（细胞生物学专业论文）转lgtc基因甜菜糖分分析和转乳糖合成酶基因甜菜的获得.pdf

山东大学硕士学位论文 转红c 基因甜菜糖分分析和转乳糖合成酶基因甜菜的获得 摘要 g l o b o t r i o s e 是一种具有重要价值的寡糖。在大肠杆菌中，在外源添加乳糖情 况下，它的合成需要3 个关键酶基因：( 1 ) s u s a ，编码s u c r o s es y n t h a s e ( e c 2 4 1 1 3 ) ； ( 2 ) g a l e ，编码u d p g a l a c t o s e4 - e p i m e r a s e ( e c5 1 3 2 ) ；( 3 ) 弛c ，编码 a l ，4 - g a l a c t o s y l t r a n s f e r a s e ( e c2 4 1 x ) 。在植物中，g l o b o t r i o s e 因缺少l g t c 酶和乳 糖而不能被合成。 姆c 基因，来自奈瑟氏脑膜炎球菌( n e i s s e r i am e n i n g i t i d i s ) ，该酶催化从 u d p g a l _ k 转移一个半乳糖残基到乳糖末端上。本工作以转留c 基因的甜菜植株 为材料，研究甜菜细胞糖组分的变化，探求姆c 基因对转基因植株代谢和生长发 育的影响。 为了准确测定转基因甜菜的可溶性总糖组成和含量，本工作利用薄层层析方 法分离和鉴定转基因植株的各种糖分，同时采用高效液相色谱分离和示差折光检 测器测定技术定量叶片提取液中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量，采用反向高效液相 色谱分离和光电二极管阵列检测器测定u d p 半乳糖的含量。 人的乳糖合成酶由二亚基组成，其调节亚基为乳清蛋白( 仅1 a c t a l b u m i n ) ，由 l a l b a 基因编码；催化亚基为p 一1 ，4 一g a l a c t o s y l t r a n s f e r a s e ( e c2 4 1 2 2 ) ，由g a l t l 基因编码，催化从u d p g a l 上转移一个半乳糖残基到葡萄糖末端上合成乳糖。本 工作拟以转留c 基因的甜菜丛生芽为受体将l a l b a 、g a l t 1 基因转入甜菜，探讨 利用转基因甜菜合成乳糖、g l o b o t r i o s e 的可行性。 转弛c 基因甜菜糖分的分析 首先用r t - p c r 方法筛选出姆c 基因高效表达的甜菜转基因株系，然后对这些 株系进行可溶性总糖、单糖和二糖以及核苷糖测定分析，结果显示转正义基因的 株系无论叶中还是块根中的可溶性总糖含量均较野生型株系显著提高，相应的葡 萄糖、果糖和蔗糖含量与野生型株系相比也均有不同程度的提高；转基因株系 u d p 半乳糖含量与对照相比显著降低( p o 0 5 ) ；而转反义基因株系的可溶性总 山东大学硕士学位论文 糖、u d p 糖以及其它糖分含量均与野生型植株无明显差异。 转基因植株生长发育观察和光合作用测定表明，向甜菜中转入来源于原核生 物的红c 基因未影响植株的生长发育和光合作用。 转乳糖合成酶基因甜菜的获得 从人的c d n a 文库( m a r a t h o n r e a d yc d n a ) b b 克隆得到乳糖合成酶基因 ( l a l b a 基因、g a l t 1 基因) ，构建双基因串联的植物表达载体并转化已有的 转姆c 基因甜菜丛生芽，获得聚合三个基因的甜菜植株。 建立起四个转印c 正义基因株系的离体丛生芽体系，经过继代培养发现，4 个株系l 1 、l 2 、l 3 、l 4 与w t 都有丛生芽发生，诱导时间相差不大，其中株系 l 2 不定芽的发生时间较早。培养6 周后，不同株系的诱导率均大于8 6 。随着 丛生芽块继代培养时间的延长，不同株系间出现差异。有的株系的单芽在继代培 养过程中增殖迅速，发生次生芽较多，而有些株系的单芽生长虽快但较少发生次 生芽。 选取研c 基因表达活性较高且次生芽增殖迅速的株系l 2 、l 4 的丛生芽，通 过农杆菌介导法将乳糖合成酶基因引入甜菜，经p c r 检测获得了聚合三个基因 ( l a l b a 、g a l - t 1 、t g t c ) 的甜菜植株。 本论文以弛c 基因和从人c d n a 文库中分离的乳糖合成酶基因为目标基因， 利用甜菜细胞为受体，获得了转入单个或数个目标基因的植株，同时研究了转基 因植株中糖代谢途径的改变对糖分积累、生长发育的影响，为探测甜菜细胞糖代 谢途径调控机制的研究提供了适宜的材料，同时为利用甜菜作为生物反应器生产 高附加值寡糖、特别是g l o b o t r i o s e 等奠定了基础。 关键词：t g t c ；乳糖合成酶；转基因甜菜；糖组分；g l o b o t r i o s e 2 山东大学硕士学位论文 a n a l y s i so fs o l u b l ec a r b o h y d r a t ec o m p o s i t i o ni nl g t ct r a n s g e n i c p l a n t sa n do b t a i n i n go ft r a n s g e n i cp l a n t sc o n t a i n i n gl a c t o s e s y n t h a s eg e n ei nb e t av u l g a r i sl a b s t r a c t g l o b o t r i o s ei sak i n do fo l i g o s a c c h a r i d e so f g r e a tv a l u e i nec o l i ，t h es y n t h e s i so f g l o b o t r i o s ef r o ma d d e dl a c t o s en e e d st h r e ek e ye n z y m eg e n e ：( 1 ) s u s a ，e n c o d i n g s u c r o s es y n t h a s e ( e c 2 4 1 13 ) ；( 2 ) g a l e , e n c o d i n gu d p g a l a c t o s e4 一e p i m e r a s e ( e c 5 1 3 2 ) ；( 3 ) 红c ，e n c o d i n gn - 1 ，4 一g a l a c t o s y l t r a n s f e r a s e ( e c2 4 1 x ) g l o b o t r i o s ec a l l n o tb es y n t h e s i z e di np l a n t s ，f o rt h el a c ko fb o t hl g t ce n z y m ea n dt h es u b s t r a t eo f l a c t o s e 姆cg e n e 。w h i c hc o m e sf r o mn e i s s e r i am e n i n g o c o c c u s ( n e i s s e r i am e n i n g i t i d i s ) ， c a t a l y z e st h et r a n s f e ro fag a l a c t o s er e s i d u ef r o mu d p g a lt ot h ee n do fl a c t o s e i n t h i ss t u d y , t h ev a r i a t i o no fc a r b o h y d r a t ec o m p o s i t i o nw a sa n a l y z e di nt r a n s g e n i cl i n e c o n t a i n i n gl g t c ，t oe x p l o r et h em e c h a n i s mo fe x p r e s s i o no fl g t co nm e t a b o l i s m ， g r o w t h ，a n dd e v e l o p m e n t o ft r a n s g e n i cp l a n t s i no r d e rt od e t e r m i n et h ec o n s t i t u e n ta n dc o n t e n to fs o l u b l ec a r b o h y d r a t e si nt h e l e a v e so ft r a n s g e n i cs u g a rb e e ta c c u r a t e l y , v a r i o u sc a r b o h y d r a t e si nt r a n s g e n i cp l a n t s w e r es e p a r a t e da n di d e n t i f i e db yt h i nl a y e rc h r o m o t o g r a p h y ( t l c ) m e a n w h i l e ，t h e c o n t e n to fs u c r o s e ，g l u c o s ea n df r u c t o s ew e r em e a s u r e dw i t hh p l c 剐 d ，a n dt h e c o n t e n to fu d p g a lw a sm e a s l l r e dw i t hr p - h p l c c o m b i n i n gw i t hp d a d l a c t o s es y n t h a s eh a st w os u b u n i t s ：w h e yp r o t e i n ( - l a c t a l b u m i n ) ，t h er e g u l a t o r y s u b u n i t ，e n c o d e db yg e n el a l b a ；a n d1 3 - 1 ，4 一g a l a c t o s y l t r a n s f e r a s e ( e c2 4 1 2 2 ) ，t h e c a t a l y t i cs u b u n i t , e n c o d e db yg a l - t 1g e n e ，w h i c hc a t a l y z e st h et r a n s f e ro fag a l a c t o s e r e s i d u ef r o mu d p - g a lt o t h ee n do fg l u c o s ef o rt h es y n t h e s i so fl a c t o s e t h eo b j e c t i v e o fm yw o r ki st ot r a n s f e rb o t hl 4 1 b aa n dg 口l t lg e n ei n t om u l t i p l eb u do fb e e t c o n t a i n i n gl g t ct oo b t a i nt r a n s g e n i cl i n e sw i t ha l lt h e s et r a n s g e n e sm e n t i o n e da b o v e ， t oe x p l o r et h ef e a s i b i l i t yo fu s i n gt r a n s g e n i cs u g a rb e e tt os y n t h e s i z el a c t o s ea n d 三l 山东大学硕士学位论文 g l o b o t r i o s e a n a l y s i so fc a r b o h y d r a t ec o m p o s i t i o no fl g t ct r a n s g e n i cb e e tp l a n t s i nt h i ss t u d y , t r a n s g e n i cl i n e st h a to v e r e x p r e s s e d t a r g e tg e n e ，c o n f i r m e db yr t - p c r ， w e r ec h o s e nf o rd e t e r m i n a t i o no fc a r b o h y d r a t ec o n t e n t ，i n c l u d i n gt o t a ls o l u b l e c a r b o h y d r a t e s ，m o n o s a c c h a r i d e s ，d i s a c c h a r i d e sa n dn u c l e o t i d es u g a r s t h er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tt h ec o n t e n t so ft o t a ls o l u b l ec a r b o h y d r a t e si ns e n s et r a n s g e n i cl i n e s w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fw t ，e i t h e ri nl e a v e so rr o o t s a c c o r d i n g l y ，t h e l e v e l so fg l u c o s e ，f r u c t o s ea n ds u c r o s ei nt h e s es e n s et r a n s g e n i cl i n e sw e r ea l l i n c r e a s e di nc o n s i d e r a b l ed e g r e e s t h ec o n t e n to fu d p g a li nt h es e n s et r a n s g e n i c l i n e sw e r ea l ls i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) l o w e rt h a nt h a to fw t h o w e v e r , t h ec o n t e n to f t o t a ls o l u b l ec a r b o h y d r a t e s ，a sw e l la sg l u c o s e ，f r u c t o s ea n ds u c r o s ei nt h ea n t i s e n s e l i n ew e r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tc o m p a r e dw i t hw t m o r e o v e r , t r a n s g e n i cl i n e ss h o w e dn o r m a lg r o w t ha n dp h o t o s y n t h e s i sc o m p a r e d w i t hw 互s u g g e s t i n gt h a tt r a n s f e r r i n gl g t cg e n ef r o mp r o k a r y o t e si n t os u g a rb e e td i d n o ta f f e c tt h eg r o w t ha n dp h o t o s y n t h e s i s o b t a i n i n gb e e tc o n t a i n i n gl a c t o s es y n t h a s eg e n e l a c t o s es y n t h a s eg e n e s ( b o t hl a l b aa n dg a l - t 1 ) w e r ec l o n e df r o mh u m a n e d n al i b r a r y ( m a r a t h o n r e a d yc d n a ) ，a n dr e c o m b i n e dt oap l a n te x p r e s s i o nv e c t o r a n dt r a n s f e r r e di n t os u g a rb e e tc o n t a i n i n gl g t c 。a n dt r a n s g e n i cl i n e sc o n t a i n i n g l a l b a ，g a l - t 1a n dl g t cw e r eo b t a i n e d f i r s t l ym u l t i p l eb u di n d u c t i o na n ds u b c u l t u r es y s t e mo ff o u rl g l ct r a n s g e n i cl i n e s a n dw tw e r ee s t a b l i s h e d o ft h ef o u rl i n e s ，l i n e2a n d4h a dh i g h e rl g t ce n z y m e a c t i v i t ya n dm o r ev i g o r o u sp r o l i f e r a t i o no fs e c o n d a r yb u d s l a l b aa n dg a l - t w e r e t r a n s f e r r e dt ob u d so fl i n e2a n d4b ya g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n p c r r e s u r ss u g g e s t e dt h a tp l a n t sp y r a m i d i n gl a l b a ，g a i - t 1 ，a n dl g t cw e r eo b t a i n e d ot h e t r a n s g e n e s e x p r e s s i o na n dt h es o l u b l ec a r b o h y d r a t ec o m p o s i t i o ni nt h et r a n s g e n i c p l a n t sw e r et ob ed e t e r m i n e d 4 山东大学硕士学位论文 i nt h i s s t u d y ，t r a n s g e n i cl i n e sc o n t a i n i n gt g t cg e n ea n da n dt r a n s g e n i cp l a n t s p y r a m i d i n gl g t ca n dl a c t o s es y n t h a s eg e n ef r o me d n al i b r a r yw e r ep r o d u c e da n dt h e c h a n g eo fs o l u b l ec a r b o h y d r a t ec o m p o s i t i o ni nt r a n s g e n i cp l a n t sa n dt h ei m p a c to f g e n e t i cm o d i f i c a t i o no fc a r b o h y d r a t em e t a b o l i c p a t h w a y s o n c a r b o h y d r a t e a c c u m u l a t i o na n dg r o w t h ，d e v e l o p m e n to ft r a n s g e n i cp l a n t sw e r ea l s os t u d i e d t h e p r e l i m i n a r yr e s e a r c hp r o v i d e ds o m ep r o d u c t i v ea n du s e f u ll i n e sf o rf l l r t h e rs t u d yo n t h ec o n t r o l l i n gm e c h a n i s mo fc a r b o h y d r a t em e t a b o l i s mi ns u g a rb e e tc e l l s ，a n ds h e d l i g h to nt h ei n s i g h ti n t ot h eu s eo fe n g i n e e r e ds u g a rb e e tf i t sab i o r e a c t o rf o rp r o d u c t i o n o fo l i g o s a c c h a r i d e so fh i g hv a l u e ，s u c ha sg l o b o t r i o s e k e yw o r d s ：l g t c ；l a c t o s es y n t h a s e ；t r a n s g e n i cs u g a rb e e t ；c a r b o h y d r a t ec o m p o s i t i o n ： g l o b o t r i o s e 5 山东大学硕士学位论文 符号说明 6 c a m vc a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s ，花椰菜花叶病毒 c d n a c t a b d e p c e d t a e s t f r u g a l g l c h p l c p c r i r r - p c r s u c t l c i r i s u d p g a i u d p g l c u d p s u g a r c o m p l e m e n t a r yd n a ，互补d n a c e t y l t r i e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ，十六烷基三甲基溴化铵 d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ，焦碳酸二乙酯 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ，乙二胺四乙酸 e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，表达序列标签 f r u c t o s e ，果糖 g a l a c t o s e ，半乳糖 g l u c o s e ，葡萄糖 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，高效液相色谱 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 r e t e n t i o nt i m e ，保留时间 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r ，反转录p c r s u c r o s e ，蔗糖 t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，薄层层析 t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n om e t h a n e ，三羟甲基氨基甲烷 u d p g a l a c t o s e ，u d p 一半乳糖 u d p g l u c o s e ，u d p 葡萄糖 u r i d i n ed i p h o s p h a t es u g a r ，尿苷二磷酸糖 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：丝：翠： 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：毯：盈= 导师签名：论文作者签名：燃：丝= 导师签名： 期： 山东大学硕士学位论文， 第一部分前言 1 1 植物生物反应器研究进展 随着分子生物学的飞速发展，植物遗传转化技术日趋完善，植物基因工程取 得了令人瞩目的成就。目前，利用转基因植物作为生物反应器已成为转基因植物 研究的重要领域之一。 研究表明植物可以作为生物反应器大模生产具有高附加值的医用蛋白、疫 苗、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类以及其它一些有益的 次生代谢产物。目前，已用于生物反应器的植物有烟草、拟南芥、大豆、小麦、 水稻、玉米、油菜、马铃薯、西红柿等【。利用转基因植物作为生物反应器正成 为基因工程领域中研究最活跃、产业发展最迅速、效益最显著的热点之一。 1 1 1 植物生物反应器的优点 与微生物和动物生物反应器相比，植物生物反应器具有不可替代的优越性。 1 生产成本较低，易于大规模工业生产。植物能进行光合作用，仅需要来自土 壤的矿物质和水分便可在适宜的条件下获得大量人们所需的转基因产物。2 植 物细胞具有全能性，易于获得再生植株，遗传操作相对简单，培养周期较短。3 转基因植物通过自交得到的后代遗传性状稳定，从而可以在植物体内积累多基因 【2 】。4 产物贮藏在种子、果实和块茎中便于贮运，其中那些能直接食用的植物疫 苗不需特殊贮存条件【3 ，4 捌。5 无毒副作用，安全性好。细菌作为生物反应器时， 不能对真核生物的蛋白进行有效的翻译后加工，而且本身可能是人类病原物。动 物作为生物反应器时，在细胞培养过程中可能感染上动物病毒而对人类健康造成 潜在危害【6 1 。植物作为生物反应器被认为是相对安全的，因为植物体只表达病原 菌的部分免疫蛋白，不含致病微生物或潜在的致病微生物，对人蓄安全，大大提 高了表达产物的生物安全性川。6 植物中的蛋白加工途径相对保守，表达产物能 进行正确的糖基化、磷酸化、酰胺化及翻译后加工过程，因此表达产物具有与高 等动物细胞一样的免疫原性和生物活性嗍。 7 山东大学硕士学位论文 1 1 2 植物反应器生产碳水化合物 通常植物通过光合作用在叶中合成糖类物质，再从叶中转移到根、茎等贮存 器官中。植物中糖类的主要贮存形式是淀粉。人们可以设法改变植物的代谢途径、 通过转入外源基因改变植物的糖类物质的组成、含量，从而提高其商业价值，甚 至产生新的碳水化合物，从而使植物成为寡糖生产的生物反应器，以用于医药或 食品工业。 近年来，已有研究证明可以通过改变碳水化合物的代谢途径从而改变植物体 内碳水化合物含量及品质。 v a nd e rm e e r 等将枯草杆菌果糖基转移酶( f r u c t o s y l t r a n s f e r a s e ) 基因转入烟 草和马铃薯后，可以在这两种基本不含果聚糖的植物中贮存果聚糖，且含量不低。 在转基因烟草中获得的果聚糖可达植物干重的3 8 ，转基因马铃薯叶中果聚 糖含量达到了叶片干重的1 3 ，在块茎可达到1 7 0 t 9 1 。t a w t a b e r r y 等将来 源于大肠杆菌的编码甘露醇1 一磷酸脱氢酶的基因转入烟草后，转基因植株中的 甘露醇含量增加，并且转基因植株的耐盐、耐旱能力也大大提高【1 0 1 。 近年来，海藻糖因作为一种食品添加剂能提高食品的鲜味，成为科学家研究 的热点。目前主要是从酵母中提取，成本很高，难以广泛使用。荷兰植物生物技 术公司将大肠杆菌的海藻糖合酶基因导入甜菜、马铃薯中，在获得大量廉价海藻 糖的同时，增强了植株的抗旱性和耐寒性，还可使植株收获后仍较长时间保持新 鲜风味及营养成分【i ! , 1 2 】。我国张树珍等从担子菌灰树花( g r i f o l a f r o n d o s a ) 中克 隆海藻糖合酶基因，由双拷贝c a m v 3 5 s 启动子驱动海藻糖合酶基因构建植物表 达载体p b b b t ，通过三亲交配法将p b b b t 导入根癌农杆菌e h a l 0 5 菌株，经根 癌农杆菌介导转化甘蔗( s a c c h ar u m h y b r i d ) 栽培品种，转基因植株抗渗透胁迫 能力增强【l l 13 1 。2 0 0 3 年，i n c h e o lj a n g 等在转基因水稻中表达了e c o l i 中编码 6 磷酸海藻糖合成酶和6 磷酸海藻糖磷酸酶的基因，增加了海藻糖的积累【1 4 】。 植物贮藏器官的淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，直链淀粉和支链淀粉的比 例决定淀粉的品质与用途。淀粉合成酶分为两类：颗粒结合淀粉合成酶和可溶性 淀粉合成酶。颗粒结合淀粉合成酶是合成直链淀粉的关键酶。把编码颗粒结合淀 粉合成酶的反义基因导入马铃薯中，可产生不含或只含少量直链淀粉的淀粉。这 8 山东大学硕士学位论文 种淀粉适用于食品业和造纸业。而把大肠杆菌糖元合酶( g l c o g a ns y n t h a s e ) 基因 引入马铃薯使之于块茎中特异表达，则可产生支链淀粉含量高的薯块【1 5 1 。a d p 葡糖焦磷酸化酶( a d pg l u c o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e ，a g p a s e ) 是淀粉合成途径的 关键酶，通过增加植物中a g p a s e 的含量可能增加淀粉量，用基因工程方法可达 到这一目的。h a g 等从大肠杆菌k 1 2 的突变株系中分离出对调节因子异常不敏 感的a d p 葡糖焦磷酸化酶基因同源四聚体a g p a s e 基因- g l g c l 6 ，以g l g c l 6 连接 质体转运肽基因和马铃薯块茎特异性表达的启动子后，转化马铃薯，转基因植株 块茎中的淀粉含量比对照平均提高了3 5 ，有些株系的块茎淀粉含量甚至高出 6 0 之多【1 6 1 ，并通过向马铃薯转入环糊精转葡糖基转移酶( c y c l o d e x t r i n g l u c o s y l t r a n s f e r a s e ，c g t ) 基因可在马铃薯中合成环化糊精。 2 , 6 二磷酸果糖是植物体内调节代谢流在蔗糖和淀粉合成之间分配的重要分 子，它的水平取决于6 磷酸果糖2 激酶和2 , 6 二磷酸果糖酯酶的相对活性。s c o t t 等将一种经修饰的鼠肝的6 一磷酸果糖2 一激酶基因导入烟草中，转基因植株中6 二 磷酸果糖2 激酶活力提高，导致了光合作用暗反应末期的2 , 6 二磷酸果糖水平提 高了2 3 倍。分析表明，2 , 6 二磷酸果糖在光合作用中抑制了合成蔗糖的代谢流芦 促进了合成淀粉的代谢流量。 已有许多研究报道植物中几乎不含有游离的与蛋白结合的n 乙酰神经氨酸 ( n e u 5 a c ) ，这对于利用植物作为生物制药表达系统是一个极大的缺点，因为末 端带有n e u 5 a c 的n 多糖对于人重组药用糖蛋白的生物活性和半衰期非常重要。 a l e x a n d r a 向拟南芥转入哺乳动物n e u 5 a c 生物合成途径中的3 个关键酶：u d p - n 乙酰葡萄糖氨2 一差向异构酶n 乙酰甘露糖激酶，n 乙酰神经氨酸磷酸合酶和 c m p - n 乙酰神经氨酸合成酶，发现u d p n 乙酰葡萄糖氨2 一差向异构酶n 一乙酰 甘露糖激酶，n 一乙酰神经氨酸磷酸合酶的共表达导致植物中n e u 5 a c 的量明显增 加，通过共表达c m p n 乙酰神经氨酸合成酶使得n e u 5 a c 能够进一步转变为 c m p - n e u 5 a c 1 刀。这些发现对于在植物中生产n e u 5 a c 的糖蛋白有很大帮助。 1 1 3 植物反应器生产药物蛋白 进入临床前和临床诊断阶段的以蛋白质为基础的治疗药物的数量正呈现蓬 勃发展的势头，并且在未来几年会大量增长。在过去的二十年里，在不同的物种 9 山东大学硕士学位论文 中已生产出超过1 0 0 种的重组蛋白。转基因植物被认为是生产人药物蛋白的最有 前途的系统之一【1 8 】。转基因植物药物的开发研究始于2 0 世纪9 0 年代初，目前 已经获得了可以表达多种外源蛋白的转基因植物。原则上说，这些转基因植物均 是新型的生物反应器，利用它们生产出的药物就称为转基因植物药物，而不管该 转基因植物是否是药用植物 1 9 】。 抗体与抗原结合作用已广泛应用于生物学和医学领域，许多不能天然产生抗 体的宿主生物( 包括植物) 正在发展用来生产抗体。植物产生多种重组抗体，又 称植物抗体( p l a n t i b o d i e s ) ，包括具有抗原结合活性的抗体小片段到大的多聚抗 体复合物。h i a t t 等1 9 8 9 年从小鼠中克隆i g g 的重链和轻链基因导入烟草，有性 杂交得到f l 抗体，即成功组装的功能性抗体，就此开创了植物抗体的先河【2 0 】。 h u l l 等【2 1 】在烟草中表达了炭疽杆菌保护抗原特异性单克隆抗体，在活体内外均表 现出毒素中和活性，这项研究表明用植物生产炭疽杆菌单克隆抗体可以成功地用 于预防。x u 等【2 2 】克隆鼠单克隆抗体s 1 9 的轻链及重链基因，构建了其可变区嵌 合基因，在转基因烟草中成功表达了抗精子微型抗体s c f v l 9 。 转基因植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合，生产出能使 机体获得特异抗病能力的疫苗。转基因植物疫苗有两个研究方向：一种是利用植 物生产大量的蛋白质抗原，经分离和提纯再制各成疫苗；另一种是不需要分离和 提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。经动物实验证明，分离提纯 后的植物抗原蛋白仍具有免疫活性，注入动物体后能产生特异性抗体，植物口服 疫苗也能够在肠道引起粘膜和体液免疫反应。与注射疫苗相比，可食疫苗具有成 本低、便于运输储存及使用方便等优点，因此成为基因工程疫苗的研究热点。 s h c h e l k u n o v 等【2 3 】首次研究了一种能同时抗两种病毒的疫苗，将编码艾滋病 病毒中致免疫的e n v 、g a c 抗原表位及乙肝表面抗原的嵌合基因导入番茄并得 以表达。l i 等【2 4 】将霍乱毒素b 亚基c t b 基因融合到糖尿病自身抗原基因中，用 来转化低烟碱烟草，对产物进行功能性分析后发现该融合蛋白具有与天然c t b 一样的生物活性及免疫活性包括g m i 神经节苷酯受体结合能力，表明c t b 3 i n s b 3 融合蛋白可通过诱导口服免疫耐受能力来预防和治疗自身免疫糖尿病。 f i t c h e n 等嘲首次将小鼠z p 3 蛋白( 受精过程中充当精子受体) 的一个含1 3 个 1 0 山东大学硕士学位论文 氨基酸残基的抗原决定簇表达在烟草花叶病毒的衣壳蛋白中，用感染植物中提取 的含融合蛋白的病毒样颗粒免疫小鼠，结果产生了抗z p 3 的特异性血清抗体。 利用转基因植物还可以表达细胞因子、酶及其他药用蛋白和生物活性肽，这 一领域在近十年来发展迅速。水蛭素作为一种最强的凝血酶天然抑制剂，在油菜 种子油脂体中成功表达，是第一个投入商业生产的范例。c r a m e r 等利用转基因 烟草生产葡糖脑苷脂酶，该酶可以用来治疗高歇氏病( 一种隐性遗传的溶酶体储 积病，由于溶酶体水解酶中缺乏葡糖脑苷脂酶而导致的) ，此项技术已经被注册 了专利2 6 】，他们的研究证实了未来利用转基因植物生产葡糖脑苷脂酶的商业价 值。r u g g i e r o 等在烟草表达系统中表达了人类胶原蛋白，表达的胶原蛋白单链能 够在植物体内以二硫键结合成三聚体，形成稳定的三聚体螺旋结构【2 7 】。到目前 为止，人们已经成功地在植物中表达的蛋白还有人干扰素( i n f ) 2 s 】、肌醇六磷 酸酶 2 9 1 、促红细胞生成素( e p o ) 【3 0 1 、人表皮生长因子( e g f ) 3 1 】、抗生物素 蛋白【3 2 1 、3 - 葡萄苷酸酶( g u s ) 1 3 3 等。 1 1 4 植物反应器生产贮藏蛋白 人类和畜类的饮食中所需八种必需氨基酸通常来源于植物，在植物中提高贮 藏蛋白营养价值的最直接方法是增加或改变植物生产贮藏蛋白的途径。 a l t e n b a w t 等构建了一个巴西豆( b r a z i ln u t ) 2 s 清蛋白的种子特异性表达 载体，将其转入烟草后，转基因烟草的种子中2 s 清蛋白含量占总蛋白的8 ， 从而使甲硫氨酸的含量提高3 0 【3 4 1 。另一种方法是利用定点突变技术修饰植物 储存器官中高含量的蛋白，提高其含硫氨基酸的比例。确e m t r u p 等利用此法修饰 了植物凝血素蛋白基因，导入烟草后，经修饰的基因产物可进行正确的后加工， 并大幅度提高了植物中蛋氨酸的含量【3 5 1 。 在高等植物中赖氨酸是以天冬氨酸为起始底物合成的，该途径的限速酶是天 冬氨酸激酶( a k ) 和二氢吡啶羧酸合成酶( d h p s ) 。赖氨酸是a k 和d h p s 的 反馈调节因子。在细菌中赖氨酸的合成途径与植物非常相似，但是d h p s 对赖氨 酸的反馈调节不敏感。利用此特点，向植物导入连接有质体导肽的细菌d h p s 基 因可使转基因植物叶片中赖氨酸含量明显提高。f a l c o 等把棒状杆菌( c o r y n e b e c t e r i u m ) d a p a 基因( 编码d h p s ) 和大肠杆菌突变的l y s c 基因( 编码a k l ， 1 l 山东大学硕士学位论文 也对赖氨酸的反馈抑制不敏感) 分别与叶绿体导肽和种子特异性启动子连接，然 后转入油菜和大豆，在转基因植株种子中与对照相比赖氨酸含量积累增加了1 4 倍【3 6 1 。 1 1 5 植物生物反应器生产脂类物质 脂肪酸链长度和不饱和度直接影响着油脂的品质。因此，可以通过调节脂肪 酸代谢途径控制脂肪酸的不饱和度和链长度，使之品质适合于各种工业和食品加 工业。 由于大多数植物种子的天然饱和脂肪酸产量低，因此一般依赖化学方法对植 物油脂氢化后获得饱和脂肪酸。1 9 9 2 年c a l g e n e 公司把种子特异性启动子控制的 硬脂酸去饱和酶反义基因导入油菜以抑制种子发育阶段的油菜籽中硬脂酸a c p 去饱和酶活性，导致转基因油菜籽中硬脂酸的含量从2 跃升到4 0 3 7 1 。这是利 用基因工程手段调节脂类代谢的首例成功报导。 提高单不饱和脂肪酸的含量可以增加油脂的稳定性，改善口感，提高营养价 值。把大豆中的a 6 去饱和酶基因反向导入大豆中，则可得到几乎不含多不饱和 脂肪酸的脂肪酸 3 8 1 。这种油脂和c a l g e n e 公司反义抑制内源的a 9 去饱和酶基因 所产生的油脂同为反式脂肪酸，是一种健康的油脂成分。 丫一亚麻酸是对人类和动物非常有益的一种多不饱和脂肪酸。然而油料作物普 遍不含此类物质。只有极少数植物如月见草、紫草、虎耳草等植物中含有丫亚麻 酸。把蓝藻中的6 去饱和酶基因导入烟草中，可导致丫亚麻酸在转基因烟草叶 片中的积累【3 9 1 。 聚羟基丁酸脂( p h b ，p o l y _ b - h y d r o x y b u t y r a t e ) 是应用最广泛和研究得最清 楚的一种聚羟基链烷酸。目前，p h b 的生产主要靠微生物发酵，由于发酵设备 原料昂贵，价格很难与石油产品竞争。美国科学家们利用几个关键基因( p h b a 、 肋b b 、p h b c 基因) 在拟南芥中表达合成了一定含量的p h b ( 0 1 4 ) 。通过植物 细胞悬浮培养，获得足够量的p h b ，分析表明与细菌p h b 的化学结构相同。1 9 9 4 年，j o h n 等人将特异性启动子控制的p h b b 和c a m v 3 5 s 启动子控制的p h b c 的 双基因载体通过基因枪导入棉花中，在转基因棉花的细胞壁内纤维腔中有p h b 1 2 山东大学硕士学位论文 的积累，导致棉花纤维的导热率降低，提高了棉花的品质【柏】。 1 1 6 植物生物反应器生产次生代谢物 植物多种多样的代谢途径产生了丰富的次生代谢产物，其中许多具有药用价 值。如有祛痰止咳作用的地奥素( d i o s e i n ) 、有降压作用的药根碱( j a t r o r h i z i n e ) 等。遗憾的是这些次生代谢产物往往在植物中的合成量极少，因此提取费用昂贵， 限制了它们的用途。提高次生代谢产物的有效方法是把编码限速酶或具有调节功 能酶的基因导入植物中。y u n 等人把一种生物碱一莨菪胺( s c o p o l a m i n e ，一种 重要的抗胆碱药物) 生物合成的关键酶一莨菪胺6 b 一羟化酶( h y o s c y a m i n e 6 b - h y d r o x y l a s e ) 基因导入具丰富底物一天仙子胺的颠茄( a t r o p ab e l l a d o n n a ) 中， 转基因