（细胞生物学专业论文）光系统Ⅱ放氧复合物的光组装研究.pdf

中文摘要 中文摘要 本论文研究了一系列具有不同配位环境的锰化合物与去锰的p s i i 的光组装 过程，得到了以下主要结果： 1 分别对两组二核锰化合物与去锰的p s i i 颗粒进行了重组研究。第一组的 两个二核锰化合物中，锰原子具有相同的外围配体、氧化还原状态，但是不同 的连接方式；而第二组的两个二核锰化合物中，锰原子具有相同的连接方式、 氧化还原状态，但是不同的外围配体。实验结果表明，锰化合物中两个锰原子 之间的连接方式及外围配体的不同都可以导致锰簇光组装效率的不同，但这两 种因素引起的光组装效率的差异比锰原子的氧化还原状态引起的差别要小的 多。因此我们推断，锰原子的氧化还原状态是影响光组装效率最重要的因素之 一o 2 选择了三个四核锰化合物与去锰p s i i 颗粒进行重组，测定其电子传递与 放氧活性。研究结果表明，具有较少配体( 较小分子) 的两个化合物h 5 6 8 和 w m 0 1 具有较高的重组活性，而另一个化合物z 3 4 2 的活性较低。我们推测化合 物配体的数目以及分子的大小影响光组装效率。另外，化合物h 5 6 8 和w m 0 1 在 重组过程中对c a c l 2 也比z 3 4 2 更敏感，推测这可能是因为这两个锰化合物中有 更多的的羧基可以与c a 2 + 发生相互作用，而这种作用有助于锰的配位，进而促 进光组装。 3 研究了m n c a 的簇合物与去锰的p s i i 颗粒的光重组，研究发现，尽管化 合物w w g 2 7 本身就含有c a 的成分，但它在与光系统i i 的光组装过程中仍然表现 为外源c a 需要的趋势，而且这一化合物也表现了比m n c l 2 更高的光组装效率。 4 研究了m n c l 2 与去锰p s i i 颗粒的重组过程中，组氨酸和酪氨酸的存在对 光组装效率的影响。研究结果表明，加入一定量的组氨酸和酪氨酸均可以明显 的提高样品的放氧活性，并且这两种氨基酸对光组装效率的影响均与p h 值有关。 关键词：光系统；放氧复合物；锰化合物；光组装 英文摘要 舞鼍曼皇曼曼皇鼍鼍皇鼍曼篁詈詈鼍詈曼鼍! 皇皇鼍皇鲁鼍詈皇量i t i 。一i i 一, = , a b s tr a c t s t u d i e so nt h ep h o t o a s s e m b l yo fw a t e r - o x i d i z i n gc o m p l e xo fp h o t o s y s t e mi i l i n gl i n ( c e l lb i o l o g y ) d i r e c t e db yl is h u q i n i nt h i st h e s i s ，t h ep r o c e s so fp h o t o a s s e m b l yo ft h ew a t e r - o x i d i z i n gc o m p l e xo f p h o t o s y s t e mi im e m b r a n e sh a sb e e ne x a m i n e di nd i f f e r e n tb i o i n o r g a n i ec h e m i s t r y c o n d i t i o 璐t h er e s u l t so b t a i n e dh e r ew e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t w o 擎0 u p so fd i n u c l e a rm a n g a n e s ec o m p l e x e s ，i nw h i c hm a n g a n e s ea t o m s i 1 1 o n e g r o u pc o n t a i ns a m el i g a n d s a n dv a l e n c es t a t eb u td i f f e r e n tl i n k a g em o d ew h i l e m a n g a n e s ea t o m si na n o t h e rg r o u ph a v es a m el i n k a g e m o d ea n dv a l e n c es t a t eb u t d i f f e r e n tl i g a n d s ，w e r eu s e dt or e c o n s t i t u t et h ew a t e r - o x i d i z i n gc o m p l e x ( w o c ) i n m n d e p l e t e dp s i ip r e p a r a t i o n i tw a ss h o w n t h a td i f f e r e n c ei nt h ep r o p e r t i e so fl i g a n d o rl i n k a g em o d eo fm na t o mw i t h i nd i n u c l e a rm a n g a n e s ec o m p l e x e sc a l la f f e c t e f f i c i e n c i e so fc o m p l e x e si nt h er e c o n s t i t u t i n gt h ee l e c t r o nt r a n s f e ra n d o x y g e n - e v o l v i n gc a p a c i t i e s b u t t h ee f f e c to fl i g a n da n dl i n k a g em o d e o nm e e 伍c i e n c yo fr e c o n s t i t u t i o no fw o c i ss m a l l e rt h a nt h a to fr e d o xs t a t e so fm na t o m i t i ss u g g e s t e df r o mo u rr e s u l t st h a tr e d o xs t a t e so f m na t o mi st h em o s ti m p o r t a n t f a c t o r sa f f e c t i n gt h er e c o n s t i t u t i o no fw o c 2 e f f i c i e n c yo ft h r e et e t r a n u c l e a rm a n g a n e s ec o m p l e x e smr e c o n s t i t u t i n g e l e c t r o nt r a n s p o r ta n d0 2e v o l u t i o na c t i v i t y i nm n - d e p l e t e dp h o t o s y s t e mi i p r e p a r a t i o n si sa n a l y z e d t w om n - c o m p l e x e si nw h i c hm n a t o mh a sf e w e rl i g a n d s a n ds m a l ls i z ep a r t i c i p a t ei nam o r ee f f e c t i v er e a c t i v a t i o no fo x y g e ne v o l u t i o nt h a n t h eo t h e rm n c o m p l e x e s i ti si n f e r r e df r o mo u rr e s u l t st h a tr e c o v e r yo fe l e c t r o n t r a n s p o r ta n d0 2e v o l u t i o na c t i v i t yw i t hp o l y n u c l e a rm n - c o m p l e x e sa r ea f f e c t e db y t h el i g a n dn u m b e ra n ds i z e m o r e o v e r , t h e s ea b o v e m e n t i o n e dm n c o m p l e x e sa r e n 1 0 r es e n s i t i v et ot h ea d d i t i o no fc a c l 2 ，b e c a u s et h e r ea r em o r ec a r b o x y li n t e r a c t i n g w i t hc a d u r i n gp h o t o a c t i v a t i o ni n t h e s em n - c o m p l e x e s ，w h i c hi ss u g g e s t e dt o s u p p o r tt h el i g a t i o no fm n a t o ma n df o r m a t i o no fa c t i v ew o c 英文摘要 3 am a n g a n e s ec o m p l e xt h a tc o n t a i n sc aw e r es y n t h e s i z e da n du s e dt o r e c o n s t i t u t et h ew o ci no r d e rt op r o v i d es o m eu s e f u li n f o r m a t i o na b o u tt h ef u n c t i o n o fc ai np h o t o a s s e m b l y i ti ss u g g e s t e df r o mo u rr e s e a r c ht h a tw h e nt h i sc o m p l e xt h a t c o n t a i n sc ar e c o n s t i t u t e dt om n d e p l e t e dp s h ，t h e r ea r es t i l le x o g e n o u sc an e e d si n t h ep r o c e s s 4 e f f e c t so fa d d e dh i s t i d i n ea n dt y r o s i n eo nt h ep r o p e r t i e so ft h ep h o t o a s s e m b l y o fp h o t o s y s t e mi ia r er e s e a r c h e d h e r ew es h o wt h a th i s t i d i n ea n dt y r o s i n em a r k e d l y e n h a n c eo x y g e ne v o l u t i o ni nm n - d e p l e t e dp h o t o s ) s t e mi i ，w h i c hi n d i c a t et h a tt 1 1 e y c a na c c e l e r a t ea s s e m b l yo ft h ei n o r g a n i cc o r eo ft h ew a t e r - o x i d i z i n gc o m p l e xi n m n - d e p l e t e dp h o t o s y s t e m1 i ，a n dt h i se f f e c ti sp hd e p e n d e n t k e yw o r d s ：p h o t o s y s t e mi i ；o x y g e n - e v o l v i n gc o m p l e x ；m n - c o m p l e x ； p h o t o a s s e m b l y m 缩写词 缩写词 a b b r e v i a t i o n s 英文缩写中文名称英文全称 a c r b i s c h la c h ib d c b q e d t a e p r e s e e m f m f 0 f v f v f m m 匣s o e c p 6 8 0 p a g e p p b q p q p s p s r c q a q b s d s t e m e d 丙稀酰胺 甲叉双丙稀酰胺 叶绿素a 叶绿素b 2 6 二氯对苯醌 乙二胺四乙酸 电子顺磁共振 电子自旋回波调制 暗适应下最大荧光 暗适应下最小荧光 暗适应后最大可变荧光 光系统的最大光化学效 塞 2 吗啡酸一乙磺酸 放氧复合物 原初电子给体 聚丙烯酰胺凝胶电泳 苯基对苯醌 质体醌 光系统 光系统反应中心 p s i i 原初电子受体 p s i 次级电子受体 十二烷基硫酸钠 四甲基乙二胺 a c r y l a m i d e n n - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e c h l o r o p h y l l 口 c h l o r o p h y l lb 2 ，6 - d i e h i o r o - p - b e n z o q u i n o n e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e l e c t r o np a r a m a g n e t i cr e s o n a n c e e l e c t r o ns p i ne c h oe n v e l o p e m o d u l a t i o n n l em a x i m a lf l u o r e s c e n c el e v e li n d a r k a d a p t e ds t a t e t l 把m i n i m a lf l u o r e s c e n c el e v e la f t e r d a r k a d a p t i o n t h em a x i m u mv a r i a b l ef l u o r e s c e n c e a f t e rd a r k a d a p t i o n t h em a x i m a le 伍c i e n c yo fp s i p h o t o c h e m i s t r y 2 一( n - m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d o x y g e ne v o l v i n gc o m p l e x p r i m a r ye l e c t r o nd o n o r s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h e n y l p - b e n z o q u i n o n e p l a s t o q u i n o n e p h o t o s y s t e mi i p h o t o s y s t e mi r e a c t i o nc e n t e r p r i m a r yq u i n o n ea c c e p t o ro f p s i s e c o n d a r yq u i n o n ea c c e p t o ro fp s i s o d i u md o d e c y ls u l f a t e n 。n ，n 。 n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s 三羟基氨基甲烷t r i s h y d r o x y m e n t y l a m i n o m e t h a n e w o c水氧化复合物 w a t e r - o x i d i z i n gc o m p l e x 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院植物研究所有关保留、使用学位论文的 规定，即：植物研究所有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅 和借阅；学校可以提供目录检索以及公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者签名： 年月日 一蕴猎写蜀饰丽惹j 一本孚莅该减孺- 手葆雹_ 。在。擎舀蹯诟遒甫。 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月日 第一苹前言 暑曼曼詈詈兽暑暑皇詈鼍皇暑鲁皇詈! 曼鼍量置鲁皇鲁皇鼍皇鼍曼皇! 曼巴曼! ! 詈篁, i 一i l l i 一m 毫! 詈暑鼍皇皇暑詈皇曼皇鼍 第一章前言 1 1 光系统i i 光合放氧复合物的结构与功能 1 1 1光系统i i 光合放氧复合物 在光合作用研究中，光合放氧一直是一个最基础、最焦点的课题。光合放 氧是发生在p s i i 中的一个重要化学反应，在这一生物化学反应中，由于水是热 力学非常稳定的物质，要使它在相对较温和的条件下给出电子，必须有其它催 化剂的存在，包括锰簇在内的放氧复合物担当这一角色。在p s i i 中，一个完整 的具有光合放氧功能的放氧颗粒包括d l 、d 2 、c y t b 5 5 9 、c p 4 3 、c p 4 7 、3 3 k d 、 2 3 k d 、1 7 k d 等2 0 多个蛋白( 图1 1 ) ，但体外光激活表明，在缺失c p 4 3 的情况 下反应中心和c p 4 7 也能进行光组装并具有放氧功能，这是目前报道的具有放氧 功能复合体的最小单位【1 】。至于放氧中心则最早认为结合在d 1 ，d 2 上，但最 近的一些突变研究显示c p 4 3 ，c p 4 7 也有可能直接参与放氧中心的结合 2 】，此 外，最近报道的分辨率为3 5 a 的晶体结构图谱还表明c p 4 3 上g l u 3 5 4 参与锰簇 的配位【4 8 】。在光系统的外周结合有三个水溶性的蛋白：3 3k d 、2 3k d 、1 7k d 蛋白，它们结合于类囊体囊腔侧，被称为放氧中心的稳定蛋白，现已表明它们 不直接参与放氧反应，但它们能维持放氧反应所需的良好环境及水或质子的交 换路径。 s t r o m a 耳曰矸 毡彗邑 l u m e n 图i ip s i i 的结构模型图 f i g u r e l 1t h es 仃u c t u r eo fp h o t o s y s t e mi i 8 h 4 光系统l i 放氧复台物的光组装研究 i l2 放氧中心结构 目前，x a s ( x r a ya b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ) 实验、定点突变研究及放氧中心 化学特性研究结果表明，放氧中心四个锰离子基本处于6 配位的状态，外围配 体主要由c o o 一组成，此外还有2 个组氪酸，2 个h 2 0 和1 个c l - 。不过这些配 体的正确配位均未得到阐明，这导致人们对放氧机理的认识不清，也导致人们 对所观察实验解释的混乱。另外，放氧中心还结台一个特征的c r + 限9 ，生理 研究表明，c 矿+ 在水氧化过程中起重要作用，没有c a 2 的参与，水的氧化只能 进行到s 2 态：x a s 谱研究表明【7 】l c a 之间的距离为3 4 a ，但c 2 + 如何与锰 结合存在争议。y z 是光合放氧的关键组分定点突变表明d l 上的y 6 1 是y 孙 它将自身的电子转移给p 6 8 0 而后又从锰簇夺取电子而恢复原状，关于y z 和锰 簇距离在1 9 9 5 年g i l c h r i s t 1 1 1 报道为45 a ，但1 9 9 8 年同一研究小组发现早些推 测有误 1 2 1 ，最近几个研究小组同时给出的研究结果显示1 如与锰簇距离为8 0 a 左右 1 3 ，1 4 。随着这个距离测量准确程度不断提高，它已成为描述锰簇在放氧 复合物中位置的一个重要指标。 图1 2o e c 结构筒图( b a r b e k2 0 0 4 ) f i g u r e l2t h es t r u c t u r e o f o e c 最近，在几家实验室相继报道了嗜热蓝藻高放氧活力的p s n 体后，又解析 第一章前言 出分辩率为3 5a 的晶体结构图谱 4 8 ，给出了参与激发能传递和电子传递的大多 数蛋白亚基( 9 0 ) 的位置，锰簇电子密度计算推断m n 3 c a 0 4 形成一个立方烷结 构，并与第四个锰原子以单氧桥相连( 图1 2 ) ，锰簇的外围配体包括了d 1 ，d 2 ， c p 4 3 上的7 个氨基酸，其分别是d 1 a s p 3 4 2 ，c p 4 3 g l u 3 5 4 ，d 1 h i s 3 3 2 ，d 1 g l u l 8 9 ， d 1h i s 3 3 7 ，d 1 a s p l 7 0 ，d 1 g l u 3 3 3 。c a 2 + 在立方烷结构内与三个氧原子相连，d 1 砧a 3 4 4 与之靠近，另外，c a 2 + 还有两个非氨基酸配位连接，其中一个很可能是 h c 0 1 。 1 1 3 放氧有关的外周蛋白 在高等植物中表观分子量为3 3 、2 3 和1 7 k d 的3 个外周蛋白结合于p s i i 的 囊腔侧，对维持p s i i 的放氧活性起重要的作用。它们可以维持c a 2 + ，c i 一浓度， 使其结合在p s i i 上，同时保护锰簇不被还原剂等化学物质的进攻 3 5 】。在低c l 一浓度下，从膜上去除3 3 k d 蛋白，会导致锰簇中两个锰原子脱落，当在缓冲液 再加入c 1 一( 1 0 0 m m o l ：l ) 后，可使锰簇恢复完全，不过此时p s i i 的放氧活性大为 降低【3 6 】。许多研究表明：3 3 k d 蛋白结构具有可变性和很好的耐热性，且对低 p h 有很好的抗性【3 7 】。化学修饰及位点突变研究表明：3 3 k d 结构的变化对其与 p s i i 的结合及维持其功能有很大的影响 3 8 ，3 9 1 。最近，对3 3 k d 的研究又有新的 进展，当使其发生分子内交联后，并没有影响它与p s i i 的结合及对锰的稳定作 用，但导致p s i i 的放氧活性丧失【4 0 】。同时，一些研究结果也显示，在放氧过程 中锰簇的氧化态也可以影响3 3 k d 的结构【4 1 】。由此可见，3 3 k d 不仅对锰簇有稳 定作用，而且还可能承担其它重要的功能。1 7 k d 和2 3 k d 的去除也会引起放氧 功能的部分丧失，这主要是因为它们的脱落会引起c a 2 + 和c l _ 的游离，如在缓冲 液中滴加适当浓度的c a 2 + 和c 1 一，p s i i 则可以保持高的放氧活力，缺失2 3 k d 会使c l - 对锰簇的亲和力减小而对光抑制非常敏感【4 2 】。总之，人们已经意识到 外周蛋白对光合放氧的重要性。最近，有报道【4 3 】发现在光合放氧中，底物水 的交换也依赖于外周蛋白的存在，可见它们的功能仍需深入研究。 光系统i l 放氧复合物的光组装研究 量l , 一 m 鼍墨皇鲁皇! 詈鼍詈詈詈鼍! 毫暑! ! ! 皇詈鼍鲁! 詈詈曼曼鲁詈暑曼鼍詈! 詈皇鼍詈曼! 曼皇曼皇皇鼍曼暑晕皇皇舞毫鼍基曼! 詈詈量鼻皇詈皇置置詈! 毫量鲁量曼鼍皇 1 1 4c a 2 + ，c 1 一在放氧中的作用 如前所述，c 1 一、c a 2 + 很可能是m n 的一个配体，但人们对于它们在光合放 氧中的作用还不完全清楚。对整体p s i i 的研究表明，在锰簇中有一个结合紧密、 交换缓慢的c l - 。它对于放氧最优化的p h 范围为5 5 7 5 ，在p n 为6 5 时放氧 活性最高，当提高c r 浓度，在高p h 值下有相对较高的放氧量。而且动力学研 究表明，在活性的c l _ 和抑制性的o h 一之间存在着明显的竞争作用【7 】，表明o h 一和c l _ 可以竞争同一结合位点，或者说c 1 - 的结合需要质子的结合来维持电荷中 性。当经碱处理将c r 去除时，会导致s 态停在s 2 态，在这个态中测不到c r 的e p r 信号。如将c l - 被其它阴离子置换，将导致水氧化最后阶段的动力学过 程减慢，同时使s 2 态和s 3 态稳定性降低【3 1 】。最近用f t 取研究表明在s l 态向 s 2 态转变过程中，c l - 对蛋白结构变化起很重要的作用【3 2 】。c a 2 + 对放氧也是必 需的 2 9 ，3 2 ，钙的去除使s 态循环停在s 2 态，只能观察到s 2 多线谱。将缺钙的 p s i i 冰冻照射，会出现第二个e p r 信号，此信号线宽为1 6 0 g ，归属于锰簇合物 与y z 的作用。此外，c a 2 + 还能被相应大小的阳离子所取代，但只有s r 2 + 能部分 恢复活性。c a 2 + 的去除不仅会使放氧复合物的结构改变 3 3 】而且也会使其氢键体 系受到破坏 3 4 】。 1 2 光合放氧中心锰簇的光组装 在p s i i 放氧复合物的形成过程中，蛋白被合成并插入类囊体膜中，自由的 无机辅助因子在一个称为“光活化过程的作用下与囊腔上的蛋白形成一个具 有放氧活性的复合物。c h e m i c 及其合作者首先提出了“光激活这个术语并提 出这是一个光驱动的两步反应过程。d i s m u k 等将光组装定义为无机离子结合到 p s i i 放氧复合物( a p o w o c p s i i ) 上，通过光驱动的光活化过程，形成具有放氧功 能的m 。4 c 。c l x 复合物的过程 2 2 】。 在过去的3 0 年中，许多研究小组对光激活过程进行了研究，尤其c h c n a i c 及其合作者进行了许多先驱性的工作，这些工作包括：( 1 ) m n 2 + ，c a 2 + 、c i 一的作 4 第一苹前言 用及实验条件( 光强、p h 、缓冲液的类型、去m n 的方法及外源电子受体的作 用) ；( 2 ) 确定了参与光组装和m n 连接的必要氨基酸残基；( 3 ) 确定了一个广泛 接受的动力学模型。( 4 ) 外周蛋白的重组以及它们在促进无机辅助因子结合中的 作用等。 1 2 1 锰簇光组装的模型 由于对锰簇结构的了解得不充分，光组装的机理目前仍不完全清楚。基于光 激活的动力学分析，一般认为光组装由两个光驱动的光反应过程和间隔在中间 的暗反应过程组成 4 9 ，5 0 。其主要反应步骤如下： ( 1 ) 第一次光照之前，m n 2 + 结合到位于y z 附近特异性的高亲和性位点( s t a t e a ) 。定点突变研究认为此位点可能是d 1 a s p l 7 0 。( 2 ) 第一次光照后，已结合的m n 2 + 被光氧化成m n 3 + ，形成不稳定的中间体( s t a t eb ) 。( 3 ) 第一个光化学反应诱导蛋 白构象变化产生了第二个m n 2 + 的结合位点，m n 2 + 结合到相应位点，形成第二个 中间体( s t a t eb ) 。该暗反应过程是光活化的限速步骤。( 4 ) 结合于第二个位点的 m n 2 + 通过第二个光化学反应氧化成m n 3 + ，从而形成锰二聚体形式( s t a t ec ) 。( 5 ) 接着另外两个m n 2 + 结合上去形成四核锰簇复合物。钙可能参与调控从s t a t eb 到 s t a t ec 过程的蛋白构象变化 1 1 】。不过到目前为止，锰簇组装的详细过程仍不清 楚。o n o 4 9 提出了锰簇复合物组装的金属自由基光组装假说。该假说认为m n 2 + 是以( m n ( i i ) o h 2 ) 2 + 的形式结合到p s i i 蛋白上的，y z 参与了i v l n 2 + 结合和光氧化 过程的质子和电子的偶合传递，d 1 h i s l 9 0 与y z 一起参与了( ( ) o h 2 ) 2 + 的去 质子化和质子转移过程。d i s m u k e s 等 5 0 】基于e p r 和电化学的一些研究结果和 推测则认为m n 2 + 是与h c 0 3 - 结合后才结合到p s i i 相应位点上的。 光系统i i 放氧复合物的光组装研究 图1 3 锰簇组装的动力学模型 f i g u r e1 3ak i n e t i cm o d e lo fp h o t o a c t i v a t i o n 1 2 2 组装有关的蛋白 p s i i 核心非结合域的构象变化是非常重要的，但没有发现对光激活必要的伴 侣蛋白。研究表明：光组装必要的最小蛋白核心包括d 1 、d 2 、c y t b 5 5 9 及内周 天线c p 4 7 和几个小的疏水蛋白亚基；另外一个内周天线c p 4 3 ，对光组装并不 必需【2 】，然而它的存在可以通过稳定光诱导中间物和提高光吸收交叉部分，从 而提高光激活的速率。在有限的光强下，发现光激活的量子效率与c h l 天线大小 成i e 七( c p 4 7 p s i i c o r e 6 0 0 衄，i = 5 5w m - 2 ，光照3 0 - - 6 0 秒，暗间隔3 0 - - 4 0 秒) 。 2 6 放氧活性测定 放氧速率测定采用c l a r k 型氧电极( h a n s a t e c hi n s t r u m e n t sl t d ) 。2 5 循环水 浴恒温。光照为饱和光。放氧缓冲液组成为：0 3m o l ls u c r o s e ，2 5m m o l l m e s - n a o h ( p h6 5 ) ，1 0m m o l ln a c l ，5m m o l lc a c l 2 。0 2m m o l lp p b q 作为电 子受体。 1 2 第二苹实验材料与方法 2 7 锰含量分析 锰含量分析使用a a s 1 原子吸收分光光度计( p e r k i n - e l m e rz e e m a n5 0 0 s p e c t r o m e t e r ) 。样品用1 0 0m m o l l 的h n 0 3 硝化，离心