（细胞生物学专业论文）青岛文昌鱼transferrinlike基因的克隆、表达和功能研究.pdf

中国海洋人学硕+ 学位论文 青岛文昌鱼t r a n s f e r r i n l i k e 基因克隆、表达和功能研究 捅要 转铁蛋白是一种非血红素结合的d 球蛋白，它具有两个铁离子( f e 3 十) 结合 位点，可以结合两个铁离子。多个物种转铁蛋白的结构、功能、序列和表达已有 了深入的研究。但是，关于文昌鱼转铁蛋白的研究却未见报道。文昌鱼是无脊椎 动物进化到脊椎动物的过渡类群的典型代表，一直被认为是研究脊椎动物起源和 进化的模式动物。本文从青岛文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 消化道c d n a 文库 中，分离到一段具有完整3 末端的t r a n s f e r r i n 1 i k e 基因( b b 卵) ，然后对该基因序 列进行了克隆，并对其结构、鉴定、表达和功能进行了研究。 首先，我们从头索动物文昌鱼中克隆出类转铁蛋白基因( b b 研) 并对其序列 进行了分析。其最大开放阅读框编码1 2 5 6 个氨基酸的蛋白质( 理论分子量为1 4 8 k d a ) ，含有一个n 末端的信号肽，属于分泌型蛋白。该e d n a 编码的蛋白b b t f l ， 其n 端, h c 。端具有保守的t r a n s f e r r i n 结构域。但其c 端结构域有一个巨大的插入片 段，这与脊椎动物及无脊椎动物中的转铁蛋白都不同，但是与已报道的海胆的主 要卵黄蛋白( m y p ) 极为相似，均属于转铁蛋白家族。将b b t f l 完整的n 。端结构 域同其他t f s 进行序列比对发现，该蛋白与各物种中t f s 的同源性较低，但是1 2 个 半胱氨酸残基的位置很保守，说明他们可能具有相似的三级结构。系统进化分析 发现，包括文昌鱼b b t f l 在内的无脊椎动物t f s 聚为个类群，脊椎动物的t f s 聚为 一个类群，且文昌鱼b b t f l 位于脊椎动物t f s 的基部。 其次，我们对t r a n s f e r r i n 1 i k e 基因在青岛文昌鱼中的表达情况做了研究。 n o r t h e r nb l o t 结果显示，b b t f l 基因在青岛文昌鱼的肝盲囊和后肠中的转录产物为 一条带，大小为4 1 0 0 b p 左右，与我们从文昌鱼中克隆的b b t f le d n a 的大小基本一 致。切片原位杂交分析表明，b b t f l 在成体文昌鱼组织中呈特异性表达，在肝盲囊 和后肠中的表达量最高。用革兰氏阴性菌感染文昌鱼后，肠中b b t f l 基因表达水平 在1 2 和2 4 d , 时显著升高。因此，推测文昌鱼b b t f l 可能是一种急性时相蛋白，参与 宿主免疫防御。 为了在蛋白水平上验证文昌鱼b b t f l 是否参与宿主免疫，我们构建原核表达 载体，表达并纯化出重组蛋白b b t f l n ，复性后对其功能进行检测，检测到复性后 v 中国海洋大学硕士学位论文 的b b t f l n 具有螯合铁离子活性及抗菌活性。抗菌活性的检测发现它对革兰氏阴性 细菌大肠杆菌和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌都有显著的抑制作用，这说明 b b t f l 是一种免疫相关蛋白，可以抑制革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌和革兰氏阴 性菌如大肠杆菌的生长。而当抗菌实验中有铁离子加入时，这种抑制作用便会减 弱，因此，t 啪铁离子结合能力似乎对于其发挥抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 的活性是必不可少的。综上，我们认为文昌鱼t r a n s f e r r i n 1 i k e 蛋白与宿主的免疫防 御有关，推测是因其螯合铁离子使细菌失去其生长繁殖所必须的营养因子而抑制 其生长。 关键词：文昌鱼；t r a n s f e r r i n 1 i k e 基因；克隆；表达；抗菌活性 v i 中国海洋大学硕+ 学位论文 j 1 一 - 一 c l o n i n g ，e x d r e s s l o na n df u n c t i o n a la n a l y s i so la t r a n s f e r r i n - - l i k eh o m o l o gi na m p h i o x u sb r a n c h i o s t o m a a b s t r a c t t r a n s f e r r i n ( t f ) i sak i n do fn o n - h e m eb g l o b u l i na n di r o n b i n d i n gp r o t e i n sw i t h t w oi r o ni o n s ( f e 3 + ) b i n d i n gs i t e s t h es t r u c t u r e s ，f u n c t i o n s ，s e q u e n c e sa n de x p r e s s i o n s o fm a n yk i n d so ft f sh a v e b e e ns t u d i e di nd e e p ，y e tl i t t l ei sk n o w nt od a t ea b o u ti ti n t h ea m p h i o x u sb r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i a m p h i o x u so rl a n c e l e t ，ac e p h a l o c h o r d a t e ， l o c a t e da tt h eb a s eo fv e r t e b r a t e s ，a n di sb e c o m i n ga ne m e r g i n gm o d e lo r g a n i s mf o r i n s i g h t si n t ot h eo r i g i na n de v o l u t i o no fv e r t e b r a t e s i nt h ec o u r s eo fe x p r e s s e d s e q u e n c et a g ( e s t ) g e n e r a t i o nf r o mt h eg u tc d n al i b r a r yo fa d u l ta m p h i o x u s b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ，w ei s o l a t e dag e n e f r a g m e n te x h i b i t i n gi d e n t i t y t o t r a n s f e r r i n - l i k e g e n e s ，i nt h i sp a p e r , w er e p o r tc l o n i n g ，e x p r e s s i o na n df u n c t i o n a l a n a l y s i so ft r a n s f e r r i n l i k eg e n ei na m p h i o x u sb b e l c h e r i w eh a v ec l o n e da n dc h a r a c t e r i z e dt h ec d n as e q u e n c eo fat r a n s f e r r i n l i k e m o l e c u l ei nt h es u b p h y l u mp r o t o c h o r d a t a t h ed e d u c e d12 5 6a m i n oa c i d sl o n gp r o t e i n ， b b t f l ，h a sa nn - t e r m i n a ls i g n a lp e p t i d e ，s u g g e s t i n gi ti s as e c r e t e dp r o t e i n t h i s p r o t e i nc o n t a i n s2t r a n s f e r r i nc o n s e r v e dd o m a i n si n i t sn - t e r m i n a la n dc - t e r m i n a l r e g i o n ，b u tt h e r ew a sal a r g ei n s e r t i o ni ni t sc t e r m i n a lr e g i o n i tw a sd i f f e r e n tf r o m t r a n s f e r r i n sf r o mm o s tv e r t e b r a t e sa n di n v e r t e b r a t e sb u ts i m i l a rt ot h em y po fs e a u r c h i nw h i c ha l s ob l o n g st ot r a n s f e r r i nf a m i l y t h ec o m p l e t en - t e r m i n a lt r a n s f e r r i n d o m a i no fb b t f lw a sc o m p a r e dt ot h eo t h e rt r a n s f e r r i n sr e v e a l e dt h a tb b t f ls h a r e sa l o w e ri d e n t i t yw i t ho t h e rt f s ，w h i l e12c y s t e i n er e s i d u e si nt h eb b t f lw e r ec o n s e r v e d ， i n d i c a t i n gt h a tb b t f lh a dt e r t i a r ys t r u c t u r e ss i m i l a rt oo t h e rt f s t h ep h y l o g e n e t i ct r e e f o u n dt h a tb b t f lw a sc l u s t e r e dt o g e t h e rw i t ha l lt h ei n v e r t e b r a t et f s ，w h i c hw a s b r a n c h e df r o mt h ev e r t e b r a t eh o m o l o g sa n dl o c a t e da tt h eb a s eo fm e l a n o t r a n s f e r r i n s a n do t h e rt f s n o r t h e r nb l o tr e v e a l e dt h ep r e s e n c eo fa na p p r o x i m a t e4 0 0 0b pt r a n c r i p t v i l 中国海洋大学硕士学位论文 c o r r e s p o n d i n gi ns i z et ot h ef u l l l e n g t hb b t f le d n aw ec l o n e di nb b e l c h r i 。i ns i t u h y b r i d i z a t i o nh i s t o c h e m i s t r yd e m o n s t r a t e dt h a tb b t f lt r a n s c r i p tw a sm o s ta b u n d a n ti n t h eh e p a t i cc a e c u ma n dh i n d - g u t ，i n d i c a t i n gat i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s i o np a t t e r no f b b t f li na d u l ta l t l p h i o x u s c h a l l e n g e 谢t 1 1g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i as o o n ( 1 2a n d2 4h ) r e s u l t e di na nu p - r e g u l a t i o no fb b t f le x p r e s s i o ni nt h eg u t si n c l u d i n gt h eh e p a t i c c a e c u m ，s u g g e s t i n gt h a tb b t f lm a yb eak e ya c u t ep h a s ep r o t e i ni na m p h i o x u sa n d i n v o l v ei nt h eh o s ti m m u n ed e f e r i s e t h e p u r i f i e db b t f l nw a su s e dt o t e s ti t sa c t i v i t i e s t h er e c o m b i n a n tb b t f l nh a s i r o n b i n d i n ga c t i v i t ya n db a c t e r i o s t a t i ca c t i v i t y i tw a so b s e r v e dt h a tb b t f l nw a s c a p a b l eo fs i g n i f i c a n t l yi n h i b i t i n gt h eg r o w t ho fe 。c o l ia n d , s a u r e u s t h i sc l e a r l y s h o w st h a tb b t f li sa ni m m u n e r e l e v a n tp r o t e i nc a p a b l eo fi n h i b i t i n gt h eg r o w t ho f g r a m n e g a t i v eb a c t e r i a l i k ee c o l ia n dg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i al i k es a u r e u s m o r e o v e r ，t h eb a c t e r i o s t a t i ca c t i v i t yo ft h er e c o m b i n a n tb b t f l na g a i n s te c o l ia n ds a u r e u sw a sa b l et ob ea b o l i s h e db yi r o n ，t h u st h ei r o n - b i n d i n gc a p a c i t yo ft h et fs e e m s t ob ee s s e n t i a lf o rt h ei n h i b i t i o no fe c o l ia n d a u r e l 2 s t o g e t h e rt h e s er e s u l t ss u g g e s t t h a tt r a n s f e r r i n - l i k ei r o nb i n d i n gp r o t e i n sm a ya l s ob eag e n e r a lp a r to ft h ei n s e c ta n d c e p h a l o c h o r d a t ei m m u n er e s p o n s eb ys e q u e s t e r i n gi r o nf r o mi n v a d i n gp a t h o g e n s k e y w o r d s ：a m p h i o x u s ；b r a n c h i o s t o m a ；t r a n s f e r r i n - l i k eg e n e ；c l o n i n g ；e x p r e s s i o n ； a n t i b a c t e r i a la c t i v i 锣 青岛文吕鱼t r a n s f e r r i n 1 i k e 基因的克隆、表达和功能研究 缩略语 a m p ( a m p i c i l l i n ) b p ( b a s ep a i r ) b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) c a c l 2 ( c a l c i u mc h l o r i d e ) c d n a ( c o m p l e m e n t a r yd n a ) d a ( d a l t o n ) d e p c ( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) d n t p ( d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) d t t ( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) e b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) e c o l i ( e s c h e r i c h i ac o l i ) e d t a ( t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ) h r ( h o u r ) k b ( k i l o b a s e ) k d a ( k i l o d a l t o n ) m c s ( m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s ) m i n ( m i n u t e ) m r n a ( m e s s e n g e rr n a ) o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) p b s ( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) r n a s ea ( r n a e n z y m ea ) r p m ( r e v o l u t i o np e rm i n u t e ) s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) t r i s ( t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) - - a m i n o m e t h a n e ) s( s e c o n d ) v ( v o l t a g e ) 氨卞青霉素 碱基对 牛血清白蛋白 氯化钙 互补d n a 道尔顿 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 小时 千碱基对 千道尔顿 多克隆位点 分钟 信使r n a 开放阅读框 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 核糖核酸酶a 每分钟转数 十二烷基硫酸钠 三( 羟甲基) 氨基甲烷 秒钟 电压 中国海洋人学硕七学位论文 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼i 麴邀直基他益要挂别主盟鲍：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名： 纠住签字日期：叼年月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适 用本授权书) 学位论文作者签名：纠倪 签字日期：叫年占月7 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： i v 导师签字j 么 邮编 电话： 青岛文昌鱼t r a n s f e r r i n 1 i k e 基因的克隆、表达和功能研究 1 前言 第一章文献综述 文昌鱼( a m p h i o x u s ) 是半透明的“鱼形小动物”，是介于无脊椎动物和脊椎动物 之间的过渡类型，属于脊索动物门( c h o r d a t a ) 头索动物亚门( c e p h a l o c h o r d a t a ) 文昌鱼科( b r a n c h i o s t o m i d a e ) ，具有脊索动物门( c h o r d a t a ) 的三大主要特征 脊神经管、脊索和咽鳃裂，其脊索延伸到神经管的前面，故称为头索动物，又因 没有真正的头和脑，故另有无头类之称。在分类学上，文昌鱼与尾索动物亚门 ( u r o c h o r d a t a ) 、脊椎动物亚门( v e r t e b r a t a ) 共同构成脊索动物门。 文昌鱼在对生命科学领域，对包括人类自身在内的脊椎动物发育机制、起源 和进化问题的研究具有其重要而又独特的作用【1 司。因为原索动物文昌鱼在生活 习性、胚胎发育、外部形态和内部结构等方面，即具有某些无脊椎动物的特征， 又具有某些脊椎动物特征的雏形。生物化学方面的研究显示，文昌鱼具有脊椎动 物所具有的磷酸肌酸等物质，但却不具备脊椎动物所有的血红蛋白。而在生殖内 分泌方面，文昌鱼存在原始的生殖内分泌调控轴，即脑泡一哈氏窝一性腺轴。此 外，分子进化研究也揭示出头索动物是脊椎动物的姊妹类群【4 】。因此，文昌鱼是 介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是现存的与脊椎动物最接近的无脊 椎动物。因此，文昌鱼一直被认为是当今研究脊椎动物发育、起源和进化的新型 模式动物 5 , 6 1 。 1 1 文昌鱼的发现、分布和种类 文昌鱼早在5 2 亿年前就已出现，被认为是现存的与脊椎动物最接近的物种。 文昌鱼最早由德国动物学家ps p a l l a s 发现，并定名为l i m a xl a n c e o l a t u s ，为蛞 蝓属。此后，又被意大利动物学家o gc o s t a s u o 所发现，并将其属名更正为 b r a n c h i o s t o m a ，而这一属名沿用至今。后来英国人wy a r r e l l 根据文昌鱼身体细 长而侧扁，两头尖尖的形状，又给出了它的普通英文名a m p h i o x u sl a n c e o l a t u s ( 译 为双头鱼) 做为文昌鱼的总称【7 j 二 文昌鱼有2 9 种，分布在地球热带、亚热带的8 - - 一1 6 米的浅水海域中，包括 青岛文昌鱼t t a n s f e t t i n - l i k e 基因的克隆、表达和功能研究 大西洋、太平洋和印度洋海域在内的北纬4 8 。至南纬4 0 。之间的环形地区内较多。 美国、墨西哥等多个国家都曾报道过盛产文昌鱼，而我国的文昌鱼资源最为丰富， 主要分布在厦门、青岛等海域。我国的文昌鱼有二属三种：一种是文昌鱼属 ( b r a n c h i o s t o m a ) ，包括厦门文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r ig r a y ) 和青岛文昌鱼 ( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a 2 m e s e ) ，另一种是偏文昌鱼属翻s y m m e t r o n ) ，该属 文昌鱼的特点是肌节及鳍条数少，生殖腺分布在身体的一侧。该属中仅舍一种短 刀偏文昌鱼。 1 2 文昌鱼的生活习性、形体结构及胚胎发育 f i 9 1 - 1 t h es h m a t u r e d a m p h i 一( b r a n c h i o s t o r n a b e l c h e r i i s i n g l a u e n s e ) 2 青岛文昌鱼t s a n s f e n l n - l i k e 基因的克隆、表达和功能研究 圈1 - 1 性成熟的文昌鱼 文昌鱼全身粉红，晶莹、半透明状，两头尖尖，4 0 5 7 毫米。前端有眼点， 为视觉器，下为前庭及口( 1 ：3 笠) 。前庭周国有4 0 条口须，咽的两侧有垂直的鳃 裂( 胚胎时只有8 对，而成体后会增加到1 8 0 对) 。文昌鱼的鳃裂被皮肤和肌肉 包裹着，类似一对特殊的“围鳃腔”，因此，鳃裂不直接开孔于体表。文昌鱼的尾 鳍、肛前鳍及背鳍是一层皮膜物，没有真正的骨质鳍条；腹面还有一对皮褶为“腹 褶”。身体两侧交替长有6 5 个透明的v 字形肌节，有利于其在水中向前运动。 f i 9 1 - 2 d i s s e c t i o n o f a m p h i o x u s 圈1 - 2 文昌鱼韵解剖图 o r a lc i n l ，口笠触须；p h a r y n g e a l 百ns l i t s ，咽鳃裂；n 盯v ec o 吐神经管；n o t o c h o r d ，脊 索；g o n a d ，生殖腺：b o d y w a l l m u s c l e s ，体壁肌肉；i n t e m i n e ，肠；a l r i a lc a v 吼围鲴腔；a t r i o p r e ， 围鳃腔孔；拼峙肛门 文昌鱼以简单而典型的形式代表了脊椎动物的发育，把文昌鱼这一简单生物 的发育了解清楚，有助于了解高等脊椎动物较复杂的发育，因此研究文昌鱼的胚 胎发育具有重要意义。文昌鱼的早期发育与棘皮动物类似，从个体发育中可以看 出它与棘皮动物的关系。文昌鱼的胚胎发育从受精卵开始所经历的主要阶段如下 ( 图1 - 3 ) ：受精卵桑椹胚囊胚原肠胚神经胚幼体成 体。 青岛文昌鱼t r a n s f e r r l n - l i k e 基因的克隆、表达和功能研究 j 固， 。 壁塾。飞蠢童皇窖暑壶丢磊一 o ”一蠖底 f i 9 1 - 3 d e v e l o p m e n to f a n l p h i o x u se m b r y oaz y g o t e ，bb l a s t u l a , ce a r l y g a s t r u l a e ，d c u p - s h a p e g a s t r u l a e ，el a t eg a s u m l a c ，f 、6n e u n t l a , h 、i p o s t h a t c h i n g l a r v a e ，jl d l a r v a e 图1 - 3 文昌鱼的胚胎发育。a 受精卵：b 囊胚：c 早期原肠胚：d 杯状原肠胚 e 晚期原肠胚；f 、g 神经胚；h 、l 孵化后幼虫；ji d 幼虫。 文昌鱼受精卵极小为均黄卵。分裂方式为全分裂，且等分裂。受精卵分裂成 许多细胞结成一个实心的桑椹胚。桑椹胚的中心细胞向表面迁移形成囊胚，囊胚 囊胚植物极的大细胞以内陷的方式陷入囊胚腔且和动物极的细胞贴近形成由双 层细胞构成的原肠胚。原肠胚即分化出两个胚层：外胚层和内中胚层。原肠胚期 结束后，开始产生中枢神经系统，并形成中胚层，三个胚层进一步分化成表皮和 神经系统；脊索和肌节以及消化道。 m q 骂 。0 ，l。 青岛文昌鱼t r a n s f e r r i n l i k e 基冈的克隆、表达和功能研究 综上所述，可以看出文昌鱼一方面终生具有脊索、背神经管、鳃裂这些脊索 动物所具有的进步性特征，而且是以最简单的形式表现出来，可以说是一个典型 脊索动物的缩影；另一方面，它又区别于脊椎动物，体制结构具有一系列原始性 特征，表现在：不具脊椎骨、无头无脑、无成对的附肢、无心脏、表皮仅由单层 细胞构成、终生保持原始分节排列的肌节、排泄系统还没有集中的肾脏，只是分 节排列的肾管，而且排泄与生殖器官彼此无联系。所以，从比较解剖学上来看， 文昌鱼是介于无脊椎动物与脊椎动物之间的过渡类型。 此外，从胚胎发育上来看，文昌鱼一方面是以简单的形式近似于脊椎动物的 发育，诸如早期胚胎发育在卵裂，囊胚形成和原肠作用等方面，尤其是在胚胎发 生时出现脊索、神经管和咽鳃裂等方面表现出与脊椎动物胚胎发生相同的特征； 另一方面，其早期发育又与棘皮动物很相似，诸如胚胎有纤毛能游泳等。 但是，现存的文昌鱼具有一系列特化结构，例如：形成了围鳃腔以防止鳃裂 被泥沙所堵塞；具有口笠、口笠触手、缘膜、轮状器官和内柱等一系列特殊的结 构，具有从水流中筛选食物的作用；脊索越过神经管伸到身体最前端，这显然是 和文昌鱼用前端掘泥沙相关。从这些特化结构来看，文昌鱼是走上适应钻泥沙、 少活动的特化道路的一支，而不可能是脊椎动物的直接祖先。 2 转铁蛋白的概述 转铁蛋白是一种由单肽链构成的糖蛋白家族，该家族蛋白主要负责铁离子从 血浆到细胞的运输或是调节生物体液中铁离子的含量。该家族的大多数成员包括 两个同源结构域( n 端和c 端结构域) 这两个结构域由一个短铰链区连接。一 旦蛋白从细胞中分泌出来，n 末端的信号肽区域就会被除去。每个结构域都能够 可逆的结合一个三价铁离子( f e 3 + 离子) ，而c 一端结构域对铁离子的结合更紧 密，释放也比较慢o 】。同时每个区域协同结合一个碳酸盐阴离子，这在其他铁 离子结合分子中是不存在的【1 1 j 。 1 9 4 5 年，h o l m b e r g 矛1 l a u r e l l 首次发现转铁蛋白，作为人血清中f e 3 + 离子的转 运者，其分子量在7 0k d a 到8 0k d a 之间。人血清转铁蛋白( h t f ) 基因长约3 3 5k b ， 其蛋白分子量约为8 0k d a ，h t f 基因含有1 7 个外显子【1 2 1 。血清转铁蛋白主要存在 于哺乳动物的血清中，其主要功能是铁的调节和运输。类似序列也已经在鱼类 青岛文吕鱼t r a n s f e r r i n l i k e 基因的克隆、表达和功能研究 1 3 , 1 4 z 及两栖类中发现【1 5 , 1 6 】。此外，某些可能与血清转铁蛋白有进化同缘关系的分 子也被陆续发现，其中有三类与血清转铁蛋白有较近的亲缘关系：乳转铁蛋白 ( l t f ) ，黑素转铁蛋白( m t f ) ，碳酸酐酶抑制剂( i c a ) ，他们都含有两个完 整的结构域，被认为是由8 5 0 百万年前的基因复制产生的【1 1 7 1 。研究人员还确定出 第四类：卵转铁蛋白( o t f ) ，这种蛋白由鸟类中的血清转铁蛋白基因编码，在 血清和卵清中都存在，不同在于时间上的差异表达和糖基化程度还有位置 1 8 - 2 0 。 转铁蛋白家族成员在无脊椎动物中也存在。在尾索动物海鞘的两个物种 ( c i o n ai n t e s t i n a l & a n dh a l o c y n t h i ar o r e t z i ) 中发现了转铁蛋卧2 1 1 。玻璃海鞘含 有两个结构域，而真海鞘丢失了其c 一端结构域的大部分。在海胆中也发现了类转 铁蛋白( m y p ) 2 2 】，m y p 含有一个完整的n 端结构域，其c 端结构域被一个巨大 的插入片段插入，推测其可能丢失了c 端结构域结合铁离子的能力。在小龙虾、 讯号螯虾中，p a c i f a s t i n 的重链含有三个转铁蛋白结构域【2 3 1 。目前发现在许多昆 虫中也存在转铁蛋白【2 4 。3 1 1 ，多数昆虫中转铁蛋白只有一个完整的n 端结构域，其 c 端结构域产生了很大的变化，可能因此而失去c 端结构域结合铁离子的能力。 血清转铁蛋白由肝脏细胞合成后分泌到血液中，其主要功能是负责铁离子的 运输。血清转铁蛋白基因在其他组织中也有表达，包括：中枢神经系统，睾丸， 卵巢，脾脏，乳腺和肾脏【3 2 都】。一些研究人员还在大鼠的脑中发现了血清转铁蛋 白的m r n a ，推测其可能与中枢神经系统的发育有关3 8 4 0 1 。 另一转铁蛋白家族成员卵转铁蛋白，由鸟类的血清转铁蛋白基因编码，在肝 脏和输卵管中表达，卵转铁蛋白占鸟类卵清蛋白的1 2 ，鸟类卵转铁蛋白与血清 转铁蛋白的不同在于糖基化程度及基因调控等方面【1 9 1 。卵转铁蛋白在卵清中发 挥着抗菌的作用 4 1 , 4 2 】。因此，卵转铁蛋白在鸟类中以组织特异性表达的方式，既 承担着运输铁的职责，又发挥着抗菌的作用。 乳转铁蛋白因其较高的等电点( p h 值8 0 以上) 和更紧密的铁结合能力而与 其他成员相区别【4 3 , 4 4 】。乳转铁蛋白存在于乳液及分泌物如眼泪，唾液等中，被认 为通过竞争微生物生命活动所需的铁而抑制微生物的生长【1 1 , 4 5 】。也有学者认为乳 转铁蛋白的杀菌抗菌作用不仅是通过以上一种途径，女l l e l l i s o n 等报道，乳转铁蛋 白可粘附于细菌胞膜，导致革兰氏阴性菌外膜中脂多糖的释放从而改变胞膜的通 透性，通过改变膜的通透性而使细菌死亡【4 6 | 。 6 青岛文吕鱼t r a n s f e r r i n l i k e 基冈的克隆、表达和功能研究 黑素转铁蛋白存在于多种不同的人类组织中，最初是从黑色素瘤细胞中分离 出来的f 4 7 】。它通过一个糖脂锚定在细胞的表面，这种分子的可溶性形式也己被 鉴定【4 8 1 。虽然黑素转铁蛋白至少包含一个铁离子结合位点，但是还没有相关的 实验证实其是否具有运输铁的功能，或者其他确切的功能仍不明确h 9 1 。有研究 者认为它可能与软骨的形成有关 4 2 , 5 0 - 5 2 】。 2 1 脊椎动物转铁蛋白的结构和生理功能 2 1 1 脊椎动物转铁蛋白的结构 转铁蛋白是一种非血红素结合铁的p 球蛋白，含有6 7 9 个氨基酸残基，分子 量为7 9 k d 5 3 1 。由1 9 对链内二硫键维持其构象，n 端结构域有8 个，c 端结构 域有1 1 个。不同的二硫键对转铁蛋白与金属离子及与受体的结合作用不同。较 暴露的，较易被n a 2 s 0 3 、p c m b 接近而作用的二硫键，主要作用于转铁蛋白 与受体的结合，而维持转铁蛋白结合金属离子的结构所需要的二硫键则可能深藏 于分子内部。分子外部连有三条糖链，其中两条为n 链接的糖连( a s n 4 1 3a n d a s n 6 1 1 ) ，另一条为0 链接的糖链( s e r - 3 2 ) 。转铁蛋白含有两个同源的结构域， 即n 端结构域和c 端结构域，这两个结构域之间由一个短铰链区链接。每个结 构域包含两个由一系列0 【一螺旋及中心的b 折叠构成的亚基，两个亚基相互作用 形成一个深的，亲水的金属离子结合位点。n 端结构域和c 端结构域分别含有 一个铁离子结合位点，分别由四个保守的氨基酸构成，包括：两个酪氨酸，1 个 天冬氨酸和一个组氨酸( n 一末端结构域：天冬氨酸6 3 ，酪氨酸9 5 ，酪氨酸1 8 8 ， 组氨酸2 4 9 ) m 】。此外，还有两个碳酸盐阴离子被协同结合上以维持铁离子的稳 定【5 4 】。周围的氨基酸残基( n 末端结构域：甘氨酸6 5 ，谷氨酸8 3 ，酪氨酸8 5 ， 精氨酸1 2 4 ，赖氨酸2 0 6 ，丝氨酸2 4 8 和赖氨酸2 9 6 ) 被认为可进一步稳定金属 结合位点，以及在释放铁离子的过程中发挥关键作用。例如：已证实位于转铁蛋 白n 端结构域两个亚基上的赖氨酸( 2 0 6 和2 9 6 ) ，当n 。端结构域结合上铁离子 后，这两个氨基酸即通过氢键相互结合形成关闭式构象。当p h 值降低时，氢键 被打开允许亚基旋转形成开放式构象，促进铁的释放【5 引。 脊椎动物的转铁蛋白主要由肝脏细胞合成【5 6 】，其他组织也有表达，包括： 支持细胞5 7 , 5 8 】，室管膜例，少突神经胶质，转移性黑色素瘤细胞系6 1 1 及人乳 7 青岛文吕鱼t r a n s f e r r i n l i k e 基冈的克隆、表达和功能研究 腺癌细胞株【6 2 】。在各种体液中也检测到了转铁蛋白，包括：血浆，胆汁，羊水， 脑脊液，淋巴结和母乳( 6 3 】。血浆中转铁蛋白的浓度是稳定的，在2 9 l 到3 9 l 之 间波动【6 4 1 ，转铁蛋白在体内的半衰期为8 天。转铁蛋白对于维持机体的健康生 长至关重要，当体内转铁蛋白的含量低于o 1 9 l 时，就会增加机体感染的发生 率，并导致生长迟缓和贫血【6 5 1 。 2 1 2 脊椎动物转铁蛋白的生理功能 ( 1 ) 铁结合功能 铁离子对于所有活的有机体都是必需的。d n a 复制过程中的关键酶一核苷酸 还原酶，需要铁离子作为辅因子。血红素同样需要铁离子作为辅因子【6 6 | 。然而， 游离的铁离子可能会对机体造成毒害作用，通过f e n t o n 和h a b e r - w e i s s 反应促 进自由基的形成，从而对组织造成氧化损伤【6 4 】。游离的铁离子可以把氢过氧化 物转换成过氧化氢和烷氧基自由基【6 7 】。此外，铁离子可以促进自动氧化反应， 包括碳水化合物，醛类以及蛋白质的氨基酸等，可促进它们氧化【6 8 。由于这些 原因，铁离子在传递过程中以一种无效的氧化还原反应形式运输而至关重要。因 此，转铁蛋白的主要功能是安全的将铁运输给生长的细胞。 转铁蛋白在结合和释放铁的过程中受到多个因素的影响。包括p h 值，温度， 螯合剂和离子浓度【5 5 】。碳酸盐离子对于维持铁离子结合位点的稳定发挥重要作 用，其他阴离子如氯离子也可以发挥相似的作用。h ee ta 1 等人的研究发现：氯 离子可在p h 中性时阻止铁离子的释放，而在酸性条件下加速铁离子的释放【5 5 | 。 因此，铁的结合和释放是由阴离子及p h 值协同作用的机制调控的。 ( 2 ) 与转铁蛋白受体结合 结合了铁的转铁蛋白可与细胞表面的转铁蛋白受体结合 6 9 】。随后，转铁蛋 白一转铁蛋白受体复合物进入细胞内部并被运送到内涵体。依赖a t p 的质子泵将 h + 泵到内涵体，将其p h 值降到5 5 左右，从而促进铁离子的释放【7 0 】。在低p h 条件下，转铁蛋白受体发生构象变化，但仍与脱铁转铁蛋白相结合，其特点是： 当脱铁转铁蛋白一转铁蛋白受体复合物一旦接触到细胞表面就会将脱铁转铁蛋白 释放【6 9 】。转铁蛋白随着血液循环在合适的条件下再与游离铁结合，然后循环这 一过程。据估计，一个转铁蛋白分子可以参与这一运输周期多达1 0 0 次【_ 7 1 j 。 转铁蛋白受体的类型至少可分为两种：t f r l 和t f r 2 t 6 9 】。t f r l 可在一系列 8 青岛文吕鱼t r a n s f e r r i n 1 i k e 基因的克隆、表达和功能研究 细胞中表达，包括：红细胞，肝细胞，单核细胞和血脑屏障。t f r 2 有两个转录 本( q t f r 2a n dp - t f p 2 ) ，0 【t f r 2 主要由肝细胞表达，1 3 - t f r 2 在各类细胞中有较 低水平的表达【7 2 1 。转铁蛋白受体的表达水平由不同类型的细胞决定。不分裂的 细胞转铁蛋白受体的表达水平极低，而快速增值的细胞( 如癌细胞) 每个细胞可 表达转铁蛋白受体1 0 00 0 0 个之多【6 2 1 。 ( 3 ) 抗菌活性 机体内自由铁离子含量过高的另一后果是，它可以促进病原物的滋长1 7 引。 在人体内，细菌病原物可以通过三种途径吸收铁：一种是释放低分量的含铁细胞： 另一种是积极摄取血红素；还有一种是通过转铁蛋白受体样受体结合含铁转铁蛋 白【5 3 】。病原体会促使游离的铁离子维持较高的水平，从而会加重细菌感染的效 果。例如，遗传性血色病，肝功能衰竭，心血管外科手术，早产和恶性血液病【5 孓5 6 j 。 p a r k k i n e n 等人认为脱铁转铁蛋白结合自由铁离子可作为一种减少感染的手段 1 7 4 。脱铁转铁蛋白的抗菌活性并不仅限于简单的降低游离铁的水平。华龙等【7 5 】 的细菌蛋白酶消化试验表明：含铁转铁蛋白和脱铁转铁蛋白均不能被细菌的胞外 蛋白酶所消化，而且仍具有很强的铁结合能力。转铁蛋白通过与微生物竞争其生 命活动所需的铁而抑制需氧微生物的生长，故而有抑菌的作用。当转铁蛋白被铁 饱和后便丧失了抑菌作用【7 6 】。乳转铁蛋白的抗菌杀菌作用更为突出，大量研究 显示：乳铁蛋白可抑制各种不同类型的革兰氏阴性菌，当蛋白被铁离子饱和后这 种抑制作用便会消失【7 7 1 ，因此推测这种抑制作用是由于乳铁蛋白结合了环境中 的铁，给细菌造成缺铁的环境，从而抑制了细菌的生长。其次，一些研究人员还 发现，当生物体与抗体i g g 或者分泌型i g a 结合后，其乳铁蛋白的抗菌活性会 随之加强，因此推测，抗体可针对细菌的含铁细胞抑制其铁代谢，乳铁蛋白的抗 菌活性会协同增加，比乳铁蛋白单独发挥作用强。但是这一假设还没有得到证实， 这种综合效应也没有得到明确的解释【4 刨。a r n o l d 和a s s o c i a t e s 认为乳铁蛋白对于 一些细菌有直接的杀菌作用，包括：e s c h e r i c h i ac o l i ，v i b r i oc h o l e r a e ，s t r e p t o c o c c u s m u m n s s t r e p t o c o c c u sp n e l i m o n i a