（细胞生物学专业论文）果蝇coxr条件性基因打靶载体的构建.pdf

窖；erj 乞 c o n s t r u c t i o no f t a r g e t i n gv e c t o rf o rc o n d i t i o n a lk n o c k o u t o fd r o s o p h i l ac o x - r at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：y u a ny a y a n s u p e r v i s o r ：p r o f l ic h u n x u a n h u b e iu n i v e r s i t y w u h a n ，c h i n a 咖0iiiii_2 伽7m 3洲7iiiii-y 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 日期：plo 年6 耘瞄徽 月l7 日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览 服务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论 文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内 容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 日期：仞。川6 7 日鞭舭弦6 | 7 ， 摘要 果蝇是一种有着丰富遗传学表型的模式生物，经常被应用于基因功能的研究中。本 实验室在1 9 9 1 年，从野外采集的黑腹果蝇自然种群中发现了一只黑色雌蝇，并由此建立 了单雌系，其后代连续1 4 代互交，因为背甲的颜色特点，将此突变体命名为黑条体( b l a c k s 护p 口屯，b s r ) 。在对黑条体的研究中发现了其与野生型比较缺失了一段4 0 b p 的d n a 片段， 且与功能未知基因c g 3 1 0 0 7 重叠，将该基因命名为c o x - r 。 本实验室人员曾采用r t p c r 技术研究了c g 3 1 0 0 7 基因在黑腹果蝇不同发育时期和 不同组织部位的表达情况，发现其在幼虫中的表达量明显低于在蛹和成虫两个时期的表 达量，而在头和身体的表达量相同。在此基础上利用生物信息学方法和多种亚细胞定位 预测软件对基因c g 3 1 0 0 7 编码的蛋白产物进行亚细胞定位预测分析，其定位于线粒体的 可能性最大，因此该基因在色素形成中极有可能扮演重要角色。为了最终清楚果蝇中 c o x - r 基因的功能，需要采用更精确的手段来验证。因此，本实验以果蝇突变体一黑条 体的基因组d n a 为模板，扩增包括c o x - r 基因在内的上下游同源臂序列，通过引入l o x p 和 n e o 基因等步骤，以构条件性敲除c o x - r 基因的打靶载体。并经多个限制性核酸内切酶酶 切鉴定和测序，证实我们构建的果蝇c n 尼基因条件性打靶载体符合设计要求。该打靶载 体的构建，为建立c o x - r 条件性基因敲除果蝇模型奠定基础。 关键词：黑腹果蝇；黑条体；基因c 0 啊r ；基因c g 3 1 0 0 7 ；条件性基因敲除 a b s t r a c t d r o s o p h i l ai sak i n do fm o d e la n i m a l sw h i c hc a n b eu s e di nt h es t u d i e so fg e n ef u n c t i o n f o ri t sa b u n d a n tg e n e t i cp h e n o t y p e s ab l a c kf e m a l ed r o s o p h i l aw a sf o u n df r o mt h en a t u r a l p o p u l a t i o n so fb l a c kb e l l yd r o s o p h i l at h a tg a t h e r e df r o mf i e l db yo u rr e s e a r c h e ri n 19 91 l a t e r , t h es i n g l ef e m a l es y s t e mw a se s t a b l i s h e d t h eo f f s p r i n go ft h es i n g l ef e m a l es y s t e m w e n tt h r o u g hs u c c e s s i v e14g e n e r a t i o n sw i t l le a c hc o p u l a t i o n ，i tw a sn o m i n a t e da l sb s ra sa r e s u l to fi t st e r g u mc o l o u r ab s rs e g m e n tw h i c hl o s e4 0b pw a sd i s c o v e r e di nt h el a t e r s t u d i e s ，w h i c ho v e r l a pw i t hu n k o w n e dg e n ec g 3 1 0 07i nf u n c t i o n ，t h eg e n ew a sn o m i n a t e da s t h et e m p o r a la n ds p a t i a le x p r e s s i o no fc g 3 1 0 0 7w e r es t u d i e di nt h r e ed i f f e r e n t d e v e l o p m e n ts t a g e ，t h a ta r el a r v e ，p u p l ea n da d u l t ，t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ee x p r e s s i o n l e v e lo fg e n ec g 3 10 0 7i nl a r v es t a g ei sl o w e rt h a nt h a ti no t h e r s ，b u ti ss a m ei na d u l t sh e a d a n db o d y o nt h a tb a s i c ，t h r o u g hb i o i n f o r m a t i c sw a y sa n dm u l t i p l ep r o t e i ns u b c e l l u l a r l o c a t i o ns o f t w a r e ，t h es u b c e l l u l a rl o c a t i o np r e d i c t i o na n a l y s i so ft h ep r o t e i np r o d u c to fg e n e c g 3 1 0 0 7w a sm a d e ，i ti sp o s s i b l et h a tt h ep r o d u c tw a sl o c a t e di nt h em i t o c h o n d r i o n t h e g e n em a yt a k ei m p o r t a n tr o l ei nt h ef o r m a t i o no ft h ep i g m e n t i no r d e rt om a k ec e r t a i nt h e f u n c t i o no fg e n e ，t h em o r ep r e c i s ev a l i d a t i n gs h o u l db ec a r r i e do u t f o rt h ep u r p o s eo f i n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no fc o x - rg e n et h r o u g ht h eg e n ek n o c k o u tw a y , a c o n d i t i o n a lg e n e t a r g e tv e c t o ri sc o n s t r u c t e d i nt h a te x p e r i m e n t ，t h eg e n o m ed n a o fb s ri su s e da st e m p l a t e ， a m p l i f i c a t eh o m o l o g o u sa r ms e q u e n c ei n t h eu p p e ra n dd o w ns t r e a m st h a ti n c l u d i n gt h e c o x - rg e n e ，a n di n s e r tg e n el o x pa n dg e n en e ot os e tu pt h ec o n d i t i o n a lt a r g e tv e c t o rt h a t c a nk n o c k 。o u tc o x - rg e n ei nv i v o t h e m u l t i p l ee n z y m ec u t t i n g w i t hr e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s ea n ds e q u e n c i n gi n d i c a t e dt h a tt h ev e c t o rt h a tw ec o n s t r u c ta c c o r dw i t ht h e e x p e c t e dr e q u i r e m e n t t h e c o n s t r u c t i o no ft h e t a r g e t v e c t o r l a yt h ef o u n d a t i o n f o r e s t a b l i s h i n gc o x - rc o n d i t i o n a lg e n ek n o c k - o u td r o s o p h i l am o d e l k e yw o r d s ：d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ；b l a c ks 护e a k ；g e n ec o x - r ；g e n ec g 3 1 0 0 7 ； c o n d i t i o n a lg e n ek n o c k o u t i i 目录 前言1 1 黑腹果蝇基因功能及其相关的研究现状l 1 1 黑腹果蝇的基因功能研究1 1 2 黑腹果蝇核型多样性研究2 1 3 黑腹果蝇行为学研究2 2 黑腹果蝇新突变体的发现及表型特点2 3 新突变体突变基因c o x - r 的发现及研究3 3 1 新突变体突变基因c o x - r 的发现与命名3 3 2 基因c g 3 1 0 0 7 的研究进展4 4 基因敲除及其研究现状4 4 1c r e l o x p 系统5 4 2 基因捕获载体系统。6 4 3 转座子系统6 4 4h i t 和r u n 法7 4 5 双置换法7 4 6i a 干扰7 5 基因敲除技术在果蝇中的应用8 6 本实验的研究目的及意义9 材料与方法10 1 实验材料、试剂和仪器1o 1 1 实验材料1 0 1 2 实验试剂1 0 1 3 实验仪器10 1 4 引物合成1 1 2 实验方法和步骤1 1 2 1 抽提黑条体果蝇总d n a 1 1 2 2p c r 扩增1 2 2 3p c r 产物回收和纯化13 2 4 连接反应和连接物的转化1 3 i i l 2 5 质粒的抽提1 4 2 6 酶切反应15 2 7d n a 聚合酶补平末端1 5 2 8 构建打靶载体1 6 2 9 打靶载体的验证1 6 结果与分析1 7 1 抽提黑条体果蝇的总d n a 1 7 2 构建条件性打靶载体。1 7 2 1 扩增c o x - r 基因，构建p m d c o x 重组质粒1 7 2 2 构建p d n r c o x 重组质粒1 8 2 3 构建p d n r c o x - n e o 重组质粒2 1 2 4 构建插入片段2 2 2 5 扩增同源重组臂4 7 1 1 b p ，构建p c r 2 1 4 7 1 1 重组质粒2 3 2 6 构建连接载体一2 5 2 7 构建条件性打靶载体2 6 3 酶切验证条件性基因打靶载体2 7 讨论2 9 1 本实验构建的打靶载体特点2 9 1 1 载体类型2 9 1 2 同源重组臂的构建2 9 1 3c r e 蛋白的表达3 0 2 关于打靶载体的验证情况31 3 后续工作3 2 3 1 关于显微注射3 2 3 2 细胞筛选3 2 4 展望3 3 参考文献3 4 附录3 8 致谢3 9 i v 前言 j 上- o 月i j吾 黑腹果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 作为生物学研究的经典模式生物，近百年来，研 究人员不断发现了它的新突变体，并借助这些突变体研究其突变位点、突变方式以及突 变效应，这对于深入了解突变功能和揭示其相关的基因的调控网络都具有一定意义。在 黑腹果蝇突变体中包括许多体色表型发生变化的品系如黄体、黑体和黑檀体等。由于果 蝇体色发育机制可以简化的反映出更为复杂的机体发育机制，所以体色发育过程的相关 研究也越来越受到重视，近年来该领域一直是国内外研究的热点。 1 黑腹果蝇基因功能及其相关的研究现状 1 1 黑腹果蝇的基因功能研究 黑腹果蝇种组隶属于果蝇科( d r o s o p h i l i d a e ) 、果蝇属( d r o s o p h i l a ) 、水果果蝇亚属 ( s o p h o p h o r a ) 。由于其丰富的遗传学表型，黑腹果蝇在基因功能的研究中常被作为研究 对象。目前，已经有许多研究者对果蝇的基因功能进行了研究，如马克君( 2 0 0 9 ) 利用 p 因子跳出的方法研究w a l 4 ，基因，结果表明w 0 3 4 ，基因可能与果蝇的性别决定有一定关系； 还有陈丽娟( 2 0 0 8 ) 采用u a s - - g a l 4 系统对果蝇胁阳( 组蛋白调节基因) 基因的功能 进行初步的研究，结果表明该基因的过量表达可能干扰了与细胞周期、细胞凋亡等相关 基因的正常表达，导致早期胚胎的大量死亡。 最近科学家新培育出一种转基因果蝇，他们可以通过激光照射来遥控果蝇的行为， 这种方法对于研究动物的神经和行为有着重要意义。以前科学家多使用电极刺激神经等 方法来研究动物行为的神经基础，但是这些方法可能会妨碍动物的行动甚至导致瘫痪， 而且电极也无法接触到整个神经系统里的每个神经元( 卢丽等，2 0 0 6 ) 。美国耶鲁大学 的神经生物学家们将一个来自大鼠的基因植入到黑腹果蝇的体内，这个基因编码一种离 子通道蛋白，该离子通道允许带电粒子通过细胞膜，从而传递电脉冲。实验结果表明， 如果该离子通道蛋白质在控制果蝇爬行的多巴胺能神经元中表达，原本慵懒的果蝇在激 光的照射下会变得过度活跃：如果离子通道在控制果蝇逃跑反应的大神经中表达，激光 可使果蝇跳跃、抖动翅膀并飞走。科学家认为这一新的技术可应用于生物的求偶、交配 和进食等多种行为的研究中。 湖北大学硕士学位论文 1 2 黑腹果蝇核型多样性研究 目前，在世界范围内，黑腹果蝇种组共有1 2 个种亚组、大约1 8 0 种，中国有1 0 个种 亚组约6 7 种。钱远槐教授( 2 0 0 6 ) 曾通过传统的敲片、g i e m s a 染色的方法制片，以中国 黑腹果蝇种组的8 个种亚组4 0 种果蝇为研究对象，对它们的染色体进行分析，共发现有 1 8 种核型，其中的a ，a ”，c ，c ”，d ”和f 为新发现的核刑。在确定的8 个种亚组基本核型 的同时，还发现奥尼氏、林氏、吉川氏、拟嗜凤梨和叔白颜5 种果蝇有b 染色体。这个研 究证明了在黑腹果蝇种组内、亚组内、种内和单雌系内的核型多样性，并为果蝇的遗传 和进化方面提供了进一步的细胞学证据( 钱远槐等，2 0 0 6 ) 。 1 3 黑腹果蝇行为学研究 行为学研究的主要内容是对动物的行为进行观察和记录。具体包括行为谱研究、比 较行为学研究和对各种行为型进行分类和命名。其中，建立动物的行为谱( e t h o g r a m ) 是 行为学研究中最基础的内容，行为谱就是对一种或一类动物正常行为的全部名录或记 录，在行为谱中，梳理行为是被研究较多的一种，它普遍地存在于鸟类、昆虫和哺乳类 等各种动物中，对动物具有重要的生理意义以及社会功能。黑腹果蝇的身体表面分布有感 觉毛，通过对身体表面进行梳理以除去异物和细菌，来保持身体的清洁，以利于感知外界环 境的变化，与外界进行信息交流。因此，梳理行为对果蝇具有重要的生理意义。魏朝明等 为了构建黑腹果蝇的梳理行为谱并研究其行为序列，使用集中个体取样法和扫描取样法 观察记录目标动物的行为，并用e t h o m 软件处理数据。结果发现黑腹果蝇梳理行为共计1 5 种，且具有特定的行为序列，即前足与后足参与的梳理行为很少产生联系，去翅后梳理行 为组成及行为序列均未改变。并得出结论果蝇的梳理行为是一种先天定型行为，各梳理行 为之间具有特定的时间序列而非随机出现( 魏朝明等，2 0 0 6 ) 。 2 黑腹果蝇新突变体的发现及表型特点 黑腹果蝇的体色突变类型常见的有黑体( b l a c k , b ) 、黑檀体( e b o n y , e ) 和黄体( y e l l o w , y ) ， 分别位于第二染色体、第三染色体和x 染色体上。黑条体突变型是本实验室于1 9 9 1 年9 月从野外采集的黑腹果蝇自然种群中发现的一只黑色雌蝇，并由此建立了单雌系，单雌 系后代连续1 4 代互交，体色背甲均为黑色且无分离现象( 钱远槐等，1 9 9 4 ) ，该突变型 的主要特征是：背甲黑色，比已知黑檀体突变型略浅，其上有5 条：采黑色纵行条纹，腹 2 h u矗 部横纹比野生型较黑并加宽，翅不透明呈烟色，翅脉周围呈浓烟色，我们将其命名为黑 条体( b l a c k s t r e a k , b s r ) 。近年来，黑条体突变系体色性状已分化为深黑褐色和浅黄色。 各类颜色个体互交子代无显隐性之分，同一性状个体互交子代又分离出深黑、褐色和浅 黄色。背甲上的条纹也分化为5 条、3 条、l 条和无条纹，各纹型个体之间交配子代性 状无显隐性之分，同一纹型个体互交，子代又有少量交叉性状分离，体色与背甲条纹的 关系是：5 条条纹的个体具褐体色或浅黄体色，0 条的都表现为浅黄体色，其他条纹的都 为褐体色。 辱郇。，袖 - 。 。 图l ：野生型( w t ) 及突变的黑条体( b s r ) 果蝇：可见不同体色及背甲的5 种黑色条纹图式。 从左至在依次为深黑体色，褐体色5 条，3 条，1 条，野生型( _ t 9 1 9 1 0 ) 和浅黄体色0 条。 ? ；， 3 新突变体突变基因c o x - r 的发现及研究 3 1 新突变体突变基因c o x - r 的发现与命名 为了弄清黑条体体色分化现象是如何产生的，近年来本实验室通过互补杂交实验， 己将黑条体的突变基因定位于第三染色体的9 3 d 处，结果显示该性状是黑檀体( e ) 的等 位突变，通过与已发表黑檀体等位突变型的比较表明是一种新的突变，黑条体( b s r ) 表现出的复杂性状是其他己知黑檀体突变系所没有的( 张菁等，2 0 0 1 ) 。为了确定突变 表型，金珊等对黑条体突变体进行e b o n y 基因的克隆与测序，实验中发现e b o n y 基因在黑 条体中比在野生型黑腹果蝇中的d n a 序列少了9 5 3 个碱基，经对比分析确定，缺失序列 为5 端非翻泽区靠近3 端外显子l 的2 0 6 个碱基和内含子l 的7 4 7 个碱基( 金珊等，2 0 0 5 ) 。 r t p c r 结果显示该基因的转录没有被抑制，但其在翻译水平上受到第一个内含子的严 湖北大学硕士学位论文 重干扰，w e s t e r n b l o t t i n g 工作显示该突变体内不存在正常的黑檀体蛋白。 为了进一步探讨如何出现b s r 复杂性状的分子机制，本实验室人员采用差异显示反 转录p c r 技术比较黑条体( 丑娘) 与野生型( 砑) 的基因差异表达，共得到6 个差异 片段。经r t p c r 验证，发现一长为2 1 5 b p 的阳性片段在b s r 中的表达水平明显低于在 w t 中的表达。将获得的片段采用单引物p c r 扩增技术，逐段测序后将重叠序列拼接， 分别得到了8 4 4 b p 的胛片段和8 0 4 b p 的b s r 片段，后者比前者缺失了 4 0 b p 。将8 4 4 b p 的胛片段在n c b i 上b l a s t ，发现此片段的序列与未知功能基因c g 3 j 7 重叠，最后 将该基因命名为c o x - r ，因此通过对基因c g 3 1 0 0 7 的功能进行预测，可以初步分析 c o x - r 基因的功能。( 刘玉委，2 0 0 6 ) 3 2 基因c g 3 l 0 0 7 的研究进展 本实验室人员通过b l a s t 检索到基因c g 3 1 0 0 7 的蛋白质序列中含有一个典型的c h c h 结构域( c o i l e dc o i l1 】_ h e l i x1 】一 c o i l e dc o i l2 - h e l i x2 d o m a i n ) ，据此推测该基因编码的产 物可能与细胞色素c 氧化酶的功能相关，同时有资料报道，线粒体中如果有1 4 2 0 2 存在， 细胞色素c 可以氧化儿茶酚胺生成黑色素。利用生物信息学方法和多种蛋白亚细胞定位 预测软件对基因c g 3 1 0 0 7 编码的蛋白产物进行亚细胞定位预测分析，六个数据库预测 的结果中，除了一个推测线粒体为第二候选，其它五个都预测其定位于线粒体的可能性 最大，由此可推测基因c g 3 1 0 0 7 的编码蛋白最有可能定位于线粒体中，而本实验室的 最新研究也显示，该基因在细胞定位于细胞质中。为了进一步研究基因c g 3 1 0 0 7 的生 物学功能，特别是其在色素形成和进化中所产生的作用，通过r t - p c r 技术研究该基因 在不同发育时期和不同部位的表达量，发现其在幼虫中的表达量明显低于蛹和成虫两个 时期的表达量，而在头和身体的表达量相同( 田莉，2 0 0 8 ) 。至此，我们可以预测出该 基因在色素形成中极有可能扮演重要角色，为了最终弄清它的功能，需要我们采用更精 确的手段来验证。 ， 4 基因敲除及其研究现状 随着人类基因组计划的完成和人类基因信息的不断完善，基因组学的研究也从结构 基因组学转向功能基因组学，即后基因组时代，基因功能的研究已成为近年来国际上的 热点。目前对于基因功能的研究方法主要包括基因敲除和敲入技术、人工染色体的转导、 反义技术、m i c r o r n a 和微阵列分析等几种方法。 4 h u苫 基因敲除技术是功能基因组学研究的重要研究工具，也被称为基因打靶，是在8 0 年 代后期应用d n a 同源重组原理发展起来的- - f - j 新技术。它是指从分子水平上将个结构 已知但功能未知的基因去除或替代，然后通过整体观察实验动物，推测相应基因功能的实 验方法。它可以对基因组进行精细改造，且外源基因通过基因打靶准确插入到靶位点， 不会对其他基因的表达和修饰产生影响，为后续的分析提供了极大的方便，这些都是其 它技术所无法比拟的。基因敲除主要包括下列步骤：构建重组载体；将重组d n a 转入 受体细胞核内；利用标记基因筛选目的细胞；转基因动物。近些年发展起来的 c r e - l o x p 系统及基因捕获、转座子系统分别从不同方面解决了基因敲除中遇到的一些问 题( 万海英，2 0 0 7 ) 。 4 1c r e l o x p 系统 目前，主要的基因敲除技术有：c r e l o x p 系统、f l p f r t 系统、g 么工伽4 s 系统及基 因足迹( g e n e t i cf o o t p r i n t i n g ) 等定点突变或敲除基因等。c r e l o x p 系统利用的是噬菌体的 p l 基因编码的3 8k u 的c r e ( c y c l i z a t i o nr e c o m b i n a t i o n ) 重组酶蛋白，c r e 可介导l o x p 的 3 4b p 重复序列的位点间的特异性重组，即切除两个l o x p 位点间的d n a 片段和1 个 l o x p 位点，保留1 个l o x p 位点( a o y a m a e ta 1 ，2 0 0 5 ；b e l t e k i ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。l o x 尸位点 含有两个1 3b p 的反向重复序列和一个8b p 的核心序列c a l ，以前只能在胚胎期敲除基 因使之不能表达，现在可在特定发育阶段敲除基因使之不表达，这样可防止由于机体的 代偿而使目的基因的表型不显现或出现混合表型变。有研究人员用i f n 反应性增强子来 控制基因重组的时间，或者用四环素调控表达系统来控制c r e 基因的活性，达到了基因 的定时敲除。因为c r e 的重组必须在两个方向相同的l o x p 位点间进行，所以可先在两 个l o x p 位点间插入一个终止信号进而产生带有这种载体的转基因鼠，再与带有c r e 基 因及其启动子的转基因鼠进行杂交，这样可使靶基因进行表达，采用这种方法还可使所 研究的基因产生条件性表达。 f z p 职丁系统的作用机理与c r e l o x p 系统的机理类似，凡尸也是位点特异的重组酶， 它可在f l p 识别位点f 尺丁间对基因进行切割重组。该系统主要应用于果蝇中，但 在哺乳动物上还未见到应用。g a l 4 u a s ( u p s t r e a ma c t i v a t i n gs i t e ) 的作用原理不同于前 两者，g a l 4 是酵母转录活化因子，它与某一基因的增强子结合可以使该基因产生错误 表达，从而使基因的功能丧失。尽管已对g a l 4 u a s 系统作了很多改进，但与f l p f r t 系统一样，它也只局限于在果蝇中应用。 湖北大学硕士学位论文 4 2 基因捕获载体系统 用常规方法进行基因打靶，必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组 克隆，耗费大量的时间和人力。利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的e s 细 胞库，更有效和更迅速地进行染色体组的功能分析( a m a r i ep h i l l i p se ta 1 ，2 0 0 5 ) 。典型 的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是n e o 基因，n e o 基因插入到e s 细胞染色体组中，利用捕获基因的转录调控元件，很容易在含g 4 1 8 的选择培养基中筛 选出实现表达的e s 克隆。 用基因捕获法在一次实验中就可得到数以百计的带有单基因剔除的e s 克隆。但此 方法的不足是只能剔除在e s 细胞中表达的基因。随着哺乳动物体细胞克隆新个体的成 功实现，在体细胞中应用基因捕获来剔除更多在发育晚期才表达的基因，其后通过核移 植技术获得带有突变基因的动物个体，这在某种程度上可以弥补以上缺陷。另外用基因 捕获法进行基因剔除还存在的另一个不足是无法对基因进行精细的遗传修饰。 4 3 转座子系统 转座子( t r a n s p o s o n ) 是可以移动的基因单位，能够在多种生物( 包括玉米、昆虫、人 类等) 中被识别，它的结构主要包括中间抗性基因及双侧末端重复序列、转座酶读码框 等，转座子系统已成为对许多组织器官进行基因分析的工具。 现在使用较多的有睡美人转座子( s l e e p i n gb e a u t y ，s b ) 幂d 夸娥转座子( p i g g y b a c ，p b ) 。 睡美人转座子在小鼠和人细胞中可以激活，但是转座子插入序列只能集中于起始位点附 近，从而限制了d n a 片段的携带；夸娥转座子发现则成功地解决了d n a 片段的携带限制 这一问题，它能有效地在非同源染色体上发生重组且特异地发生在t 吖蚺位点上，而且p b 转座子能携带复杂的标志基因，并允许这些基因在不同插入位点上表达，它已成为非常 有力的基因插入工具。目前应用最广的是m i n i m u 转座子，它是能适用于任何物种的转 座子打靶载体，：它以噬菌体m u 为基础。与传统的载体构建方法相比较，该方法迅速且技 术简单，载体通常可以在两周内产生，能携带多种不同抗性基因并同时处理多基因 ( a s k e w g r e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。但其应用范围有限，只适用于长度在1 0 - - 1 5k b 且有一段克隆到的 原始基因组序列。同时转座子产生的重组载体缺少传统载体那样的明确性。这些都限制 了转座子的应用。 6 前言 4 4h i t 和r u n 法 人类的疾病中有许多都是由于基因点突变引起的功能异常，如人类镰状红细胞贫 血就是由于编码血红蛋白p 链第6 位的谷氨酸( g a g ) 被缬氨酸( g u g ) 取代所引起的 ( b a r k e r ，n e ta 1 ，2 0 0 7 ) 。但这种基因病无法用敲除整个基因的方法来获得相应的疾病模 型，因此研究者开始将精细突变的方法引入到基因研究的工作中来。h i t 和r u n 法也被 称为进退策略，它包括两次的同源重组：第一步( h i t ) 是利用插入型载体来进行同源重组， 向靶位点插入带有突变的基因组序列和带有两个筛选标记的载体序列；第二步( r u n ) 是 利用t k 标记基因进行抗性筛选，去除含有负筛选标记基因的载体序列。进退策略法的缺 点有：不能同时引进多个位点突变；无法精确控制染色体内的同源重组；整个过 程需要采用两种培养基分别进行先后筛选。 4 。5 双置换法 童 双置换法( d o u b l er e p l a c e m e n t ) 也属于精细突变敲除，它最早被称为“i n o u t ”法。第 一步用含有h p r t 基因的打靶载体转染h p r t - e s 细胞，由于h p r t 基因双侧是靶基因的同 源序列，通过在h a t 培养基中筛选后再用p c r 进行基因组分析，筛选出发生同源重组 且h p r t 基因整合到基因组中的阳性克隆。第二步是用只携带突变同源序列的打靶载体 转染上一步获得的h p r t + e s 细胞。同源重组发生后，突变序列整合入基因组，置换出 h p r t 。此种方法的优点在于：第一步获得的h p r t + e s 细胞，除了可用于产生普通的基 因剔除小鼠外，更可作为将不同突变引入靶基因的基础。m o o r e 等在1 9 9 5 年将此方法 进行少许改进，称其为双置换法。他们用这种方法将5 种突变分别引入p r i o n 蛋白基因， 探讨研究人类n f d 刀蛋白相关疾病及其基因治疗的可能性 4 6r n a 干扰 除了基因敲除外，其他基因删除的方法也得到了迅速发展，应用最广泛的当属r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 、反义寡核苷酸技术等。与传统打靶技术相比，r n a 干扰操 作简单且费时短，已经成为基因删除的重要工具。同时，r n a i 技术也已经可以通过 s h r n a ( s h o r th a i r p i nr n a ) 表达盒子能够在细胞中像在动物模型中一样产生有效的、 稳定的和可调节的基因沉默作用。但是在基因表达的蛋白的结构异常研究中，r n a i 是无 法取代基因敲除的作用的( 万海英，2 0 0 7 ) 。 湖北大学硕士学位论文 5 基因敲除技术在果蝇中的应用 目前获得果蝇突变体的常规操作有基因打靶、e m s 诱变、x 射线诱变、p 因子插入 等几种手段，但是获得精细突变采用较多的还是基因打靶和p 因子插入。 近几年，运用基因敲除技术来研究果蝇的基因功能的报道越来越多。例如，有研究 人员为了研究果蝇中w a w 基因的功能，构建了一个含有突变a t g 并且有移码突变片段 的外源质粒，通过质粒大提的方法得到用于注射要求的质粒，再用显微注射的方法注射 到果蝇的卵中，利用同源重组的原理在果蝇中进行基因打靶，最后通过p 因子跳出的方 法敲除目的基因。还有研究人员利用p 转座子敲除技术对果蝇c g 3 2 9 5 基因进行敲除研 究，他们将果蝇1 4 2 3 4 系的p 转座子与2 3 系中的转座酶基因组合到同一个体中，使p 转座子在体内敲除掉目的基因，再从后代挑选出既不含p 转座子也不含转座酶基因的 5 0 0 头雄蝇，分别与缺失c g 3 2 9 5 基因的测交系交配，从后代中经筛选获得c g 3 2 9 5 基因 敲除候选系。但是传统的方法只能在基因组中插入较小的d n a 片段，v e n k e n 和b e l l e n 将含有d n a 片段的p 转座因子转入到质粒中，质粒比p 转座因子自身能更稳定地携带 大片断d n a 。这种方法可以将2 0 k b 1 3 3 k b 的d n a 敲入到果蝇基因组中，这一突破使 生物学家向果蝇体内敲入大片段d n a 成为了可能( 马克君，2 0 0 9 ) 。 基因打靶技术是在d n a 水平上对基因组进行定点、定量地改造，为了将目的基因 敲除，需要我们人工构建一段同目的基因高度同源的d n a 序列，通过转基因的方法将 此段突变序列整合到果蝇染色体，再通过两步的同源重组替换掉原来的基因，最终产生 基因打靶的结果，达到对基因组进行精细改造的目的。外源基因通过基因打靶准确插入 到靶位点，不会对其他基因的表达和修饰产生影响，为后续的分析提供了极大的方便； 基因打靶技术不但可以实现基因敲除，还可以实现基因敲入，产生功能获得突变体，这 些都是其它技术所无法达到的。 但是，基因打靶技术在果蝇中的低效率严重制约了该技术在果蝇中的应用，而影响 打靶效率的因素有：载体同源片段的长度和比例，负向选择标记，转化受体类型，受体 基因组状况( c a p e c c h ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。随着分子生物学和转基因技术的发展，载体构建和转 基因技术已经不再是基因打靶效率的制约因素，而同源重组才是基因打靶的关键，它是 基因打靶的分子生物学基础。目前有很多模型对同源重组的机制进行了解释，但是确切 机制目前仍不清楚( 彭礼繁，2 0 0 9 ) 。外源基因在原核生物或低等真核生物中的转化总 是以同源重组为主，而在包括果蝇在内的高等真核生物中主要是随机整合到基因组中。 前言 因此对同源重组的机理和影响打靶效率因素的深入研究是提高打靶效率的重要环节。 6 本实验的研究目的及意义 在前期研究中，本实验室已对黑腹果蝇野生型和黑条体突变体的差异基因 c g 3 1 0 0 一进行了部分克隆和序列分析。同时通过对基因c g 3 1 0 0 7 时空表达研究、基因产 物的亚细胞定位和功能预测等工作，探讨该基因所参与的生化过程和果蝇个体体色形成 的机制，为昆虫甚至其他物种的着色研究提供有益的线索。然而，与c o 必尺相关的果蝇 c g 3 7 基因的完整结构、功能和表达至今我们一概不知，因此，本研究的结果也是果 蝇基因组研究中的重要成果。 为了验证c o x - r 基因的功能，本实验试图通过基因敲除的方法进行c o x - r 基因功 能的研究。我们以黑条体果蝇为研究材料，用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件设计p c r 引物， 扩增目的基因c o x - r 以及该基因上下游各2 0 0 0 b p 左右的片段作为同源重组臂。利用特 定的打靶载体中存在的c r e - l o x p 系统，将所需片段通过限制性内切酶切割，依次连接 到打靶载体上，去磷酸化后将插入片段和连接载体平端连接，最后成功构建c o x - r 条 件性打靶载体，为下一步获得条件性基因剔除果蝇模型打下基础。 本实验采用的c r e l o x p 系统构建的c o x - r 条件性基因打靶载体属于置换型载体， 打靶载体注射入果蝇卵细胞后可观察其表型及行为学变化。打靶对象如果为野生型 ( w t ) ，则将c o x - r 基因替换掉c g 3 1 0 0 7 基因，删除后可验证c g 3 1 0 0 7 基因的功能； 打靶对象如果为突变型( b s r ) ，则将c o x - r 基因删除后，可验证突变基因功能。采 用此方法可达到基因敲除作用，比r n a i 更为精确。本实验的研究成果属于果蝇后基因 组研究的一部分，即对基因组进行动态的生物学功能的研究，为探讨与疾病相关基因提 供一定的依据。 9 湖北大学硕士学位论文 1 实验材料、试剂和仪器 1 1 实验材料 材料与方法 野生型黑腹果蝇( d m e l a n o g a s t e r ) 及黑条体突变体果蝇( b s r ) 由本实验室提供， 在标准玉米培养基中，温度2 5 。c ，湿度5 0 6 0 ，1 2 d , 时光照和1 2 小时黑暗循环的条件下 培养。 1 2 实验试剂 t a qd n a 聚合酶上海中科开瑞生物工程有限公司 柱式胶回收试剂盒 a x y g e n 公司 p m d 1 8 t 载体 大连宝生物工程有限公司 p d n r - l r 载体 c l o n t e c h 公司 p e g f p - n 1 载体 北京鼎国公司 t 载体( p c i 也1 ) 试剂盒 i n v i t r o g e n 公司； p c r 引物上海英俊生物技术有限公司 d n am a r k e r大连宝生物工程有限公司 各种限制性内切酶( k p n 2 i ，n c o i ，s a c i ，s a l i ，m l u i ，n o t i ，x h o i ，c p o i ，e c o r i ，p s t i ，s f i i ， b a m