材料的 情况下，消除和减轻纳米材料的特殊危害，最终还是要依靠纳米材料自身的 特殊性质( 生理、免疫作用机制等) 来完成。纳米毒理学研究的根本目的是 为人类的健康服务，从这个角度来看，纳米毒理学既是一门基础学科，也是 一种实用技术，一切有关纳米材料和生物体相互作用的探索和发现，都可归 为它的研究范畴，或为之所用。目前，已经有专门刊登纳米毒理学研究论文 的专刊( n a n o t o x i c o l o g y ) ( 创刊于2 0 0 5 年1 月，英国) 。 纳米毒理学的研究对象主要为人工合成纳米材料，粒径均在1 0 0n l n 以 下，种类繁多，以各种方式散播到环境中，与人接触。具体包括金属纳米颗 粒、纳米氧化剂、树枝状聚合物( d e n d r i m e r s ，用作基因治疗的载体眦4 1 】) 、 量子点 4 2 , 4 3 、纳米晶簇( n a n o c l u s t e r s ) 、纳米晶体、纳米线、富勒稀( f u l l e r e n e ， 球壳状碳分子) 1 4 4 1 、富勒稀衍生物【4 5 1 、单层或多层碳纳米管 4 6 , 4 7 、功能化 碳纳米管( 多用于生物传感器1 4 8 j ) 、无机延伸聚合物纳米颗粒( p o l y m e r n a n o p a r t i c l e s ，多用于药物运输与释放【4 9 ，捌) 、纳米特氟纶( t e f l o n ) 、纳米碳 黑、纳米涂层( n a n o c o a t i n g s ) 5 1 , 5 2 】、纳米药物【5 3 】、磁性纳米颗粒 5 4 , 5 5 1 、 硅壳纳米颗粒【5 6 5 7 1 、齿科桩钉用纳米s i 0 2 s 2 g f b m 复合材料【5 8 1 等。 1 2 2纳米微粒毒理作用的特殊性 同样的材料，制成纳米尺度后，可以展现许多宏观上所没有的独特性 质，在毒理学上，也是如此。纳米微粒与生物体相互作用，所展示出新的现 象，很多是无法预料到的，以现有的知识，仍无法很好地解释。因此，对宏 观物质的毒理研究手段、作用机理的解释、生物安全性评价标准和防治方法， 特别是对环境和人体健康的影响，并不完全适用于纳米尺度的物质。 如碳纳米管是由石墨层卷成的圆筒，但也许是由于几何结构的不同， 水溶性c d t c 量子点的制各、应用及生物安全性的初步研究 导致碳纳米管的生物毒性远远大于等量的石墨粉。实验证明，根据石墨的安 全剂量来推断碳纳米管的安全剂量是不可行的1 5 9 l 。北京大学的刘元方研究 组，将一种分子量高达6 0 万的水溶性碳纳米管导入小鼠体内，结果它们可 以在小鼠的不同组织和器官之间自由穿梭，最后通过尿液排泄【6 0 。这种类 似小分子的生理行为，是不可能在6 0 万分子量的常规物质上出现。研究还 发现，老鼠吸入粒径为3 5 r i m 的碳颗粒ld 后，这些颗粒可以到达脑内处理 呼吸的部位嗅球，并且数量在7d 内持续增长【3 2 】。 中科院高能物理研究所的赵宇亮研究组组建了我国第一个纳米生物效 应试验室。他们在研究l 1 0 0 万摩尔剂量的碳纳米材料【g d c 8 2 ( o h ) x n 颗粒在小鼠体内的行为时发现，仅3 0 m i n 内它们在小鼠血管内诱发严重的血 栓，导致小鼠死亡。但当改变给药途径后，它不仅不再诱发血栓，而且无毒 性，并具有比目前临床使用的环磷酰胺、顺铂更加显著的抑制肝肿瘤生长的 效果【6 l 6 2 1 。 大量的研究表明，纳米颗粒的尺度越小，比表面积越大，显示出的生物 毒性越大。如纽约州r o c h e s t e r 大学o b e r d o r s t e r 等人的实验表明，纳米n 0 2 颗粒引起了肺组织间质化，并诱发了炎症反应。肺泡灌洗液内生理指标的变 化与纳米颗粒的比表面积有关【畦6 4 1 ，他们进一步的研究 6 5 1 发现，大鼠肺泡 巨噬细胞在清除相等质量的西0 2 纳米颗粒时，纳米颗粒的尺寸越小，越难 以清除。r e n w i c k 等人类似的研究【删也表明，啊0 2 纳米颗粒在2 9 r i m 时， 比在2 5 0 r i m 对巨噬细胞的影响更大，使得巨噬细胞吞噬能力的降低更明显。 他们推测，纳米颗粒的粒径( 比表面积) 和数目，是造成肺损伤的关键因素 之一但目前还未弄清整个过程的作用机理。也有人认为 6 7 1 ，纳米颗粒可 以诱导自由基的产生，启动体内氧化应激机制，因此产生了毒性作用。 纳米材料的生物效应不仅与其大小有关，还与其结构有关。例如d i n g 等人 6 8 1 利用基因芯片研究了洋葱状碳纳米材料( m w c n o ) 和管状结构碳纳 米材料( m w c n t ) 对人体皮肤成纤维细胞的毒性作用，发现这两种处于同 样尺寸范围的碳纳米材料，表现出的毒性却不完全一样。其中，m w c n t 水溶性c d t e 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 诱发细胞产生更多的应激反应，导致细胞坏死。进一步的研究还发现，两种 材料刺激基因表达的方式不一样，m w c n t 诱导成纤维细胞中与免疫和炎症 反应相关的基因表达，而m w c n o 主要是诱导响应外源刺激的基因表达。 对单壁碳纳米管( s w n t ) 和多层碳纳米管( m w n t ) 的研究1 6 9 也表明， 二者引发相同细胞损伤的剂量相差近1 0 倍，s w n t 的细胞毒性明显高于 m w n t 。我认为，从另外一个角度看，这也为减轻甚至消除纳米材料的毒 性提供了宝贵的思路，即通过改变结构来降低毒性。 而相对上述纳米材料，德国m u l l e rr h 等人的研究却表明固体脂质纳米 颗粒具有较低的毒性【7 0 1 。 由此可见，当在讨论纳米物质生物效应的时候，不能泛泛而言或轻易下 结论。需要严谨的指明具体的物质种类，形态，尺寸，剂量等参数，这些参 数对纳米生物效应的影响很大。这种现象也恰恰给纳米物质的生物效应与安 全性研究工作，带来了极大的难度。实际上，即使同一种物质，同一种形态， 同一个剂量，只要纳米尺寸大小改变，它们的生物效应( 尤其是生物毒性) 就需要重新测试。这也表明，研究纳米毒理学首先需要进行大量的动物实验， 来积累足够的实验数据，才有可能通过归纳和分析，揭示纳米材料生物效应 的一般规律性，从而建立相应的理论基础和预测标准。 1 2 3纳米微粒的传播方式和侵入途径 粒径小于1 0 0n m 的纳米材料，体积小于正常的哺乳动物细胞，几乎与 病毒和蛋白质相当，它们质量小，无论很容易漂浮到空气中，与人的皮肤接 触，或直接被吸入体内。或因为泄漏，处理等多种途径，被排入水，大气和 土壤，参与全球范围内的物质循环 3 9 1 。了解它们的传播方式，有助于明确 易感的生物组织和器官，有利于针对性地建立预防和保护机制。 为了满足工业和民用日益增长的需求，大量的纳米材料被合成出来，在 制造、运输和使用的过程中，无法避免地会侵染水厨7 1 ，7 2 1 。虽然有些纳米 颗粒可能会在水中通过化学反应而被处理，但如果很多不溶于水的物质仍随 着水的流动在环境中传播【7 3 l 并进入地表水被人所再次利用，从而导致治理 水溶性c d t e 量子点的制备、应用及生物安全性的初步研究 工作的规模和难度，都无法估量。 几乎所有的实验都表明，纳米微粒更易被人体所吸收，一定条件下也 可穿透血肺屏障、血脑屏障7 41 和血睾屏障【7 51 ( 对血眼屏障和胎盘屏障尚未 见报道) ，经由血液循环系统造成更大的全身性损害【3 s 1 。一般情况下，纳米 颗粒多是通过空气与人体的呼吸道接触并迅速成为致病源。 空气中的微小颗粒被吸入人体后，会沉积在肺壁表面的纤毛上，这些 微粒可通过气管内层细胞外的纤毛有规律的摆动，一部分上行至喉咙被排出 体外，另一部分下行进入肺内气体交换组织，被巨噬细胞吞噬。这些含有微 小颗粒的巨噬细胞，一部分可通过入气管道被排除体外，另一部分可通过肺 部进入淋巴管而到达淋巴结。这两种机制都是将微小颗粒清除出可能引起毒 性反应的脏器或者其他部位嗍。但是肺泡内腔与血液之间仅相隔0 5 衄鱼， 相对于支气管来说血肺屏障的防御能力很弱，纳米粒子的微小尺寸使得它很 容易随空气进入到肺泡当中。肺部拥有大约3 亿个肺泡，表面积巨大、而且 血流丰富，使得它成为纳米粒子入侵血液的门户【7 7 l 。 虽然人体的皮肤处于完整的状态下，对外界物质的侵入有很好的抵御能 力，甚至可以抗一定程度的酸碱腐蚀，但面对纳米微粒，这道经历千万年进 化而铸成的防线有时变得形同虚设。r e i n e r t 等人【7 8 】利用与人体皮肤接近的 猪皮做纳米颗粒的渗透性实验，发现纳米面0 2 颗粒很容易透过角质层进入 到表皮，甚至真皮层。以防晒霜为例7 6 1 ，有研究表明很多产品中使用的二 氧化钛纳米微粒可以进入皮肤甚至细胞，并在细胞内产生自由基。有文章报 道在日光中紫外光线的照射下，防晒化妆品中的纳米面0 2 颗粒具有较强的 光催化作用，使得其他有机成分发生处理而产生伤害皮肤的物质 7 9 , 8 0 , n 】。总 之，纳米微粒的传播是多途径的，不同的途径会产生不同的生物效应。 1 2 4纳米毒理学的研究手段 目前，国际上尚未形成统一的、针对纳米材料的生物安全性评价标准， 大多仍借鉴了传统毒理学生物科学的实验方法，并未形成自己独特的理论和 实验体系。 水溶性c d t e 量子点的制各、应用及生物安全性的初步研究 注入法是最常见的方法之一，即直接将受试物( 纳米微粒) 注入可能作 用的靶器官、组织或细胞。例如a f a q 等人瞰】用支气管注入法研究粒径小于 3 0 r i m 的n 0 2 纳米颗粒对大鼠的毒性，发现细胞启动了自我保护机制，肺 泡巨噬细胞的数量增加，诱导了抗氧化酶的生成。但这未能阻止脂质过氧化 和过氧化氢的生成，无法消除，n 0 2 纳米颗粒产生的毒性。 同样采用支气管注入法，l a i n 6 9 1 和w a r h e i t t 8 3 1 等人发现，0 1m g k g 的单 壁碳纳米管对小鼠无可诊断的毒性现象，而当剂量增大到0 5m g 埏时，小 鼠出现明显的肺部毒性，并观察到多中心肉芽肿的生成，部分小鼠死亡。但 与毒性粉尘( 如石棉和无机粉尘) 引起肺部肉芽肿的毒性机制不一样，单壁 碳纳米管并未引起肺部持续的炎症、细胞增殖和支气管肺泡灌洗液内乳酸脱 氢酶活性的持续升高。而是出现了细胞凋亡的症状，如细胞肿胀，胞浆中出 现空泡和吞噬小体，染色质浓缩等，这是纳米颗粒与普通微粒生物效应差别 的关键所在。对暴露于单壁碳纳米管和多壁碳纳米管的巨噬细胞结构变化的 研究1 6 9 1 ，也支持了上述结果。在观察2 0n n l 的西0 2 纳米颗粒刺激原代大鼠 胚胎成纤维细胞的过程中，也发现了类似的现象i 硼。 肺是纳米微粒侵入人体的主要途径之一，肺泡巨噬细胞广泛分布于肺 泡内及呼吸道上表面，具有吞噬、清除的保护功能。因此，上述有关纳米微 粒与巨噬细胞相互作用的研究十分重要。 如何跟踪检测纳米微粒在生物体内的活动是一个难题。将放射性标记 技术与注入法结合，有助于高灵敏度地跟踪检测试验动物体内的纳米颗粒陬 6 7 1 。我国学者删在羟基化的水溶性单壁纳米管外表面标记上1 2 5 i 原子( 平均 每个颗粒标记一个原子) ，通过静脉注射、腹腔注入、灌胃和皮下注射4 种 方法导入小鼠体内，计算小鼠每克湿组织所含的剂量百分比，来研究碳纳米 管在小鼠体内的分布及代谢过程。薄层透射电镜也是有效的方法，但操作复 杂费时瞰j 。使用荧光标记比较简便有效，但很难选择合适的荧光标