（细胞生物学专业论文）抗人红细胞抗原a和rh（d）噬菌体抗体库的构建及鉴定.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： y9 8 0 5 6 7 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：幺建垒 日期：趔。五理 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大孛有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：磊建垒 日 期： 2 盟：互f l 硕士学位论文岳建华 摘要 摘要 a b o 血型系统和r h 血型系统是人类最为重要的两个血型系统，高度的免疫 原性使它们具有重要的临床意义，尤其是与临床急救输血、器官移植等关系较为 密切。因此，开展a b o 血型及r h 血型抗体的研究对临床血型鉴定、血型理论 研究及应用血型抗体预防和治疗新生儿溶血病等具有重要意义。 近年来，噬菌体抗体库技术已应用于医学和生物学研究诸多领域，通过构建 噬菌体抗体库并通过抗原筛选获得相应的基因工程抗体已成为获得可用于研究、 诊断和治疗的抗体分子的有效途径。 本文首先采用e b 病毒转化外周血b 淋巴细胞的方法，建立永生化细胞系， 为随后开展抗a 抗原噬菌体抗体库提供珍贵的细胞来源。分别采集、分离b 血 型健康人外周血淋巴细胞1 2 份，用e b 病毒进行转化，转化成功率达8 0 。转 化成功的细胞扩大培养后，细胞培养上清液与a 型红细胞盐水悬液凝集结果为 阳性，表明培养上清液中存在抗a 抗体，有些e b v 转化的细胞培养上清与o 型 红细胞光镜下可见弱凝集，显示可能还存在抗h 抗体。 在成功转化并获得可分泌抗a 抗体的淋巴细胞基础上，应用噬菌体抗体库 技术，从分泌抗a 抗体的细胞中扩增抗体可变区基因，经重叠延伸拼接p c r 用 编码连接肽( g l y 4 s e r ) 3 的互补序列构建s c f v 基因，经酶切克隆入载体 p c a n t a b 5 e ，使之呈现于噬菌体表面，其库容为1 2 1 0 6 ，噬菌体d n a 中全 长s c f v 基因的插入率为o 9 0 ，用辅助噬菌体援救后，得到滴度为2 5 2 1 0 ” p f u m l 的初级噬菌体抗体库。以完整a 型红细胞进行四轮淘筛，出现特异性富 集。经细胞e l i s a 、红细胞血凝实验鉴定，得到2 株与a 型红细胞特异结合的 s c f v 噬菌体抗体。 在成功构建抗a 噬菌体抗体库之后，本文还应用噬菌体抗体库技术构建了 人源抗红细胞r h f d ) 抗原单链噬菌体抗体库。构建的噬菌体抗体库，库容为1 2 1 0 7 ，噬菌体d n a 中全长s c f v 基因的插入率为o 8 0 ，用辅助噬菌体援救后， 得到滴度为3 1 0 8p f u m l 的初级噬菌体抗体库。以完整r h + 型红细胞进行四轮淘 筛，出现特异性富集。经d o tb l o t t i n g 鉴定，得到1 7 株与r 上1 + 型红细胞特异结合 堕主堂竺堡壅量堡兰二! 堕星_ 的s c f v 噬菌体抗体。对阳性重组噬菌体进行分泌表达，细胞e l i s a 、免疫斑点 实验及红细胞凝集实验检测分泌抗体的特异性，并对特异性单链抗体进行序列分 析。经鉴定，其中9 株与r h ( d ) 型红细胞特异结合的s c f v 噬菌体抗体，并对阳 性最强的一株进行序列分析。 关键词：噬菌体展示技术； a ； r h ( d ) ； s c f v 硕士学位论文岳建华 a b s t r a c t t h ea b ob l o o dg r o u ps y s t e ma n dt h er hb l o o dg r o u ps y s t e mw e r et h em o s t i m p o r t a n ts y s t e m si nc l i n i c a lt r a n s f u s i o nm e d i c i n ea n do r g a nt r a n s p l a n t a t i o nb e c a u s e o ft h e i ri m m u n o g e n i c i t y s oi tw a si m p o r t a n tt os t u d yb l o o dg r o u ps y s t e ma n dt og e t a n t i a b oa n da n t i r ha n t i b o d i e sf o rt h ep r e v e n t i o no fh a e m o l y t i cd i s e a s eo ft h e n e w b o r n ，e ta 1 p h a g ed i s p l a yl i b r a r yh a db e e nu s e di nm e d i c a la n db i o l o g i c a lf i e l d sr e c e n t l y i t w a sav a l i d a p p r o a c h t o g e ta n t i b o d y t o s t u d y , d i a g n o s e a n dt r e a t ，t h r o u g h c o n s t r u c t i n gp h a g ed i s p l a yl i b r a r ya n da i mt oh a v ea n t i b o d i e sb yp a n n i n gt h el i b r a r y a tf i r s t ，t h ep a p e ru s e de bv i r u st r a n s f o r m a t i o nt e c h n i q u et oc o n s t r u c ti m m o r t a l c e l ll i n e s ，w h i c hc o u l dp r o v i d ec e l l st oc o n s t r u c tp h a g ed i s p l a yl i b r a r yo fa n t i - a b l y m p h o c y t e sw e r ei s o l a t e do fh e a l t h yp e o p l ea n dt r a n s f o r m e db ye bv i r u s w h e nt h e bc e l l sw e r et r a n s f o r m e d ，t h e i rs u p e r t a n tw e r ea s s a y e db ya g g l u t i n a t i o n t h ep a p e r h a dt r a n s f o r m a e d12s a m p l e s ，t h e e i g h t yp e r c e n ts a m p l e sw e r es u c c e s s e d t h e s u p e r t a n to ft r a n s f o r m e dd i s p l a y e da g g l u t i n a t i o nw i t ha r e dc e l l s ，s e v e r no fw h i c h c o u l da g g l u t i n a t eor e dc e l l s c o m b i n e de bv i r u st r a n s f o r m a t i o nt e c h n i q u ew i t hp h a g e d i s p l a yl i b r a r y t e c h n i q u e s ，i s o l a t i o no ft o t a lr n af r o mbl y m p h o b l a s t o i dc e l ll i n e ss e c r e t i n ga n t i - a a n f i b o d ns y n t h e s i so ff i r s ts t r a n dc d n a ，a m p l i f i e dv ha n dv hg e n eb yp c r ， c o n s t r u c t e ds i n g l e c h a i nv a r i a b l ef r a g m e n t ( s c f v ) g e n eb ys p l i c i n go v e r l a pe x t e n s i o n ( s o e ) ，s c f vg e n e sw e r ec l o n e di n t ov e c t o rp c a n t a b 5 e ，t r a n s f o r m e do f e c o l it g l c e l l sa n dr e s c u e dw i t hm 1 3 k 0 7 h e l p e rp h a g et oc o n s t r u c tt h es c f v d i s p l a y i n gp h a g e l i b r a r y p h a g ed i s p l a yl i b r a r y , w i t hs i z eb e i n g1 2 10 。w a so b s t a i n e d t h e p e r c e n t a g eo ff u l l - l e n g t hs c f vg e n ei n s e r t e di n t op h a g ed n a w a s0 9 0 r e s c u e db y h e l p e rp h a g e ，ap h a g es c f vl i b r a r yw i t ht i t e ro f2 5 2 x1 01 0 p f u m lw a se s t a b l i s h e d s p e c i f i cp h a g es c f vw e r ea c q u i r e da f t e r4r o u n d so fp a n n i n g ，2c l o n e se x h i b i t e d s p e c i f i cb i n d i n gt oa c e l lw e r ei d e n t i f i e db yc e l le l i s aa n da g g l u t i n a t i o n a f t e r c o n s t r u c t i n g a n t i ap h a g e d i s p l a yl i b r a r y , t h ep a p e rh a d a l a o c o n s t r u c t e daa n t i - r h ( d ) p h a g e d i s p l a yl i b r a r y i t ss i z ew a s1 2 1 07 ，t h e p e r c e n t a g eo ff u l l l e n g t hs c f vg e n ei n s e r t e di n t op h a g ed n a w a so 8 0 r e s c u e db y h e l p e rp h a g e ap h a g es c f vl i b r a r yw i t ht i t e ro f3 10 5p f u m lw a se s t a b l i s h e d s p e c i f i cp h a g es c f v w e r ea c q u i r e da f t e r4r o u n d so fp a n n i n gu s e di n t a c tr e dc e l l s ，17 c l o n e se x h i b i t e ds p e c i f i cb i n d i n gt or h + c e l lw e r ei d e n t i f i e db yd o tb l o t t i n g t h e p o s i t i v er e c o m b i n a n tp h a g e sw e r ee x p r e s s e db ys o l u b l e t h ep o s i t i v ep h a g ew e r e a s s a y e df o rs p e c i f i c i t yb yc e l le l i s a 、d o t b l o t t i n ga s s a ya n da g g l u t i n a t i o n ，9 p o s i t i v ep h a g ew e r ea q u i r e d o n ec l o n ew i t hh i g h e s ta c t i v i t yw a sc h o s e n d n a s e q u e n c eo fi t ss c f vg e n e sw e r ed e t e r m i n e d 3 堡主堂垡丝苎鱼垄兰型! ! 竺 k e y w o r d s ：p h a g ed i s p l a yt e c h n o l o g y ；a ：r h ( d ) ；s c f v 4 硕士学位论文岳建华 前言 前沿动态 噬菌体展示技术将外源蛋白的基因型和表型联系在一起，并且能够通过噬 菌体感染大肠杆菌来大量扩增所筛选的噬菌体，从而可以获得大量的特异性抗 体。随着对噬菌体生物学的不断深入研究和d n a 重组等现代分子生物学技术的 飞速发展，近年来噬菌体展示技术也得到了不断地改进和完善。 噬菌体抗体库技术是将噬菌体展示技术应用于抗体库技术所取得的一大进 展，它绕过了杂交瘤这一技术难关，甚至可以不经免疫，直接利用抗原从库中筛 选出特异性单抗，使人源性单抗的制备获得重大突破。目前通过该技术已成功制 备出多种肿瘤抗体及自身免疫抗体。 a b o 血型系统是最早被发现的人类血型系统，高度的免疫原性使其具有重 要的i 临床意义，尤其是与临床急救输血、器官移植等关系较为密切。开展a b o 血型系统抗体的研究对临床a b o 血型鉴定、血型理论研究等具有重要意义。目 前抗a 抗体大多为鼠源抗体，在临床研究上受到限制。 r h 抗原是人类较为复杂的红细胞血型系统，其免疫原性仅次于a b o 血型系 统具有重要的临床意义。r h 系统至少有4 5 种不同的抗原，与临床相关的主要有 d 、c 、e 、c 、e5 种，其中d 抗原最重要。当r h 阴性的个体由于输血接触d 抗 原后，或母婴r h 血型不合时，在受血者或母体内便可产生抗r h ( d ) 的抗体，导致 发生输血反应或新生儿溶血病。因此，需制备抗r h ( d ) 抗体作为诊断试剂用于红 细胞血型的鉴定，或作为生物制剂用于预防和治疗新生儿溶血病。抗r h ( d ) 抗体 制备技术经历了多克隆抗体、单克隆抗体，发展到基因工程抗体阶段，使抗体的 制备、性能和生产等均有了根本的改观，其中最突出的进展是噬菌体抗体库的建 立。m a r k 等分离到抗d 的s c f v 片段，借助s c f v 中的c m y c 肽标签交联后，该 s c f v 能特异凝集r 圹红细胞。l i b y h 等将人c 4 结合蛋白( c 4 b p ) 的c 末端q 亚 单位与抗ds c f v 蛋白融合获得了多嵌合抗d 片段，此片段不但能直接凝集胰酶 处理的d 阳性红细胞，而且能凝集天然d 阳性细胞。 研究目的 硕士学位论文岳建华 1 构建抗a 噬菌体抗体库筛选人源抗as c f v ； 2 构建抗r h ( d ) 单链噬菌体抗体库； 3 应用噬菌体抗体库技术，从中筛选抗d 的s c f v 片段 4 在大肠杆菌中分泌表达抗ds c f v 片段。 实验设计 1e b 病毒转化b 淋巴细胞建立永生化细胞系 2r t - p c r 克隆抗体可变区基因； 3s o e 拼接s c f v ： 4s c f v 在大肠杆菌中的融合表达； 5 特异性抗体分子的筛选； 6 在大肠杆菌中分泌表达s c f v 片段： 7 表达产物的活性检测。 实验方法 1e b 病毒转化b 淋巴细胞建立永生化细胞系，光镜观察细胞的生长状况， 红细胞凝集实验检测细胞培养上清： 2 提取阳性细胞总r n a ，合成c d n a 第一条链； 3 设计人抗体可变区基因引物，多次p c r 扩增抗体可变区基因片段； 4 通过s o e 将v h 和v l 可变区基因片段拼接成s c f v ； 5s c f v 与噬菌体抗体表达载体p c a n t a b 5 e 相连，感染e c o l it g l ，经辅助 噬菌体m 1 3 k 0 7 援救，构建噬菌体抗体库； 6 使用完整红细胞对噬菌体抗体库进行4 轮“吸附洗脱一扩增”的淘筛，筛 选特异性噬菌体抗体： 7 特异性噬菌体抗体感染e c o l i h b2 1 5 1 ，加入i p t g 诱导可溶性s c f v 片段 的分泌表达； 8 表达产物的检测：细胞e l i s a 、免疫斑点，红细胞凝集实验对分泌表达上 清进行鉴定； 9 特异性噬菌体抗体的序列分析。 硕士学位论文岳建华 前言 实验结果 第一部分 1 经e b 病毒转化成功的b 淋巴细胞，光镜下可见细胞体积明显增大，圆形 或类圆形，且形成多个大小不等的细胞团。红细胞凝集实验证实上清中存在相应 的抗a 抗体。 2 从上述与a 型完整红细胞血凝实验为阳性的转化细胞中提取总r n a ，电 泳后呈明显的3 条带，即2 8 sr r n a ，1 8 sr r n a 和5 sr r n a 。a 2 6 0 。a 2 8 0 r i m 的比 值为2 2 2 3 ，可用于r t - p c r 扩增抗体可变区基因。 3 以e d n a 第一链为模板，扩增出抗a 抗体的可变区基因片段：3 组v h c m 基因，3 组v ，c 。组基因，分子大小约为7 0 0b p 。以上述产物为模板，进行半巢 式p c r ，扩增出3 组v h 基因和6 组v 。基因，分子大小约为4 0 0b p 。v h 和v 。 经s o e ，拼接成1 4 组s c f v 基因，分子大小约为8 0 0b p ，与理论估计值大小一致。 4 随机挑取1 0 个转化的单菌落提取质粒，琼脂糖凝胶电泳显示其中9 个转 化子含有s c f v 基因，s c f v 基因的插入率为0 9 0 。以这些质粒为模板，使用s c f v 两端混合引物进行p c r 扩增，均有约8 0 0b p 的目的条带出现；对这些质粒进行 双酶切，也见有约8 0 0b p 的外源插入片段。 5s c f v - 载体转化e c o l it g l 后，铺板测定其库容为1 2 1 0 6 。重组噬菌体加 入m 1 3 k 0 7 援救后，得到滴度为2 5 2 x1 0 1 0 p f u m l 的初级噬菌体抗体。 6 随机挑取第四轮筛选产物5 6 个克隆，制备单个克隆噬菌体抗体。分别以a 型、b 型、o 型完整红细胞为抗原，细胞e l i s a 检测5 6 株噬菌体抗体的抗原结 合活性显示，其中有2 株与a 型红细胞具有较高的结合活性，而与b 型、o 型 红细胞结合活性很低。血凝实验结果显示，这2 株噬菌抗体上清与a 型红细胞呈 现凝集反应，与b 型、o 型红细胞无凝集活性。 第二部分： 1 分泌抗r h ( d ) 抗体的细胞提取总r n a ，每5x1 0 6 个细胞可得r n a 4 - 1 0 , u g ， 总r n a 琼脂糖凝胶电泳时也可见明显的3 条带，a 2 6 0 m n a 2 8 0 m n 的比值为1 8 - 2 0 ， 说明提取的总r n a 完整且纯度好。 2 以e d n a 第一链为模板，扩增出1 组v h c h l 、1 组v 。c 。组基因和1 组v 。一c 。基因，分子大小约为7 0 0 b p 。以上述产物为模板，扩增出l 组v h 基因、4 硕士学位论文岳建华 前言 组v 。基因和2 组v 。基因，分子大小约为4 0 0 b p 。v h 和v l 拼接成6 组s c f v 基因， 分子大小约为7 8 0 b p 。 3s c f v 载体转化e c o l i t g l 后，铺板测定其库容为1 2 1 07 。重组噬菌体加 入m 1 3 k 0 7 援救后，得到滴度为3 x 1 0 8 p f u m l 的初级抗a 噬菌体抗体库。 4 从初级噬菌体抗体克隆中随机挑取1 0 个克隆， 电泳结果显示s c f v 基因 的插入率为0 8 0 。以这些质粒为模板，使用s c f v 两端混合引物进行p c r 扩增， 均有约8 0 0 b p 的目的条带出现；对这些质粒进行双酶切，也见有约8 0 0 b p 的外源 插入片段。 5 在每轮筛选前使用完整r h 一红细胞进行3 次预吸附，然后用完整o 型r h + 红细胞进行“吸附洗脱一扩增”的筛选，通过4 轮淘筛，洗脱的噬菌体滴度 呈明显的增加趋势，噬菌体抗体得到约2 0 倍的富集。 6 随机挑取第四轮筛选产物4 0 个克隆，制各单个克隆噬菌体抗体。分别以 r h + 型、r h 一型完整红细胞为抗原，免疫印迹检测4 0 株噬菌体抗体的抗原结合活 性显示，其中有1 7 株与r h + 型红细胞具有较高的结合活性，而与r h 一型红细胞 结合活性很低。 7 将特异性噬菌体感染e c o l ih b 2 1 5 1 ，诱导可溶性s c f v 片段的分泌表达， 经细胞e l i s a 、免疫印迹实验及红细胞凝集实验鉴定，其中9 株噬菌体抗体上清 可与r h ( d ) 型红细胞特异结合。对阳性最强的一株进行序列分析，结果表明，v h 属于人免疫球蛋白v h 4 基因家族，碱基同源性为9 5 9 ，氨基酸同源性为9 2 8 ， 差异主要集中在c d r 3 区。轻链v 区属于人免疫球蛋白k 链基因家族，c d r l 、 c d r 2 、c d r 3 区均存在氨基酸差异。 结论 e b v 转化b 淋巴细胞联合噬菌体抗体库技术可用于噬菌体抗体库的构建。 经过4 轮“吸附一洗脱一扩增”的筛选，特异性噬菌体抗体得到富集，细胞e l i s a 及免疫斑点结果显示，噬菌体抗体上清可与相应的抗原结合，提示噬菌体抗体库 技术对于人源性抗体的研制有重要价值。 硕士学位论文岳建华 文献综述 第一部分文献综述 第一章噬菌体展示抗体的研究进展 噬菌体表面展示技术是将编码外源蛋白或多肽的基因片段与噬菌体衣壳蛋 白基因融合，使外源蛋白或多肽呈现于噬菌体衣壳蛋白表面的一项技术。外源序 列在噬菌体外膜蛋白的适当位置插入后，就可以展示在噬菌体的表面。更重要的 是噬菌体展示技术能将外源蛋白的基因型和表型联系在一起，并且能够通过噬菌 体感染大肠杆菌来大量扩增所筛选的噬菌体，从而可以获得大量的特异性抗体。 该技术已被应用到几乎生物学研究的每一个学科，被展示的蛋白有抗体、抗体片 断、细胞因子、生长激素、病毒的外壳蛋白等。该技术的出现和发展是建立在对 丝状噬菌体的结构、基因组和生活周期等生物学深入研究的基础之上。 1 丝状噬菌体的生物学特点 丝状噬菌体基因组是一单链环状d n a ，长约6 4 0 7 - 6 4 0 8 个核苷酸，有1 0 个 基因，分别编码1 0 个蛋白质。其基因组的柔性很大，可以容纳很大的外源插入 片断而不影响它的复制和包装。柔性长丝状的噬菌体由外壳蛋白包裹d n a 构成， 直径为6 n m ，长度约l # m 。野生型丝状噬菌体的主要外壳蛋白是基因编码p 蛋白，有2 8 0 0 个拷贝，围绕基因组d n a 螺旋对称排列成长管，长管的一端是 各为5 个拷贝的次要外壳蛋白p i h 和p v i ，分别由基因i 和基因编码，长管的 另一头是基因和编码的次要外壳蛋白p v l i $ 口p i x ，它们对于噬菌体组装的起 始和维持其稳定是必须的。成熟的噬菌体非常稳定，能够耐受7 0 。c 的温度3 0 r a i n 和抵抗o 2 n 的盐酸。噬菌体的这些特点对于噬菌体展示技术的成功应用起着非 常重要的作用。 丝状噬菌体只能感染具有f 性纤毛的革兰氏阳性大肠杆菌。位于丝状噬菌体 末端的p i h 蛋白参与了噬菌体病毒颗粒对细菌f 纤毛的识别和吸附。p m 蛋白有 3 个结构域，它们分别由6 8 、1 3 1 和1 5 0 个氨基酸组成，分别由含1 8 个和含3 9 个氨基酸组成的富含甘氨酸的连接肽相连。第一、二个结构域即n 1 、n 2 与噬菌 体锚定到大肠杆菌f 纤毛上然后穿透细胞膜有关，第三个结构域是c 端结构域 即c t ，与p 8 相互作用形成噬菌体颗粒的尾部。 硕士学位论文岳建华 文献综述 噬菌体的生活周期，它首先是通过其p i i i 蛋白连接到细胞受体上启动感染。 s s d n a 注入细胞后，就利用宿主的聚合酶合成一条互补链，从而形成双链d n a ， 又成为复制型d n a 。接着，宿主细胞会合成1 0 种噬菌体编码的蛋白，包括结构 蛋白( p i i 、p v i 、p v l 、p a n dp i x ) 、组装及输出蛋白( pia n dp l v ) 和复制蛋 白( p i i 、p va n dp x ) 。这些蛋白的表达水平是通过启动子的强弱来调节的，如： 大量需要的蛋白p 基因受强启动子调节而其它蛋白( p i i i ) 受较弱的启动子的 控制。 2 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术最初出现于1 9 8 5 年，是将蛋白分子或多肽片段的基因克隆 到丝状噬菌体的基因组d n a 中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使该 异源分子呈现于噬菌体表面。噬菌体展示技术将选择能力和扩增能力联系到 起，即通过与配体的结合从数量众多的多样化群体中选择出表达有相应配体的噬 菌体，再通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体得到扩增。这一特点使噬菌体展示 成为极为有效的筛选体系。 应用噬菌体展示技术进行抗体研究，其最大的优点是可以大量的扩增目的抗 体，而且此操作过程容易、成本低。然而噬菌体的任何一个生物学过程都会影响 外源抗体的成功展示，如：密码子在蛋白质合成过程的效率；融合蛋白对内膜的 插入；信号肽正确有效的切割；病毒粒子的正确组装；病毒的稳定性；噬菌体与 宿主细胞受体的有效连接以及感染后病毒粒子的正确释放等1 4 j 。 外源蛋白除可展示于噬菌体的p i i i 矛 1p v l p b ，也有以噬菌体的其它蛋白( p i x ) 进行展示的报道5 。当然，目前用得最多的是p i i i 矛op v ! i i 展示系统。 噬菌体抗体不仅可用于发病机制的研究，还可用于疾病的诊断和治疗，具有 广阔的应用前景。扩增免疫球蛋白的可变区构建特异性抗体库可以反映参与某一 疾病过程的抗体分子的多样性，有可能成为描述机体免疫系统在疾病过程中的反 应特点的手段，而且不需要很大的库容就有可能得到针对某一病原或自身抗原的 高亲和力体分子驯。 随着对噬菌体生物学的不断深入研究和d n a 重组等现代分子生物学技术 的飞速发展，近年来噬菌体展示技术也得到了不断地改进和完善。由于在噬菌体 表面展示的抗体可以与相应的结合分子相识别而发挥其生物活性，因而该技术在 硕士学位论文岳建华文献综述 分子间识别机理的研究，特别是抗原表位分析、受体与配体结合位点确定、蛋白 质改造以及先导化合物筛选、疫苗的研制等方面具有广泛的应用前景。 3 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是将噬菌体展示技术应用于抗体库技术所取得的一大进 展，它绕过了杂交瘤这一技术难关，甚至可以不经免疫，直接利用抗原从库中筛 选出特异性单抗，使人源性单抗的制备获得重大突破 1 0 , 1 1 】。目前通过该技术已成 功制备出多种肿瘤抗体及自身免疫抗体f 】2 】。 噬菌体抗体库技术实际上是丝状噬菌体展示技术与抗体组合文库技术相结 合而成，该技术的出现开创了一条简便快捷的基因工程抗体生产路线，为人源抗 体的制备提供了新途径，是抗体工程的里程碑 1 3 , 1 4 】。尤其是通过构建大容量、具 有良好多样性的天然抗体库或半合成抗体库可以解决弱抗原、自身抗原的免疫效 果差以及不能对人体进行任意免疫等问题，已经实现了不经免疫而直接制备多种 人抗体州。 3 1 噬菌体抗体库技术在人源抗体制备中的应用 噬菌体抗体库技术不需要进行细胞融合绕过杂交瘤技术，解决了人体杂交 瘤低效的难题，为人源抗体的制备提供了有效手段。用抗体库技术制备人单抗有 三条途径：从免疫后个体获取淋巴细胞建库筛选。由于这些抗体库的构建取材 于体内免疫者的淋巴细胞，在体内经过抗原选择和亲合力成熟，因此从较小库容 的抗体库就能较容易地筛选到特异性强的高亲和力抗体。不经免疫制备人源抗 体。抗体库技术可以模拟体内抗体生成过程，提供了不经免疫制备抗体的可能。 鼠单抗人源化。传统的鼠单抗人源化包括构建人一鼠嵌合抗体，及通过c d r 移植和计算机分子模建进行可变区人源化，但所改造的抗体或多或少仍保留一些 鼠源序列。抗体库技术问世后，可优化人改型抗体。也可利用此技术，以鼠单抗 的可变区为模板，通过抗原导向，选择能模拟鼠单抗结合部位的人单抗。 3 2 应用噬菌体抗体库技术改良抗体性能 在抗体库技术出现之前，抗体的基因改造主要通过删除或引入某些明确功能 的特定序列进行结构改造，而难以改造抗体与抗原的结合性能。抗体库技术的进 展使人们对抗体的改造能力提高到了新的层次，能够以某些特定性能为目标，在 尚不知道具有该性能的肽段的一级结构的情况下，通过突变一建库筛选，获得具 硕士学位论文岳建华 文献综述 备该性能或使该性能得到改善的未知序列。这一从利用已知序列到筛选未知序列 的飞跃使基因工程抗体的制各能力大为提高。对抗体性能的改良主要有以下几方 面： 3 2 1 改善s c f v 接头的功能 s c f v 是目前报道最多，有明确使用前景的一类小分子抗体，它由抗体识别 抗原的最小单位f v 段组成。f v 由重链可变区和轻链可变区以非共价键结合在一 起，稳定性较差。用一短肽接头将v n 和v l 首尾相接形成s c f v ，由于是单肽链， 其稳定性及可操作性均优于f v 段。所用的接头对s c f v 的活性很重要，必须不影 响f v 的构象。目前已发表了多种成功的接头序列，其中最常用的是( g g g g s ) 3 ， 但不同的抗体有所差别。 3 2 2 提高抗体的表达量 用大肠杆菌表达抗体分子片段为基因工程抗体的制备提供了一条有效的途 径，但不同的抗体分子在大肠杆菌的表达可有很大的差异，些抗体表达产量低、 可溶性差，这可能和肽链折叠不当、形成不可溶性聚合体有关。对抗体分子的某 些残基进行定位突变，有可能改善其折叠，提高表达量，但往往很难确定应对哪 些残基进行突变。抗体库技术为解决这一难题提供了有效的方法。c o i a 等”6 】构 建并表达了一株抗乙肝病毒表面抗原的s c f v ，其在大肠杆菌的分泌表达量仅为 1 0 n g m l 。他们将表达载体在致突变株( m u t d 5 一f i t 和x l l r e d ) 中进行5 轮繁 殖生长引入随机突变，建立了噬菌体抗体库，经5 轮筛选后，获得了表达量提高 了1 0 倍的变种。 3 2 3 改善抗体分子的特异性。 与抗原特异性结合是抗体最重要的生物学特性，对抗体与抗原结合特性的改 良，如消除交叉反应或扩展抗体的结合范围，将大大扩展人们制备基因工程抗体 的能力。s a v i r a n t a 等旧报道了一个消除交叉反应的例子，他们通过杂交瘤技术 获得了一株性能良好的抗1 7 一b 一雌二醇的单抗，但由于1 7 - 0 一雌二醇和睾丸酮 的分子结构非常相近，这株单抗对睾丸酮产生交叉反应而影响其使用价值。作者 在大肠杆菌中表达了这株单抗的f a b 段，通过错配p c r 在v h 引入了随机突变， 构建了噬菌体抗体库，用高浓度的游离睾丸酮作为竞争剂，对固相化1 7 - b 一雌二 硕士学位论文岳建华 文献综述 醇进行筛选，获得了交叉反应降低2 0 倍的变种。 3 3 不经免疫制备抗体 噬菌体抗体库技术可以模拟体内抗体生成过程，使不经免疫制各抗体成为可 能，体内抗体生成过程的关键有三点：多样性的b 细胞群体、克隆选择、亲和 力成熟。抗体库技术所具有的强大筛选能力和抗体性能改良能力，使不经免疫制 备抗体成为可能。 抗体库技术的发展和应用为抗体技术领域带来了巨大的变化：人源性抗体的 制备问题得到了解决，是当前制备人抗体的种有效手段，特别是通过构建大容 量的天然抗体库或半合成抗体库已经实现了不经免疫而直接制各多种人抗体。 4 结语 噬菌体抗体库技术在它问世后的短短几年时间里就显示出强大的生命力，该 技术一出现即被认为是抗体工程领域的革命性进展，已被广泛应用于构建筛选特 异性单链、单区或更小片段的抗体，并成为不经过免疫获取特异性人源抗体的重 要手段。虽然它仍处于一个尚需完善的阶段，但随着一些技术的创新，人们可以 更大程度上根据需要制备和改造抗体。 参考文献 1 】 r o d id j ，m a k o w s k il p h a g e d i s p l a yt e c h n o l o g y f i n d i n gan e e d l ei nav a s t m o l e c u l a rh a y s t a c k j c u r ro p i nb i o t e c h n 0 1 1 9 9 9 ，1 0 ( 1 ) ：8 7 9 3 2 w i l s o nd r ，f i n l a yb b p h a g ed i s p l a y ：a p p l i c a t i o n s ，i n n o v a t i o n s ，a n di s s u e si n p h a g ea n dh o s tb i o l o g y j c a nj m i c r o b i 0 1 i9 9 8 ，4 4 ( 4 ) ：313 3 2 9 3 r a s c h e di ，o b e m re f fc o l i p h a g e s ：s t r u c t u r a la n df u n c t i o n a lr e l a t i o n s h i p s 叨 m i c r o b i o lr e v ，1 9 8 6 ，5 0 ( 4 ) ：4 0 1 - 4 2 7 4 r o d id j ，m a k o w s k il p h a g e d i s p l a yt e c h n o l o g y f i n d i n gan e e d l ei nav a s t m o l e c u l a rh a y s t a c k j c u r ro p i nb i o t e c h n 0 1 1 9 9 9 ，1 0 ( 1 ) ：8 7 9 3 5 s i d h us s e n g i n e e r i n gm 1 3f o rp h a g ed i s p l a y j b i o m o le n g 2 0 0 1 ， 18 ( 2 ) ：5 7 - 6 3 【6 1 g a oc ，m a os ，k a u f m a n nge ta 1 am e t h o df o rt h eg e n e r a t i o no f c o m b i n a t o r i a la n t i b o d yl i b r a r i e su s i n gp i xp h a g ed i s p l a y j p r o cn a t la c a d 】3 硕士学位论文岳建华文献综述 7 8 9 1 0 1 2 1 3 1 4 】 1 5 1 6 【1 7 s c iu s a 2 0 0 2 ，9 9 ( 2 0 ) ：1 2 6 1 2 1 2 6 1 6 f u hg ，p i s a b a r r om t ，l iy ，e ta 1 a n a l y s i so fp d z d o m a i n l i g a n di n t e r a c t i o n s u s i n gc a r b o x y l - t e r m i n a lp h a g ed i s p l a y j jb i o lc h e m 2 0 0 0 ， 2 7 5 ( 2 8 ) ：2 1 4 8 6 2 1 4 9 1 b e n h a ri b i o t e c h n o l o g i c a la p p l i c a t i o n so f p h a g ea n dc e l ld i s p l a y j b i o t e c h n o la d v 2 0 0 1 ，1 9 ( 1 ) ：1 - 3 3 h o o g e n b o o mh r ，c h a m e spn a t u r a la n dd e s i g n e rb i n d i n gs i t e sm a d eb y p h a g ed i s p l a yt e c h n o l o g y j i m m u n o lt o d a y , 2 0 0 0 ，2 1 ( 8 ) ：3 7 1 3 7 8 h u s t o nj s ，g e o r g ea j e n g i n e e r e da n t i b o d i e st a k ec e n t e rs t a g e j h u m a n t i b o d i e s ，2 0 0 1 ，1 0 ( 3 - 4 ) ：1 2 7 1 4 2 s h a r i f ij ，k h a w l il a ，h up ，e ta 1 c h a r a c t e r i z a t i o no fa p h a g ed i s p l a y e d - d e r i v e d h u m a nm o n o c l o n a la n t i b o d y ( n h s 7 6 、c o u n t e r p a r tt oc h i m e r i cn q t _ 1d i r e c t e d a g a i n s t n e c r o t i c r e g i o n s o fs o l i dt u m o r s j h y b r i dh y b r i d o m i c s ，2 0 0 1 ， 2 0 ( 5 6 、：3 0 5 312 s c h e f f e rg l ，r e u r sa w ，j u t t e nb ，e ta 1 s e l e c t i o na n dc h a r a c t e r i s a t i o no fa p h a g e d i s p l a y e dh u m a na n t i b o d y ( f a b ) r e a c t i v et ot h el u n gr e s i s t a n c er e l a t e d m a j o rv a u l tp r o t e i n 忉b rjc a n c e r , 2 0 0 2 ，8 6 ( 6 ) ：9 5 4 9 6 2 h o o g e n b o o mh r ，d e - b e u i n ea p , h u r o ns e ，e ta 1 a n t i b o d yp h a g ed i s p l a y t e c h n o l o g ya n d i t sa p p l i c a t i o n j i m m u n o t e c h n o l o g y , 1 9 9 8 ，3 ( 4 ) ：1 6 9 1 7 6 g r f f i t h sa d ，d u n c a na r s t r a t e g i e sf o rs e l e c t i o no fa n t i b o d i e sb yp h a g e d i s p l a y j c u r ro p i nb i o t e c h n o l ，1 9 9 8 ，9 ( 1 ) ：1 0 2 1 0 8 w e i n e rl m ，a d a m sg p n e wa p p r o a c h e st oa n t i b o d yt h e r a p y j o n c o g e n e ， 2 0 0 0 ，1 9 ( 5 3 ) ：6 1 4 4 6 1 5 1 c o i ag ，a y r e sa ，l i l l e yg g ，e ta 1 u s eo fm u t a t o rc e l l sa sam e