（细胞生物学专业论文）基于中心重合引物的pcr诱变技术新进展.pdf

摘要 摘要 基于p c r 的体外诱变法发展至今，使用的引物从重组p c r 法 ( r e c o m b i n a t i o np c r ) 的至少4 条引物到大引物p c r 法( m e g a p r i m e ri c r ) 的3 条引 物，再到q u i k c h a n g e 快速突变法( q u i k c h a n g em u t a g e n e s i sp c r ) 的2 条引物。从 至少3 轮p c r 反应发展到只需2 轮，到q u i k c h a n g e 法及反向p c r 法( i n v e r s ep c r ) 的仅使用一轮p c r 反应，步骤越来越简单，操作越来越简便，为使用p c r 技术 进行各种基因克隆操作的科学工作者节省了大量的时间和精力。 近几年，有文献报道使用基于q u i k c h a n g e 原理的方法来制作d n a 片段的 插入、替代以及删除突变，但由于q c m p c r 的低产量，难以产生阳性克隆。而 采用末端相对的( t a i l t o t a i l ) 引物设计方法的反向p c r 则需要用连接酶连接p c r 扩增产物，操作麻烦且阳性率也偏低。 我们实验室一直在寻找一种简单高效的可以用于基因的删除、插入及替代突 变的方法，通过大量研究和实验发现，可以使用一种基于反向p c r 原理，使用 全新的引物设计的突变方法一c o p ”突变法，该方法采用与q u i k c h a n g e 点突 变法相同的操作步骤，其策略是设计一对中心重合( c e n t r a lo v e r l a p ) 的引物， 长引物的5 端序列和3 端序列的t m 值均不低于6 6 0 c ，短引物t m 值约为长引 物一半，且与长引物中心重合互补。这种方法能用于超过2 0 b p 的碱基的插入或 替代突变，及用于超过2 0 0 0 b pd n a 片段的删除突变的研究。 这种方法引物设计极为简单，能快速构建突变质粒，可以用于多点突变，删 除，替代，插入等多种基因克隆操作，有8 5 以上的阳性产率。 关键词：q u i k c h a n g e ；p c r ；中心重合引物； v i a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fp c r - b a s e d m u t a g e n e s i si nv i t r o ，t h en u m b e ro fp r i m e r v a r i e df r o ma tl e a s t4p r i m e r so fr e c o m b i n a t i o np c rt o3p r i m e r so fm e g a p r i m e r p c r w h e ni tc o m e st oq u i k c h a n g em u t a g e n e s i sp c r , t h e r ea r eo n l y2p r i m e r si n u s e i ti si m p r o v e df r o m3r o u n d so fp c rt oo n l yo n er o u n di nq u i k c h a n g ep c ra n d i n v e r s ep c r t h eg r e a ta d v a n c e si np c r t e c h n o l o g yh a v es a v e dal o to ft i m ea n d e n e r g yf o rs c i e n t i s t s r e c e n t l y , i ti sr e p o r t e dt h a td n af r a g m e n t so fi n s e r t i o n ，s u b s t i t u t i o na n d d e l e t i o nm u t a t i o na r eg e n e r a t e d a c c o r d i n gt om e t h o d sb a s e do nq c m p c r h o w e v e r , i ti sd i f f i c u l tt oy i e l dp o s i t i v ec l o n e sb e c a u s eo fl o wo u t p u te f f i c i e n c y o nt h eo t h e r h a n d ，t h ei n v e r s ep c rc o m b i n e dw i t hat a i l - t o t a i lp r i m e rd e s i g nr e q u i r e st 4d n a l i g a s ee n z y m et ol i g a t ep c rp r o d u c t s ，w h i c hm a k e st h ep o s i t i v er a t er e l a t i v e l yl o w w ea i mt of i n do u ta ne a s ya n de f f e c t i v em e t h o dt op e r f o r mg e n ed e l e t i o n ， i n s e r t i o na n ds u b s t i t u t i o nm u t a t i o n o nt h eb a s eo fn u m e r o u sr e s e a r c ha n d e x p e r i m e n t s ，an e wm u t a g e n e s i sm e t h o di si n i t i a t e d ，w h i c hu s e sap a i ro fc e n t r a l o v e r l a pp r i m e r s ( c o p ) g r o u n do nt h ep r i n c i p l eo fi n v e r s ep c r t h em e t h o di sj u s t l i k et h eq u i k c h a n g es i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sm e t h o de x c e p tf o ri t s s p e c i a lp r i m e r t h i sp a i ro f p r i m e r si sc o m p o s e do fal o n gp r i m e ra n das h o r tp r i m e rw h i c hi sc e n t r a l o v e r l a p p e d b o t ho ft h et mo f5 s e q u e n c ei nl o n gp r i m e ra n dt mo f3 s e q u e n c ei n s h o r tp r i m e ra r ea b o v e6 6 0 c t h et mo fs h o r tp r i m e ri sa l m o s th a l fo ft h a to fl o n g p r i m e r i ti s c o n v e n i e n tt op e r f o r mi n s e r t i o no rs u b s t i t u t i o nm u t a t i o no fd n a f r a g m e n t sl a r g e rt h a n2 0 b p ，i na d d i t i o n ，i ti sh i g h l ya p p l i c a b l ei nr e s e a r c ha b o u tt h e d e l e t i o nm u t a t i o no fd n a f r a g m e n t sl a r g e rt h a n2 0 0 0 b p t h i sm e t h o do fp r i m e rd e s i g nc a nb eu s e dt oc o n s t r u c tm u t a n tp l a s m i d sw i t h g r e a t e a s ea n ds p e e d i ta p p l i e st ov a r i o u sg e n e c l o n i n gt e c h n i q u e s ，s u c ha s m u l t i p l e p o i n tm u t a t i o n ，d e l e t i o n ，r e p l a c e m e n t ，i n s e r t i o n ，g e n e r a t i n gp o s i t i v er a t e so f h i g h e rt h a n8 5 k e y w o r d ：q u i k c h a n g e ；p c r ；c o p ； v 英文缩略语对照表 英文缩略语对照表 a b b r e v i a t i o n f u l ln a m e c d k c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e c o pc e n t r a lo v e r l a pp r i m e r h i v 1h u m a n i m m u n o d e f i c i e n c yv i r u st y p e1 1 p c ri n v e r s ep c r l t r l o n gt e r m i n a lr e p e a t s n t dn - t e r m i n a ld o m a i n p o pp a r t i a lo v e r l a pp r i m e r p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n q c m q u i k c h a n g em u t a g e n e s i s s o e p c r s p li c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o np c r v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成果。本人 在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适当 方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为( 多年轩羞孑匦泺瑞1 舔罐 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 匦聚啦荔复) 课题( 组) 经费或实验室的资助， 在( 够咖卫绝。f ) 实验室完成。( 请在以上括号内填写课题或课题组 负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声明。) 声明人( 签名) ：污蛹 川年7 月矽e t 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办法等 规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文( 包 括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查 阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共 建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、 缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于 年月日解密，解密后适用上述授权。 ， ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“或填上相应内容。保密学位论文应是 已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审 定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论 文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ：同确 衅年7 月矽e t i 前言 1 前言 对于任何一种遗传学研究，尤其是有关基因结构与功能的分析，突变都是最 基本的手段。经典的方法是，应用能够修饰d n a 分子的化学诱变剂或者物理诱 变剂处理生物体，此类诱变方法虽然已经得到了广泛的应用，能获得大量的突变 体，但亦存在诸多不便之处。 第一，经受诱变剂处理的生物体，他的任何基因都有可能发生突变，而目的基因 的突变频率又可能相当低，因此给突变体的筛选工作造成了很大的麻烦。 第二，即便分离到了具有期望表型的突变体，人们也无法保证所出现的突变确实 就是发生在目的的基因上。 第三，在基因克隆和核苷酸技术发展之前，我们既无法知道究竟在基因的什么部 位发生了突变，也无法弄清这种突变到底是因单碱基取代抑或是由于 d n a 片段的插入或者缺失所致。 随着分子生物学方法的进步，特别是基因克隆技术的应用，分离并研究单基 因的结构和功能已经成为一种常规的工作。与此相适应，基因的体外突变技术也 有了很大的发展。现在，人们不仅能够对多细胞或者有机体做诱变处理，并从成 千上万突变群体中筛选出期望的突变体，而且还能够取代、插入或者缺失克隆基 因或d n a 序列中的任何一个特定的碱基，这种体外特异性改变某个碱基的技术， 叫定点诱变( s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ) 。由于它具有简单易行、重复性高等优 点，现已发展成为基因操作的种基本技术。通过定点诱变除了可以研究基因表 达以及蛋白质的结构与功能之间的关系，还能够通过使特异的氨基酸改变来获得 突变蛋白质，即所谓的蛋白质工程。此类蛋白突变体的产生则有助于研究蛋白的 功能及蛋白间的相互作用。目前己发展的定点诱变方法主要有盒式诱变、寡聚核 苷酸引物诱变及p c r 诱变。 其中p c r 诱变是我们要讨论的重点，通过p c r 技术的快速发展和实验条件的 优化，p c r 诱变法已经不仅仅能制备单点诱变，更能用于目的基因的多点突变 及基因片段的删除、插入及替代研究。p c r 诱变常用的方法通常有以下几种：重 组诱变法，大引物诱变法，q u i k c h a n g e 快速突变法及反向p c r 法。 l 前言 1 1 重组p c r 诱变法 早在m u l l i sk 等1 9 8 6 年创建p c r 技术以来，科学工作者就已经意识到它同 样具备着应用于基因诱变的潜力。因为从原则上讲，p c r 扩增引物与模板d n a 之间错配的单碱基，经过扩增之后会掺入模板序列中去，最终产生出带有突变的 双链d n a 分子。【l 】这为d n a 重组和定点突变( s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ) 提供 了一种简便快速的手段，这是因为引物通过p c r 要整合到p c r 产物中去，因此 可通过人为的改变引物来对扩增产物进行修饰。这种基于用p c r 来完成的定点 突变或d n a 重组的方法叫重组p c r ( r e c o m b i n a t i o np c r ) 。 重组p c r 的产物在大肠杆菌体内完成重组，生成突变株或重组子【2 1 。在这 种技术中，通过p c r 往两个不同的d n a 分子末端加上一段同源序列，这段同源 序列可介导两个不同的线性p c r 产物在大肠杆菌中重组，形成一个环形的d n a 融合分子。如果环形分子是构建在可选择质粒上的，就可用它来转化大肠杆菌， 再从转化菌中挑选出突变株或者重组子。自从1 9 9 1 年这种方法被采用以来，已 被许多研究者所使用【3 4 ，5 1 。 1 1 1 用重组p c r 做定点突变。 图1 1 说明了该方法的基本原理及其过程。方法只涉及p c r 技术及转化技 术。在引物1 ，3 中引入突变位点，在第一套p c r 反应中，用引物1 、2 从模板 质粒上扩增出带有突变点的片段。在第二套p c r 反应中，用引物3 、4 来扩增模 板质粒，并同样引入突变点。两套p c r 产物两端均需包含2 4 个碱基或以上的同 源序列，将两套p c r 产物混合在一起，直接转化感受态细胞，通过菌体内的同 源重组，可生成环形的突变质粒。 在p c r 反应之前，应选用某种限制性内切酶来消化质粒d n a ，使其线性化。 这样转化时就不必要对p c r 产物进行纯化，因为线性化质粒不能有效的转化大 肠杆菌。如果质粒在扩增前没有用内切酶消化，没有线性化的质粒就会产生很高 的背景菌落。若需要对扩增产物进行纯化，可采用琼脂糖凝胶分离p c r 产物， 再用胶回收试剂盒来完成纯化。也可通过向p c r 扩增产物中加入限制性内切酶 d p n i ，这个酶的识别序列是甲基化的g a t c 。该位点在质粒中已被大肠杆菌甲基 化，而在p c r 产物中却未被甲基化。故用d p n i 消化就可切开质粒而不切断p c r 产物【7 l 。 2 1 前言 酶切位点 嬲燃j 用引物1 勉做p c rl 酶切位点b 膨燃 图1 - 1 ：用重组p c r 做定点突变的模式卧6 】 f i g u r e1 1 ：g e n e r a t ep o i n tm u t a t i o nb yr e c o m b i n a t i o np c r 将两个p c r 管的扩增产物加到一起，再用以转化感受态大肠杆菌，就可挑选 到突变株。这种线性分子的转化效率是很低的，故必须使用超敏的感受态细胞做 受体菌( 转化效率 1 0 8 u g 质粒d n a ) 。在条件掌握很好的情况下，l n g 的d n a 转化出来的突变菌落大约有l o 个左右。 该种点突变方法需要用限制性内切酶使质粒d n a 线性化，经两次p c r 扩增模 板质粒，再通过转化大肠杆菌得到突变的重组质粒，由于突变率较低，且转化效 率也不高，现在已经很少有人用p c r 重组法来制备点突变。 1 1 2 重叠延伸p c r 技术 重叠延伸p c r ( s p l i c i n gb yo v e r l a pe x t e n s i o np c r ，简称s o ep c r ) 技术是一种 在体外完成的d n a 重组和突变技术，该技术是通过重叠延伸来完成的d n a 剪 切。【8 1 由于采用具有互补末端的引物，使p c r 产物形成了重叠链，从而在随后的扩 增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来此技术利用 3 p c r 技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理， 我们可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难咀获得的产 物重叠延伸p c r 技术成功的关键是重叠互补引物的设计重叠延伸p c r 在基因 的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩 增等方面有其广泛而独特的应用。 i 口 ，7 f l a n k i n gs e q u e n c e s f 1 p r i m e rd e s i g n 。曼l 旦0j l r l r s ta m p 嘶。d i l i竺竺竺! ! 旦一 p r i m erf 2 + r 2 r 2 s e c o n d8 p l i f i c a t i o 哒 = = = = = = 啊= = = = = = = 图1 2 ：重叠延伸p c r 做基因删除的示意图1 8 i f i g u r e1 - 2 ：d e l e t i o nm u t a g e n e s i sb ys o e p c r 图1 2 为使用重叠延伸p c r 对基因进行删除突变的研究，以此来说明重叠 延伸p c r 的原理及引物的设计： 起始端基因： 上游( f i ) 与基因开放阅读框起始密码子附近的序列相对应：下游( r i ) 与欲删除的片段之前的序列及之后的序列互补。 终止端基因： 上游( f 2 ) 与欲删除序列之前及之后的序列互补，下游( r 2 ) 与基因的开 放阅读框终止密码于序列互补。 l 前言 引物r l 的5 端有一段附加序列并非以起始端基因为模板，而来自于终止端 基因，与引物f 2 的5 一端同源，通过p c r 扩增，这段附加序列被加在了起始端 基因的扩增产物上( p r i m e rf i + r 1 ) ，同样通过p c r 得到终止端基因的扩增产 物( p r i m e rf 2 + i 匕) ，这样起始端产物和终止端产物就有了一段重叠序列。将两 次p c r 的产物加在一起，然后再用f 1 和r 2 将两基因连接起来，得到融合基因。 重叠部分的长度从1 2 个碱基【9 1 到1 6 4 个碱基都有入报道。但是使其重叠部分 t m 值为5 0 0 c 左右来确定重叠部分的长度，可能是比较明智的选择。 重叠延伸p c r 作为一个有效的方法被越来越广泛得使用，该方法有以下优 点：重组和突变可同时完成【l l 】。突变率较高【1 2 】。产物分子是在体外产生 的，不需要做培养细菌、提取质粒等操作便可直接用于后续实验。但是运用该方 法构建一个突变株至少需要3 次p c r 反应和4 条寡聚核苷酸引物，且p c r 的中 间产物及终产物均需纯化，比较耗时耗工，且通过p c r 可能带来随机突变。近 年来发展的大引物法仅需三条引物，在某些实验的应用中，相比重叠延伸p c r 来说，更为简便【1 3 1 。 1 2 大引物p c r ( m e g a p ri m e tp c r ) 进行基因突变 p c r 技术进行基因突变有许多不同的方案，其中m e g a p r i m e rp c r 法1 4 ，1 5 1 是比 较简单和灵活的方法。其通过突变引物和相应的外侧引物引发第一轮的p c r 扩 增，其产物又作为引物与另一外侧引物用于第二轮p c r 反应，通过第一轮p c r 扩 增得到的双链d n a 分子少则几十碱基多则上千碱基，远大于普通意义上的引物， 故把它称为大引物。 1 2 1m e g a p ri m e rp c r 法进行单碱基突变 大引物p c r 点诱变技术利用三条寡聚核苷酸引物和两轮p c r 循环在含有需 要突变的克隆基因模板d n a 上进行，图1 3 是m e g a p r i m e r 法的原理。其三条引物 包括两条正向和反向的外侧引物以及突变引物，引物设计在遵循一般性引物设计 原则的基础上，再按照突变位点的不同加以变化。 图中字母a 、b 代表了两侧引物。侧引物( f l a n k i n g p r i m e r ) 可设计在克隆基 因序列内，也可设计在克隆基因的两侧( 即载体质粒的序列上) ；字母m 代表的 5 1 前言 是内部有突变碱基的引物，首先利用突变引物和侧引物进行第一轮的p c r 扩增， 其扩增产物经纯化后作为第二轮p c r 循环的引物( 成为m e g a p r i m e r ) 与另一侧引 物进行p c r 扩增，在两轮p c r 循环中野生型的克隆基因都作为扩增模板，p c r 诱 变后得到的目的d n a 序列一般需克隆到表达载体上做进一步的测序或者功能研 究。 为利于克隆，两条外侧引物选择含有唯一的限制性内切酶位点的序列是必要 的。至于突变引物，为了有效的与模板结合，错配的突变碱基( 引入突变的位点) 不能太接近于引物的3 端，应距3 末端有4 1 0 个碱基以上。许多作者在引物和设 计上进行变化以提高诱变效率：d a t t a 的方法【1 6 1 是在第二轮p c r 的五个循环中只 用大引物引发不对称p c r ，产生大量单链突变的d n a 片段，然后再加入外侧引物， 这样能提高最后的终产物量。k e 等在设计引物时使两个正向和反向外侧引物的 长度相差较大【1 7 】，相应他们的t m 值也产生显著差异，这样第一轮p c r 采用低的 退火温度，之后在无需纯化的情况下直接加入高t m 值的外侧引物，同时相应提 高退火温度，与大引物一起引发第二轮p c r 扩增。给予这一设计，不仅排除低t m 值的外侧引物的干扰，使野生型模板不致被扩增，而且省略了大引物的纯化步骤， 使整个反应可以在一个管中进行。 p c r1 l丛至- + ，- l 二e _ v p c r2 莶三! 塑 生 - , , 8p c r 2 。大弓l ：b ， ，。1 p 。一 图1 - 3 ：用m e g a p r i m e rp c r 法进行单碱基突变的模式图6 】 f i g u r e1 - 3 ：g e n e r a t ep o i n tm u t a t i o nb ym e g a p r i m e rp c r 6 l 前言 l i n g 等【1 8 】建立的“o n e s t e pt h r e e ”( 一步三阶段) 的p c r 法通过独立优化每一 阶段的p c r 循环参数，以达到高效高产的目的。其所谓o n e s t e p 艮p 所需成分包含 三个引物( 两外侧引物和一个突变引物) 连同模板d n a 和d n a 聚合酶在p c r 开 始时一起加入一个反应管至诱变完成一次到位，三阶段即三个连续的自动循环。 这方法的建立使大引物的p c r 定点诱变技术更为科学便利，而且使大引物的长 度增加到至少1 3 k b ，最后终产物可以达到5 4 k b 以上并具高产量，并且操作者可 以设置程序去自动完成。 1 2 2m e g a p rim e rp o r 法进行删除和插入突变 m e g a p r i m e r 法除用于产生碱基突变外，还可用于定点插入、删除( 图1 4 ) 等研究【1 9 删。 d e l e t i o nm u t a g e n e s i s in s e r t i o nm u t a g e n e s i s 图1 - 4 ：用m e g a p r i m e rp c r 法进行删除和插入突变【2 0 】 f i g u r e1 4 ：d e l e t i o na n di n s e r t i o nm u t a g e n e s i sb ym e g a p r i m e rp c r 在进行插入、删除突变的研究中同样需要注意引物m 的设计原则，b a r i k 曾经 成功的进行了上百个碱基的插入、删除研究，因此对所操作的基因长度无上限要 求，只要引物m 的两端各有15 - - 18 个核苷酸与模板d n a 序列互补即可，p c r 扩增 进行时，引物与模板d n a 中不能互补的序列会形成l o o p 结构，从而使插入或删 7 1 前言 除突变掺入到大引物中。 由于m e g a p r i m e r 是长的双链d n a ，比较难通过变性、复性、延伸以合成全长 突变模板，需通过适当延长其变性、复性、延伸的时间或者增加循环次数才能有 效延伸大引物。而且由于在第二轮p c r 中仍含有野生型模板，因此难以避免两侧 外引物对其扩增。若想降低对野生型模板的扩增，需稀释模板浓度【2 1 1 ，或对模板 进行酶切处理【2 2 1 以及将引物设计在基因序列之外2 3 1 ，或者通过对合成的大引物 进行纯化阱】，( 虽然纯化过程费时费工) ，一些作者通过对实验方案的优化设计， 能省略大引物的分离纯化步骤，且能得到较高的突变效率和产量【2 5 1 。 值得注意的是，如果进行删除或者插入诱变的研究时，若在两轮p c r 中使用 的是同一模板，则在同一反应体系中进行的两轮p c r 是不可取的，因为引物a 、 b 可能会绕过引物m 而直接进行扩增，从而导致实验失败。 改进后的m e g a p r i m e r 定点诱变技术能使诱变产物的获得率达到近9 5 ，不 失为一种高效而低耗的方法。但该方法需使用3 条引物，一轮或两轮p c r 反应。 近年来发展的q u i k c h a n g e 快速点突变法，提出了仅使用两条引物，一轮p c r 反应 就能得到高产率的单点或多点突变的一方法，对于制作环状质粒的点突变， q u i k c h a i l g e 法是一种更为简便及高效的方法【2 6 1 。 1 3q uik c h a n g e 快速突变法及反向p c r 法 1 3 1q uic k c h a n g e 法快速制备点突变 迄今为止，对于单点突变而言，最简便的方法是“q u i k c h a n g e ”法，s t r a t a g e n e 公司有销售使用该种方法的商品化的q u i k c h a n g es i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sk i t ，该 试剂盒可用于在双链的质粒上制作点突变，准备突变的质粒必须是从常规e c o l i 中经纯化试剂盒( m i n i p r e p ) 或者氯化铯纯化抽提的质粒。 如图1 5 所示，设计一对重合的包含突变位点的引物( 正、反向) ，和模板质 粒退火后用p f ut u r b o 聚合酶“循环延伸”，( 所谓的循环延伸是指聚合酶按照模板 延伸引物，一轮后回到引物5 端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反 应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝) 。正反向引物的延伸产物退火后配 对成为带缺刻的开环质粒。d p n i 酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规 大肠杆菌，是经d a m 甲基化修饰的，对d p n i 敏感而被切碎( d p n 识别序列为甲基 化的g a t c ，g a t c 在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次) ，而体外合成的 带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转 r 1 前言 化，即可得到突变质粒的克隆。 m u t a n ts t r a n ds y n t h e s i s p e r f o r mf h e r m a | c y c l i n gt o ： 1 d e n a t u r ed n a t e m p l a t e 2 1a n n e a lm u 蛔q e n i c p r i m e r s c o n t a i n i n g d e s i r e dm u t a t i o n 3 1e x t e n dp r i m 刨sw f | 1 p f u u t r ad n i ap o l y m e r a s e d p n i d i g e s t i o no ft e m p l a t e d i g e s tp a r e n t a lm e t h y l a t e da n d h e m i m e t h y t a t e dd n aw 赫d p n i t t a l l s f o r m a t i o n t l - q r l s f o r mm u t a t e dm o l e c u l e i n t oc o m p e t e n tc e ll sf o rn i c kr e p a i r 图1 5 ：q u i c k c h a n g e 法快速制备点突变的步骤【2 7 】 f i g u r e1 5 ：g e n e r a t ep o i n tm u t a t i o nw i t hq u i k c h a n g em u l t is i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i sk i t 这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模板质粒对d p n i 敏感，而合成的突变质 粒对d p n i 酶切不敏感，利用酶切降解模板质粒，得到突变质粒，使得操作简单有 效。另外由于p m 聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，能够有效避免延伸 过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸，有助于减少无意错配， 而且只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。该试剂盒适用于质粒大小不 超过8 k b 的质粒。后来推出的q u i k c h a n g ex l s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sb t 则是针对 大于8 k b 的质粒的定点突变的，通过优化试剂特别是其感受态细胞( x l l 0 g o l d ) ， 使得较大的质粒的定点突变也一样简单。q u i k c h a n g e 由于操作简单快速，效率高 ( 8 0 ) 而受到普遍欢迎。 但是该方法也有诸多缺点及限制，由于采用的是完全匹配的引物，在p c r 过程中容易形成引物二聚体，致使p c r 扩增效率和所得产物阳性率均非常低， q i， 、疆h i ，o 、。鬈k 1 前言 因此，在实际应用过程中，还需配合s t r a t a g e n e 公司突变试剂盒内配套的 x l l 0 一g o l d 超敏感受态细菌才能得到足够的菌落【2 6 1 ，而且该试剂盒价格昂贵，不 利于实验室进行大量d n a 突变试验。 有文献报道【2 8 】采用部分重叠引物法，可以遏制引物自退火，可显著提高扩增 产量和阳性率，但该法的引物设计原则复杂，需有一定经验的人才能完成引物设 计。我们实验室在其上进行了一些摸索和改进【2 9 1 ，让引物突变点5 端的t m 值在 3 4 左右，并在p c r 扩增过程中提高延伸时间，最终获得一个极为简单的使用 末端重合引物的突变方案，即便实验新手也可完成。其突变率约在9 6 2 2 ，这 种改良后的快速点突变法由于其高突变率，相信会在生物学研究中有广阔的应用 前景。 q u i k c h a n g e 快速突变试剂盒也可以用于小于1 2 b p 的片段的插入和删除突变 的研究中【3 0 1 ，w a n g 和m a l c o l m 等【3 1 ，3 2 1 通过改变q u i k c h a n g e 突变法的p c r 程序， 使其能够用于较大d n a 片段的插入与删除突变的研究中，但该种方法仍然存在 上述p c r 扩增产量少及难以转化等缺点。一些实验室也通过使用单引物分别扩 增的方式【3 3 1 或使用不重合的引物对【3 4 】来改善q u i k c h a n g e 突变法，但是仍存在操 作复杂或阳性率偏低等缺点。 1 3 2 反向p c r 突变方案 反l f i p c r ( 1 n v e r s ep c r ，i p c r ) 最早由o c h m a n 开炭3 5 1 ，是用反向的互补引物 来扩增两引物以外的未知序列的片段，实验时常选择已知序列内部没有切点的限 制性内切酶对该段d n a 进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化 连接，再用一对反向的引物进行p c r ，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从 而对未知序进行分析研究。 反向p c r 的目的在于扩增一段已知序列旁侧的d n a ，也就是说这一反应体系 不是在一对引物之间而是在引物外侧合成d n a 。反向p c r 可用于研究与已知 d n a 区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。 这时选择的引物虽然与核心d n a 区两末端序列互补，但两引物3 端是相互反向 的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品d n a ，然后用d n a 连接酶连接成一个环 状d n a 分子，通过反向p c r 扩增引物的上游片段和下游片段。 对于环状d n a 来说，反向p c r 法是以环状d n a ( 如质粒) 为模板，以反方 向设计的两条引物对质粒进行完整的p c r 。通过引物设计导入突变【3 6 1 ，或者在目 1 0 1 前言 标缺失序列两侧设计一对尾部相对( t a i l t o t a i l ) 的引物p 8 1 ，从而在p c r 产物上产 生碱基突变或插入删除序列，然后将p c r 产物进行连接，再经转化产生突变的 质粒。这种方法广泛用于质粒( 小于6 k b ) 的删除突变【3 6 3 7 3 引，精确设计及纯化 引物【3 9 1 也能用于较大的质粒( 1 2 k b 左右) 。 图1 6 ：t o y o b o 试剂盒制各各种突变的引物设计方案 4 0 1 f i g u r e1 6 ： s u b s t i t u t i o n 、d e l e t i o na n di n s e r t i o nm u t a g e n e s i sw i t ht o y o b o m u t a g e n e s i sk i t t o y o b o 试剂盒使用的方法同样基于q u i k c h a n g e 快速突变法的方案，试剂盒 将q u i k c h a n g e 法所使用的p i l ld n a 聚合酶用该公司生产的k o d p l u s 代替，同样 在p c r 反应后用d p n i 降解模板质粒。该试剂盒采用反向p c r 法，不但可以实现几 个碱基的替换、插入或缺失( 如图1 6 ) ，还能进行几十个碱基的插入( t a g 导入) 和数百碱基的缺失，也可以用任一种氨基酸替换特定部位的氨基酸进行饱和突变 ( s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s ) 4 0 l 。 采用t a i l t o - t a i l 引物设计方法的反向p c r 反应后产生的是平末端的开环 d n a ，需做产物的连接实验【3 引，使线性d n a 自身连接环化，产生易于转化的闭 合环状质粒。采用该种引物设计法的p c r 突变产物容易产生非特异的扩增条带， 而且由于需要做额外的连接反应后再转化涂板，步骤比较麻烦，克隆数目少且阳 性率不高。有研究者使用带有互补碱基末端( 1 0 b p 左右) 的正反引物设计方法【4 l 】， 可产生粘末端的开环质粒，通过连接反应和自身连接，可以显著提高产物的克隆 数目及阳性率，但是仍需连接反应。 1 4本文研究的目标、内容和意义 p c r 体外诱变法发展至今，使用的引物从重组p c r 法的至少4 条引物到大 i 前言 引物p c r 法的3 条引物，再到q u i k c h a n g e 快速突变法的2 条引物。从至少3 轮 p c r 反应发展到只需2 轮，到q u i k c h a n g e 法及反向p c r 法的仅使用一轮p c r 反应，步骤越来越简单，操作越来越简便，为使用p c r 技术进行各种基因克隆 操作的科学工作者节省了大量的时间和精力。现在广泛使用的q u i k c h a n g e 点突 变法虽然有诸多缺点，但是不失为一种快速而高效的方法，部分重叠引物法 ( p a r t i a lo v e r l a pp c r 法，简称p o p 法) 则是q u i k c h a n g e 点突变法的一个很好的 补充，其采用的一对部分重叠的引物可以大大增加p c r 扩增产率，且经过本实 验室的改进( 末端重合引物法) ，已经成为制作点突变最简单有效的方法。但是 对于基因片段的删除、插入及替代研究，由于q c p c r 的低产量，难以产生足够 的阳性菌落。t o y o b o 试剂盒中所使用引物设计方法虽然宣称可以制作插入、 删除及替代突变，但是由于该方法需要用连接酶连接p c r 扩增产生的线性产物， 比较麻烦且阳性率也偏低。我们实验室一直在寻找基于q u i k c h a n g e 原理，可以 用于基因的删除、插入及替代突变的方法，最终通过大量研究和实验发现，使用 一种全新的引物设计方法一c o p ”法，可以轻松到大量的阳性突变产物，且其 引物设计简单易行，连初学者都可以轻易掌握。 1 2 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 实验药品、试剂与仪器 2 1 1 细胞株、菌株和质粒资源 h e l a 细胞株本实验室保种 大肠杆菌d h 5 a本实验室保种 g s t - c d k 9 p g e x - 2 t k本实验室构建 p h i v - l t r - l u c i f e r a s e 质粒本实验室构建 p h i v - a e n h a n c e r - l t r l u c i f e r a s e 质粒本实验室构建 p h i v - a s p l l t r - l u c i f e r a s e 质粒本实验室构建 p h w - a t a r - l t r l u c i f e r a s e 质粒本实验室构建 p h i v - a e n h a n c e r & s p l l t r - l u c i f e r a s e本实验室构建 质粒 2 1 2 主要试剂和材料 常规的生化试剂均购自s i g m a a l d r i c h 、m e r c k 或a m e r s c o 公司。 分子克隆所用的t 4d n a 连接酶、全部的限制性内切酶均购自美国n e b 公司( i p s w i c h ，m a ) ；碱性磷酸酶( c i p ) 、p f u 聚合酶购自美国p r o m e g a 公司。 细胞培养使用的d m e m 培养基和s m e m 培养基干粉购自g i b c ol i f e t e c h n o l o g y 公司( g r a n di s l a n d ，n y ) ；无c a c l 2 和磷酸盐的d m e m 培养基按 g i b c o 配方自制；小牛血清购自h y c l o n e 公司；p e i ( p o l y e t h y l e n i m i