（细胞生物学专业论文）未培养微生物延胡索酸水合酶基因的克隆、表达及酶学性质鉴定.pdf

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2 培养条件2 0 2 2 3 菌种保藏。2 0 2 2 4 抗菌素2 0 2 3 试剂、缓冲液和溶液2 1 2 4 所用仪器( 见附录二) 2 1 2 5 质粒d n a 的制备2 2 2 5 1 碱变性法小量提取质粒d n a 2 2 2 5 2 大量制备质粒d n a 2 3 2 5 3 试剂盒提取质粒2 3 2 5 3 1 试剂盒小量及大量提取提取质粒( 见附录一) 2 3 2 6 质粒d n a 的沉淀、纯化与定量2 3 2 6 1 质粒d n a 的沉淀与贮存2 4 2 6 2 分光光度法测定d n a 浓度2 4 2 7 琼脂糖凝胶电泳2 4 2 8d n a 酶切2 5 2 8 1d n a 的限制性内切酶酶切2 5 2 8 2 分离及回收d n a 酶切样品2 5 2 8 2 1 回收d n a 片段通过低熔点琼脂糖凝胶2 5 2 8 2 2 以试剂盒回收d n a 片段( 见附录一) 2 6 2 9d n a 的连接2 6 2 9 1 质粒载体d n a 的去磷酸化2 6 2 9 2d n a 的连接2 6 2 10 质粒d n a 的转化一2 6 v i 2 1 0 1 快速制备ec o l i 感受态细胞及载体质粒d n a 的电脉冲转化2 6 2 1 0 2p c r 扩增d n a 片段2 7 2 1 l 基因的表达与s d s p a g e 检测一2 7 2 1 1 1 所用溶液2 7 2 1 1 2 蛋白质样品的制备2 8 2 1 1 3s d s p a g e 蛋白质电泳2 9 2 1 1 4 亲和层析纯化目标蛋白3 0 2 1 2 重组蛋白f u m f 基因产物酶活检测3 1 2 1 2 1 使用b r a d f o r d 法制作蛋白质标准曲线3 1 2 1 2 2l 苹果酸标准曲线的绘制3 2 2 1 2 3 延胡索酸标准曲线的绘制3 3 2 1 3 分光光度法法测定延胡索酸水合酶的酶活一3 3 第三章结果与分析3 5 3 1 延胡索酸水合酶基因f u m f 在大肠杆菌中的表达一3 5 3 2 重组质粒p g x a m 3 5 6 6 g 的提取及验证3 5 3 3 延胡索酸水合酶基因p c r 扩增3 6 3 4 重组质粒p e t - f u m f 的构建及验证3 7 3 5 延胡索酸水合酶基因f u m f 的生物信息学分析3 8 3 5 1 测序结果3 8 3 5 3 外源片段f u m f 基因的信号肽分析4 0 3 5 4 f u m f 基因产物氨基酸序列分析4 l 3 5 4 1 重组酶f u m f 基因产物的的进化关系分析4 l 3 5 4 2 多从序列比对及进化树的构建4 4 3 5 5 f u m f 基因编码的蛋白产物的氨基酸分析4 7 3 5 6 f u m f 基因编码蛋白产物的亲疏水性分析4 8 3 5 7 f u m f 基因编码的蛋白产物的跨膜结构域分析4 8 3 6f u m f 重组蛋白的生理生化鉴定。4 9 3 6 1 p e t - f u m f r o s e t t a ( d e 3 ) p l y s s 在大肠杆菌e c o l id e 3 ( b l 2 1 ) d p 的诱导表达4 9 3 6 2 粗酶液的制备4 9 3 6 3f u m f 目的蛋白纯化5 0 v i l 3 6 4f u m f 的酶学初步分析5 2 3 6 5f u m f 目的蛋白在不同的p h 值下的酶活测定及p h 耐受性分析5 2 3 6 6 目的蛋白在不同的温度下的酶活测定及温度耐受性分析。5 3 3 6 7f u m f 的p h 值稳定性研究5 4 3 6 8f u m f 的温度稳定性研究5 4 3 6 9f u m f 重组蛋白的重金属离子耐受性分析5 5 3 6 1 0f u m f 重组蛋白的酶活测定5 5 3 6 1 lf u m f 重组蛋白k m 值测定5 5 3 6 12f u m f 重组蛋白的比活力测定一5 8 3 6 1 3f u m f 重组蛋白的抑制剂5 8 四章结论与讨论5 9 4 1 结j 沧。5 9 4 2 讨论6 0 4 3 本研究创新点。6 1 第五章展望6 2 附蜀乏6 3 参考文献6 8 致谢7 5 攻读硕士学位期间所发表的论文与研究成果7 6 v i i i 组，结果发现很多序列已报道的纯培养微生物不相同，同源性最高的也只有9 4 7 。以 不同环境微生物使用标准的微生物培养技术进行测定，海水中的可培养微生物约占微生 物总量的0 0 0 1 一0 1 0 0 1 2 1 。而那些不能够通过纯培养方式得到的微生物被称为未培养 微生物。现在一般认为，占微生物总量9 9 f 3 】的微生物尚未能够在现有的培养条件下培 养。在原核生物的4 0 个门中，大约有5 0 左右【4 】尚未能培养。1 9 9 0 年以后，虽然人们 对于使用基因操作技术或称基因工程技术来探求微生物界的广度和深度的方面取得空 前巨大的进展，如1 9 8 7 年，能够通过纯培养而获得的微生物类群( p h y l a ) 有2 6 个，当今， 随着分子生物学、生物信息学的飞速发展通过研究微生物类群已激增到5 2 个类群，其 中大于半数的是是未经培养的。未培养微生物广泛存在于各种自然环境中，特别是各种 极端环境中，而且表现出极其丰富的多样性。以细菌为例，目前在细菌域( d o m a i n ) 中约 有5 2 个f - j ( p h y l u m ) ，其中1 2 个门为w o e s e 等1 9 8 7 年描述的【5 】，另外1 4 个门为1 9 8 7 年 之后发现的，并己获得各自代表微生物的纯培养，而余下的2 6 个门则因为迄今尚未得 到其各自代表微生物的纯培养，故称为“候选门”( c a n d i d a t ep h y l u m ) ，只是其在系统发育 分析中介于伯杰氏细菌系统学手册【6 】中门的可培养代表微生物。可纯培养的2 6 个门 的代表菌由于其类群数量有限，也并不能完美地代表这2 6 个门，且包含许多未培养微 生物【7 j ，如图1 1 。 广西大学硕士掌位论文束培养微生物延胡索胃l 水合酶 基因的克隆、表j 古及嗣 掌性质誓定 图1 1 细菌的进化树分析【8 1 白色分支：已认定的1 4 个可被纯培养的细菌门 黑色分支：1 2 个有可能进行纯培养的细菌门 f i g 1 - 1t h ep h y l o g e n e t i ct r e eo fb a c t e r i a l w h i t eb r a n c h ：f o u r t e e nb a c t e r i a lp h y l u mc a r lb ep u r ec u l t u r e d b l a c kb r a n c h ：t w e l v eb a c t e r i a lp h y l u mm i g h tb ec u l t u r e d 1 1 2 未培养微生物的研究进展 1 1 2 1 未培养微生物的研究方法 作为自然界分布最广的生物种群，微生物具有大量基因资源f 9 , 1 0 】。至2 1 世纪初，从 未培养微生物中克隆新的基因已成为一大研究热点，并取得了相当数量的新基因，结合 日新月异的测序技术使得人们对微生物的了解达到了一个更高的程度。已有的研究方 法可以归纳为两点： 第一种被称为鸟枪法，这种方法的主要步骤是直接提取样品如环境微生物的总基因 2 未培养铆【生物延胡索酸水合萌 基因的克隆、毒邀a j 掌性曩r 警j 定 组( 这种总基因被称为宏基因组d n a ，m e t a g e n o m i c ) ，用超声波或是核酸的内切酶来进 行部分的消化后，再与粘粒、质粒或是细菌人工染色体等载体连接，转化入合适的宿主 细胞，从而构建出相应的个宏基因组文库。 然后通过测序或是活性标记等方式，取得所需的基因的阳性克隆。此种方法不受一 些已知基因地同源性的限制。所以获得基因往往结构与已知基因同源性较低。r o n d o n 等人使用细菌人工染色体【l l j 构建了两个未培养微生物宏基因文库，筛选到4 1 株分别编码 脂肪酶、核酸酶以及编码产生溶血作用及抗菌的基因。 第二种方法被称为p c r 扩增法。这种方法的主要步骤是先将需要分离的样品宏基因 组d n a 提取出来，在以已知基因的保守序列设计引物后进行p c r 扩增，将得到的扩增产 物进过酶切连接到合适的克隆或是表达载体后，导入如大肠杆菌e c o l i 的宿主菌中，同 样通过测序或是活性检测的方式，得到目的重组子。e s c h e n f e l d t 等【1 2 】人利用此种手段， 得到了两株未报到的比同类酶酶活高2 0 倍的2 ，5 - - 酮基d 一葡萄糖酸还原酶。p c r 扩增法 相对第一种方法操作较为简单，且工作量也较小，但因为以已报道的保守序列设计引物， 因此发现新基因的可能性也较第一种小。有的学者把这两种方法结合起来，以克服两种 方法的不足。通过以一些带有可移动元件及其相应相应遗传标记的重组质粒或是转座 子。通过这些重组质粒或是转座子构建较大库容量的突变体库，再通过遗传标记或是测 序的方式加以鉴别，从而筛选出所需的目的基因。这种方法较传统的鸟枪法，降低了工 作量，又由于没有通过保守序列来设计引物来明确基因指向，因而口q p c r 法有较多可能 寻找到的新基因或新的基因家族。 1 1 2 2 将未培养微生物向纯培养微生物转变的研究 即使人们采取许多方法绕过许多障碍来对未培养微生物进行研究，虽然获得了一 定的新的基因序列发现了一些新的基因家族，但仍有大量基因资源有待开发。为了更加 广泛的开发微生物基因资源，研究者不断尝试将未培养微生物转化成纯培养微生物。为 此，研究者利用微生物某些特性，通过变化培养条件，如向培养基加入一些特异的营养 成分，使未培养微生物转变为纯培养。例如，利用嗜高热微生物均以f e 3 + 作为最终的电 子受体这一高度保守的特性，在k a s h e f i 等【1 3 j 向培养基中加入微量的f e 3 + 从而成功的使相 应一些未培养微生物纯培养化。但此种方法建立在对该类微生物有着深入认识的基础 上。还有种方法是不使用如l b 的丰富培养基，而使用一些非丰富培养基。现在一般认为， 未培养微生物延胡囊酸水合翻 基因的克隆、表煞及百# 掌性饵薯j 定 培养中营养太丰富不适合原先在缺乏营养的环境中的未培养微生物。2 0 0 4 年，c o n n o n 等 人用非丰富培养基分离海洋微生物【1 4 j 。他从1 1 个海洋微生物样品中分离2 0 5 1 0 4 株海 洋微生物，其中有4 个细胞株系是未报道过的。通过这种培养方法，使得大量的浮游细 菌的纯培养率达到1 4 ，比之前报道的培养率提高了1 4 1 0 4 倍。 现在将未培养微生物向纯培养微生物转变的基本思路是尽量让培养环境或是培养 条件模拟微生物生长环境。如通过土壤浸出物来配制培养基。现有的培养基成分及微生 物的生长模式、代谢产物等已经较为固定，且与微生物生长的原先环境有较大差别。 z e n g l e rk 等人【i5 】通过将细胞株包埋与凝胶微滴形成的平板中，然后用非丰富一些的低营 养流动培养基代替传统培养基进行培养，再通过使用流动细胞计计数微滴平板上的克隆 数。通过这种模拟海洋微生物生长环境的开放性系统，其中的一些微生物的代谢产物能 够作为信号分子影响周边的微生物生长，从而获得更多的海洋微生物资源。 通过对未培养微生物资源的有效开发，在可预见的将来将会有越来越多的微生物资 源应用到社会发展中。 1 2 宏基因组文库 1 2 1 宏基因组文库技术简介 自1 9 9 8 年，h a n d e l s m a n 等人提出的宏基因组这个概念，其定义为 t h eg e n o m e so f t h et o t a lm i c r o o r g a n i s mf o u n di nn a t u r e ”，最初这个概念只用来定义土壤微生物t 1 6 , 1 7 j ，现在 认为是指环境中所有微生物遗传物质的总和。它包含了纯、未培养微生物的所有基因，目 前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而宏基因组学( m e t a g o n o m e ) 是指一种 以环境样品中的微生物群落的总基因组为研究对象，以基因的活性筛选和测序分析为手 段，尝试通过非传统的纯培养方式进行微生物群体的鉴定，其主要内容包括d n a 的提取、 构建宏基因组文库和目的基因克隆及筛选，其用途是可以发现新基因、基因家族、发现一 些新的微生物活性物质。以功能活性、微生物多样性、样品的进化关系及种群结构的协 作关系及与环境之样品间的相互的关系为研究目的的方法。一般步骤包括环境样品中提 取其基因组d n a ，以限制性内酶切消化宏基因组d n a ，到连接到合适的表达载体，转 化入合适的宿主菌体，通过活性筛选或是遗传标记筛选目的转化子等。 4 未培养微生物廷；胡索酸水合酶基因的克隆、表达反翻 掌性质鉴定 1 9 8 5 年，p a c e 等研究者【l8 】发表了从e n v i r o n m e n a lm i r c o b e 中直接获得总d n a 的方法。 h e a l y 【l9 】以干草生物为来源，通过富集培养，提取d n a ，构建环境微生物文库成功。 c l a r d y 和b r a d y 等人【2 0 】以构建的约7 1 0 5 个阳，克隆的e d n a 粘粒文库中筛出6 5 株具备抗 芽孢杆菌生长的阳性克隆。并从这6 5 株重组子中筛选出有1 3 种抑菌活力的n 酰基酪氨酸 类化合物。而利用该环境样品d n a 文库发现的该类，物质被报道。2 0 0 1 年，b r a d y 及c h a o 等科学家阱】从e d n a 文库筛选出1 株能，诱导成纤维细胞凋亡并具有抗白色假丝酵母、芽 孢杆菌属、链球菌属等活，性的蓝色化合物c s l 5 1 ，2 0 0 2 年，他们又从库中筛选出一株 具有抗菌活性的阳性克隆c s c 2 1 2 2 1 。 1 2 2 宏基因组文库的构建及构成 图1 2 宏基因组文库技术流程简图【2 3 j f i g 1 2t h ep r o c e s so fc o n s t r u c t i o nm e t a g e n o m i cg e n el i b r a r y 1 2 3 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建方法如图1 1 ，一般分为样品总d n a 的提取，选择合适的载体 及宿主菌后，经过酶切或是超声破碎的方法才经过连接转化将带有异源片段的重组菌分 5 论文聿培养微生物延胡索酸水合嗣| | 因的克1 叠、毒口专及嗣 掌憎曲霞鉴定 ，然后通过筛选的到合适的目的基因。而由于构建e d n a 文库的环境样品 得构建的文库容量通常较其他种类的文库，如突变体文库大，致使文库的 获得目的基因或基因家族的关键步骤之一。为了更好的研究e d n a 文库的 晒选部分的注意力投射到三个部分上：d n a 序列水平上的设计；化合物 生物活性水平上，从而建立不同的筛选方法。d n a 水平上的筛选设计被 ，它是根据d n a 序列的相似性，并以相似性高已报道序列的设计引物或 以杂交或是聚合酶链式反应( p c r ) 扩增的方式来筛选合适的重组子。通过 ，在已报道的某一类物质里可能获得它的新成员。通过基因芯片技术【1 6 】， 一种高速、高通量的筛选技术。但由于该技术是以已报道的d n a 序列为 以很难得到新型的基因或是基因家族。而被称为功能驱动筛选的生物活性 是基于重组克隆的功能筛选或是外援片段功能基因产物的筛选。通过使用 的方式，如在培养基中添加特异的指示剂、排他的生长因子或是省缺掉一 筛选。当重组子中的目的基因产物表达后，我们可以通过提取相相应的质 粒、人工细菌染色粘粒，测序后来进行生理生化检测从而了解其产物的潜在价值。使用 这种筛选策略需要功能基因能够活性表达；往往费时费力；且效率较低( r e f l z p 5 2 8 7 5 61 1if u m a r a t e y p - 0 0 1 3 0 3 0 2 4 1h y d r a t a s e 【b a c t e r o i d e ss p 2 _ 17 】 3 9 33 9 33 0 1 1 z p0 5 5 4 4 9 4 2 1 g b l a b r 4 3 4 0 2 1f u m a r a s e p a r a b a c t e r o i d e s f u m a r a t eh y d r a t a s e ，c l a s si i 【p a r a b a c t e r o i d e ss p d 1 3 】 g b i e e u 5 16 8 8 1f u m a r a t eh y d r a t a s e ，c l a s s 3 8 93 8 93 0 1 2 4 1 广西大掌硕士掌位论文 未培养微生物延胡索酸水合酗 基因的j l i t l - 、毒邀及翻 掌它l i t - l l - 定 i i 【p a r a b a c t e r o i d e ss p d 1 3 】 m a xt o t a l q u e r y e - a c c e s s i o n d e s c r i p t i o n s c o r es c o r ec o v o rv a l u e a g e p r o b a b l ep h a g e r e l a t e dt a i lt r a n s m e m b r a n ep r o t e i n z p _ 0 2 4 9 3 6 6 3 1 3 7 73 7 73 3 2 8 【b u r k h o l d e r i a p s e u d o m a l l e in c t c1 31 7 7 g p 2 6 ，b a c t e r i o p h a g em e m b r a n ep r o t e i n 【b u r k h o l d e r i a p h a g e p h i e 2 0 2 】 g b i a b 0 6 0 7 y p _ 0 0 1 111 0 5 7 13 7 73 7 73 3 2 8 1 3 6 1g p 2 6 ，b a c t e r i o p h a g em e m b r a n ep r o t e i n 【b u r k h o l d e r i a p h a g e p h i e 2 0 2 】 z p0 4 9 0 3 5 0 2 1 z p0 2 4 4 5 3 4 1 1 z p0 2 5 0 1 9 0 1 1 p u t a t i v em e m b r a n ep r o t e i n 【b u r k h o l d e r i a p s e u d o m a l l e is 1 3 】 g b i e d s 8 6 514 1p u t a t i v e m e m b r a n ep r o t e i n 【b u r k h o l d e r i ap s e u d o m a l l e i s 1 3 】 p r o b a b l ep h a g e - r e l a t e dt a i lt r a n s m e m b r a n ep r o t e i n p r o b a b l ep h a g e r e l a t e dt a i lt r a n s m e m b r a n ep r o t e i n p h a g e r e l a t e dt a i lt r a n s m e m b r a n ep r o t e i n 【b u r k h o l d e r i at h a i l a n d e n s i se 2 6 4 】 r e t l z p _ 0 5 5 9 0 913 1p h a g e - r e l a t e dt a i l 3 7 73 7 73 3 2 9 3 7 73 7 73 3 3 0 3 7 73 7 73 3 3 2 y p _ 4 3 9 5 2 3 1 t r a n s m e m b r a n ep r o t e i n 【b u r k h o l d e r i a3 7 73 7 73 3 3 2 z p0 1 9 0 4 0 9 3 1 t h a i l a n d e n s i se 2 6 4 】 g b i a b c 3 5 3 2 4 1p r o b a b l e p h a g e r e l a t e dt a i lt r a n s m e m b r a n ep r o t e i n a z w k 3 b 】 g b i e d m 7 0 3 0 2 1it r a n s p o s a s e ， 3 7 43 7 41 7 3 9 4 2 广西大掌硕士掌位论文束培养微生物延胡索酸水合翻 基因的j e , 1 t - 、毒j 及翻 掌扫曲霄薯j 定 n p5 2 2 4 9 1 1 b a h 4 7 2 9 0 1 z p0 5 6 1 4 4 2 4 1 c a d l 8 0 8 1 2 y pl l l l 0 0 1 y p0 0 1 11 2 6 6 7 1 z p0 1 8 7 7 8 8 9 1 h y p o t h e t i c a lp r o t e i nr s 0 5 4 0 3 【r a l s t o n i a t y p ei i i f f e c t o rp r o t e i n l o n g - c h a i n - f a t t y - a c i d - c o al i g a s e f a e e e u 9 718 2 1l o n g c h a i n f a t t y - a c i d - - c o a l i g a s e 【f a e c a l i b a c t e r i u mp r a u s n i t z i ia 2 - 16 5 】 p r o b a b l et y p ei i ie f f e c t o rp r o t e i n ( s k w p 3 ) b a c t e r i o p h a g em e m b r a n ep r o t e i n 【b u r k h o l d e r i a p s e u d o m a l l e ik 9 6 2 4 3 】 e