（细胞生物学专业论文）铅、钙及其复合对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响.pdf

铅、钙及其复合对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响 细胞生物学专业 研究生张英慧指导教师韩善华 研究了不同浓度氯化铅溶液对蚕豆种子萌发，赧生长，细胞分裂，微核和 染色体畸变的影响。结果表明：1 1 酽5 1 0 4 m o l l p b 2 + 处理第1 、2 天，蚕 豆种子的萌发率比对照稍微高一些，而培养第3 、4 天则和对照相当，1 1 矿 5 x 1 0 4 m o l l p b 2 + 对蚕豆种子的萌发并没有显著影响。p b 2 + 对蚕豆根尖生长产生 抑制作用，随着浓度增加，根的生长速率递减，随着处理时间延长，每单位时 间的根生长速度递减或停止。根尖细胞有丝分裂指数随p b 2 + 浓度的增高和处理 时间的延长而递减。不同浓度p b 2 + 都能引起微核和染色体畸变，微核率和染色 体畸变率随着p b “浓度的增高而递增。 还研究了不同浓度氯化钙溶液对蚕豆种子萌发，根生长，细胞分裂，微核 和染色体畸变的影响。结果表明：1 1 0 4 5 1 0 。3 m o l 几c e + 对蚕豆萌发没有 影响，当c a 2 + 浓度超过l 1 0 2 m o l l 后，随着c a 2 + 浓度的增高，蚕豆萌发速度 降低，但不影响最终萌发率；l 1 0 1 1 l o - 2 m o l lc a 2 + 能不同程度促进蚕豆 根生长和细胞分裂，其中5 1 0 4 m o l lc a 2 + 处理的蚕豆根长和有丝分裂指数最 高，而后随着c a 2 + 浓度继续增高，根生长和细胞分裂速度开始下降，甚至受到 抑制。1x 1 0 。4xl o - 2 m o l lc a 2 + 对蚕豆根尖细胞的微核率和染色体畸变率没有 显著影响。 最后研究了不同浓度的氯化铅、氯化钙复合对蚕豆种子萌发，根生长，细 胞分裂，微核和染色体畸变的影响。结果表明：l 1 0 1 1 x 1 0 o l lc a 2 + 能有 效地消除蚕豆的铅中毒症状，促进蚕豆根生长，提高根尖细胞有丝分裂指数， 降低微核率和染色体畸变率，其中5 1 0 一l 1 0 2 m o l lc a ”的效果非常明显。 c a “浓度增大，不利于去毒害，尤其是4 l o - 2 m o l l c a 2 + 加深了p b ”的毒害作用， 抑制蚕豆根生长，降低根尖细胞有丝分裂指数，虽然降低了微核率和染色体畸 变率，但这并不能简单地说明4 l o - 2 m o l l c a ”具有去铅毒害的作用，原因在于 在很低的细胞分裂水平下不能正确地反映染色体畸变应有的水平。 关键词：铅：钙；蚕豆；有丝分裂；微核；染色体畸交 i i e f f e c t so fp b 2 + ，c a 2 + ，p b 2 + & c a 2 + o nc e l ld i v i s i o no f r o o tt i p s o fy i c i af a b a m a j o r ：c e i i b i 0 i o g y n a m e ：z h a n gy i n g h u it u t o r ：h a ns h a n h u a t h ee f f e c t so fp b 2 + s o l u t i o no fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so ns e e d g e r m i n a t i o n ， r o o t l e n g t h m i t o t i ci n d e x ，m i c r o n u c l e u sf r e q u e n c ya n d c h r o m o s o m a la b e r r a t i o nf r e q u e n c yo fr o o tt i pc e l l so fv i c i af a b aw e r e s t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tw h e ns e e d sw e r et r e a t e dw i t hl 1 0 。5 1 0 。m o l l p b 9a f t e r1a n d2d a y s 。t h eg e r m i n a t i o np e r c e n t a g eo fs e e d s w e r e1 i g h t l yi n c r e a s e d b u t3a n d4d a y sl a t e r ，t h e r ew a sn od i f f e r e n c e b e t w e e nt h es e e d st r e a t e dp b ”a n dt h ec o n t r o lt e s t s ow ec a ns a yt h a t t h e r ew a sn os i g i n a f i c a n ti n f l u e n c eo ns e e dg e r m i n a t i o nw h e ns e e d sw e r e t r e a t e dw i t hl 1 0 5x1 0 1 m o l l p b “p b “i n h i b i t e dr o o tg r o w t ho fy i c i a f a b a t h er a t eo fr o o tg r o w t hd e c r e a s e ds u c c e s s i v e l yw i t hi n c r e a s i n gp b “ c o n c e n t r a t i o n t h es p e e do ft h er o o tg r o w t hp e rt i m eu n i ta l s od e c r e a s e d s u c c e s s i v e l yo rs t o p p e dw i t hi n c r e a s i n gt r e a t m e n td u r a t i o n t h em i t o t i c i n d e xd e c r e a s e dp r o g r e s s i v e l yw i t hi n c r e a s i n gp b 2 + c o n c e n t r a t i o na n d t r e a t m e n td u r a t i o n t h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fp b pt r e a t m e n t sc o u l d i n d u c em i c r o n u c l ia n dc h r o m o s o m a la b e r r a t i o n s t h e f r e q u e n c y o f m i c r o o u c l e u sa n dc h r o m o s o m a la b e r r a t i o ni n c r e a s e dp r o g r e s s i v e l y i t h i l l i n c r e a s i n gp b ”c o n c e n t r a t i o n t h ee f f e c t so fc a 2 + s o l u t i o no fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so ns e e d g e r m i n a t i o n ，r o o tl e n g t h ，m i t o t i ci n d e x ，m i c r o n u c l e u sf r e q u e n c ya n d c h r o m o s o m a la b e r r a t i o nf r e q u e n c yo fr o o tt i pc e l l so fv i c i af a b aw e r e a i s os t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e r ew a sn oe f f e c to ng e r m i n a t i o n o fs e e d st r e a t e dw i t h1 1 0 5x 1 0 3 m o l lc a ”t h es p e e do fg e r m i n a t i o n d e c r e a s e dw h e nt h es e e d st r e a t e dw i t hc a ”a b o v e1 i 0 一z m o l l b u ta tl a s t t h e r ew a sn oe f f e c to nt h er a t eo fg e r m i n a t i o n t h er o o tl e n g t ha n dm i t o t i c i n d e xo fr o o tt i pc e l l sw e r ei n c r e a s e da f t e rt h et r e a t m e n tw i t hc a 2 + a t c o n c e n t r a t i o n so f1 1 0 。l i 0 m o l l w h e nt h er o o tt i p sw e r et r e a t e d w i t hc a 2 + t h ea f o r e m e n t i o n e dc o n c e n t r a t i o n s ，t h er o o tl e n g t ha n dm i t o t i c i n d e xd e c r e a s e d ，a n de v e nt h eg r o w t ho fr o o t a n dc e l ld i v i s i o nw e r e i n h i b i t e d t h e r ew a sn os i g n i f i c a n te f f e c to nm i c r o n u c l ia n dc h r o m o s o m a l a b e r r a t i o n sw h e nt h er o o tt i p sw e r et r e a t e dw i t hi l o 一4 l o - 2 m o l l c a ” a tl a s t t h ee f f e c t so fp b 2 + c a 2 + s o l u t i o n o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so ns e e d g e r m i n a t i o n ， r o o t l e n g t h ， m i t o t i ci n d e x ， m i c r o n u c l e u sf r e q u e n c ya n dc h r o m o s o m a la b e r r a t i o nf r e q u e n c yo fr o o tt i p c e l l so f 灯c f af a b aw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a ta ss e e d sw e r e t r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o m b i n a t i o n sc a p b ”w i t h i n1 1 0 3 1 1 0 一2 m o l lc a “l e v e l s c a ”c o u l dd e c r e a s ea n dr e m o v et h et o x i ca c t i o no f p b ”o nr o o tl e n g t h ，m i t o t i ci n d e x ，m i c r o n u c l e u s f r e q u e n c y a n dc h r o m o s o m a l a b e r r a t i o n f r e q u e n c y a n d5 1 0 4 1 1 0 2 m o l l c a ”w e r em o r eo b v i o u s b u t w i t hi n c r e a s i n gc a ”c o n c e n t r a t i o n ，c a 2 + i n c r e a s e dt h et o x i ca c t i o no fp b ” s ot h i sc l e a r l yi n d i c a t e dt h a tp b ”p o i s o n i n gc o u l db ea l l e v i a t e db yt h e p r e s e n c eo fc a ”o fp r o p e rc o n c e n t r a t i o n s k e yw o r d s ：p b ”：c a “： y i c f a f a b a ；m i t o s i s ：m i c r o n u c l e u s c h r o m o s o m a la b e r r a ti o n 一综述 随着科学技术的进步，人类的生活质量也越来越高，然而科学技术的进步 也给人类社会带来了许多负面影响，如环境污染、人类健康、人口、粮食、能 源、交通等问题日趋严重，其中最重要的是人类健康问题。环境污染越来越严 重，各种化学物质和“三废”不断地进入我们的生活环境，对人类的健康造成 了严重的威胁。在我们生活的空间还有许多对人类的遗传物质产生损害、造成 畸变等遗传毒理效应、对人类健康和基因库构成严重危害的物理因子、化学因 子和生物因子。目前，世界各国和国际组织对有毒化合物的遗传毒性都有规范 的、统一的评价程序规定。突变是癌变、畸变的基础，在有毒化合物遗传的快 速初筛试验中，致突变检测尤为重要，在国际防止环境致突变性积致癌物委员 会( i c p e m c ) 划分的5 个遗传学检测标准中，涉及染色体损伤的有2 个，它们是 染色体分离障碍以及染色体数目和结构异常“3 。而检测染色体损伤最常用而有 效的方法之一就是微核试验( t h em i c r o n u c l e u st e s t ，州t ) 。微核试验自7 0 年代初产生以来的近3 0 年的时间里，在环境物质遗传毒理检测方面发挥了重要 的作用，它以经济、简便、快速、敏感、特异、准确等特点，已成为检测染色 体损害的致突变剂和环境污染物的快速初筛试验，已广泛用于筛检具有染色体 损伤作用的致突变荆( m u t a g e n s ) 和环境污染物( e n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s ) 。 1 微核的概念及形成机理 1 1 微核的概念微核( m i c r o n u c l e u s ，m n ) 是指位于细胞的细胞质中独立于主 核，直径是主核1 2 0 1 ：3 ，完全与主核分开的圆形或椭圆形的微小核。它可 以是整条染色体，也可以是染色体断片，染色性与主核一致，其中部分微核具 有d n a 复制能力。微核是由于外界各种具有损害性质的理化因素作用于细胞染 色体，影响其正常的功能，使细胞的d n a 的复制和染色体的分裂受到破坏，纺 锤丝的功能受到影响，染色体发生断裂，细胞进入下一次分裂时。染色体不能 随有丝分裂进入子细胞，而导致染色体丢失或断裂，从而形成一个或数个小核 0 1 3 1 。微核是染色体畸变在间期中表现出的一种损伤类型。还有作者认为微核可 以是细胞凋亡的产物，当致畸因素导致凋亡基因激活，内切酶激活，切割d n a ， 形成细胞核碎片，最终导致许多微核“1 。 微核试验是以动植物为材料利用细胞生物学方法观察其出现的微核率 ( m i c r o n u c l e u sf r e q u e n c y ，m n f ) 来表示材料受遗传损伤程度的一种检测遗传毒 物的方法，是遗传毒理学常用的试验方法之一。微核率是指生物材料经细胞生 物学方法制片后，在显微镜下观测i 0 0 0 个细胞当中微核细胞所占的比率，也可 以是以每个细胞当中含微核数的平均值来计算“1 。微核率可以反映致畸因素对 细胞的损伤程度和染色体稳定性“1 。 1 2 微核形成机理 1 2 1 化学毒性物质 1 2 1 1 染色体断裂剂可诱发染色体发生断裂的遗传毒性物质氇日胞核的主 要组成部分是染色体，在正常的情况下细胞分裂时染色体被纺锤丝牵引平均分 向细胞的两极，形成两个正常的核，染色体被平均分配到两个子细胞。在染色 体断裂剂如丝裂霉素存在下，染色体发生断裂，并且不发生重接或不在原处重 接，于是形成了无着丝粒的断片，在细胞分裂后期不能向两极移动，而残留在 细胞中央的赤道板附近，当子细胞形成时则游离于细胞质中形成不含着丝粒的 微核“。2 1 。 l _ 2 1 2 非整倍体剂可以使染色体和纺锤体联结发生障碍或纺锤体功能受 损。在细胞分裂时，染色体不发生分离而产生非整倍体子细胞，同时在赤道板 中央残留一条或多条染色体，它们在子细胞形成时不能被包在子核中，而游离 于细胞质中形成含着丝粒的微核0 1 。一般的遗传毒性物质兼有染色体断裂剂和 非整倍体剂两方面的作用。 1 2 2 核体出芽间期的细胞核向外形成瘤状突起，形成芽体最后脱离开主核 而形成微核”3 。 1 2 3 放射线放射线可以引起d n a 损伤，产生错误修复的双链断裂，导致微 核出现0 1 。微核可以反应在细胞分裂时未能修复的d n a 断裂，放射诱导d n a 损 伤后，引起d n a 的修复和凋亡过程，基因表达通路的差异与放射敏感性有关。 微核与着丝粒的关系的认识有一个逐渐发展的过程，最开始认为微核是染 色体的断片，不含着丝粒，随着原位杂交方法的建立，通过将着丝粒探针导入 细胞，发现微核中有着丝粒存在，进一步证明微核的形成与有丝分裂的干扰有 2 关，人体在正常状态下也存在低水平的微核，自发产生的微核是染色体的错接， 其中有着丝粒，放射后产生的微核是由于d n a 的双链断裂，其中不含着丝粒。 k r y s c i o 。1 等采用着丝粒原位杂交的方法，检测放射后的微核率，结果随放射剂 量的提高，微核率逐渐增大，而含着丝粒的微核率逐渐下降，提示采用微核率 来判断放射敏感性时应该在总的微核率的基础上只选择不含着丝粒的微核。由 于化疗药物主要是细胞毒性药物，肿瘤患者化疗时m n f 明显升高，a c a r 等0 1 采 用长春新碱、柔红霉素、氨甲喋啶、强的松治疗急性淋巴细胞自血病，用全染 色体的着丝粒探针分析化疗后外周血淋巴细胞的微核，发现化疗引起染色体损 伤而出现的微核是随机的，并非存在特定的靶染色体。 2 影响微核产生的因素 2 1 自发在正常情况下生物也会自然出现较低频率的微核，在人类一般随年 龄增大而增加，往往女性高于男性。主要与自身的免疫力、超氧化物、自由基、 易氧化物等因素有关。 2 2 化学诱变剂即染色体断裂剂和非整倍体剂。这类物质较多，如：苯三酚 ( 1 ，2 ，4 一苯三酚，b t ) 在氧化成酮时产生活性氧，损伤d n a 和其他一些细胞 大分子。实验中，b t 能使淋巴细胞微核率上升2 倍，使h l t - 6 0 细胞微核率上 升8 倍，且总微核数在两类细胞呈剂量相关性增高，b t 不仅引起染色体数日和 结构变化，而且通过产生新生氧而间接引发点突变“。 纺锤丝毒性药物，如秋水仙碱、h 0 - 2 2 1 等能直接抑制动物细胞纺锤丝的形 成，阻止细胞分裂后期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端，从而形成微核。a n d o n 等应用抗肿瘤药( h 0 - 2 2 1 ) 抑制纺锤丝微管组装，破坏纺锤丝，结果在染色体分 析时诱导出多倍体和亚二倍体细胞，未见染色体断裂，鼠体内细胞也常被诱导 出较大的微核o ”。 2 3 细胞组成成份v b l 2 、叶酸缺乏可引起微核。有人对9 位健康志愿者进行 了叶酸限量试验，从基础用量的1 9 5 m g l d ，减到每天5 6 m g ，维持5 周，然后 慢慢补充叶酸，减量后的双核淋巴细胞和全系淋巴细胞内的微核频率均增高， 且有着丝点阳性和阴性的微核都增加，当叶酸补充后，两类细胞微核率明显下 降，着丝点阳性微核变化更为显著。实验表明低叶酸血症在临床贫血症状之前， 就出现了血液和口腔粘膜细胞遗传物质损伤。当叶酸和v b l 2 的摄入量是基础量 的3 5 倍时微核率明显降低。半胱氨酸浓度过高也可引发微核，当血浆中半胱 氨酸浓度低于7 5 m m o l l 时微核率最低。“。 2 4 抗氧化剂谷胱甘肽、v c 、v e 、硒等具有降低微核产生的能力，主要是与 可以清除体内的超氧化物等物质有关。g i r ia 等研究认为v c 有预防顺铂诱导 鼠致畸的作用，联合使用v c 和顺铂这两类药物，发现鼠骨髓细胞微核、染色体 畸变等指标明显低于单独使用顺铂。有趣的是他们还发现联合治疗过程中鼠骨 髓细胞谷胱甘肽( g s h ) 水平也明显增高，可解释v c 保护活体细胞免受顺铂诱导 畸变的部分机理o “。b a r t htj 等对2 4 名口腔粘膜白斑和2 4 名原发性口腔癌 根除术病人进行研究发现，导一胡萝 、素、v e 及v c 等抗氧化剂能使异常粘膜细 胞再分化，使微核数目减少且导致细胞角蛋白基因的正常表达“”。 2 5 其他因素微核也是细胞凋亡的产物，当程序性死亡基因激活，随之c a = + 依赖性内切酶激活，切割d n a ，形成细胞核碎片，形态学表现为核深染，染色 质边缘分布的帽形核，最后导致微核形成“1 。g a t e n ac 等经微核试验发现同一 照射剂量下体内放射治疗的病人较体外细胞的微核发生低，因此推测体内可能 存在细胞遗传恢复因子k 。另外，观察切脾病人幼红细胞微核变化，发现切除 脾脏加化疗的病人每l 万个幼红细胞的微核细胞( 6 5 。2 1 7 7 ) 明显高于没有切 脾的化疗病人( 2 5 1 5 ) 和没有化疗的切脾病人( 2 9 5 5 8 ) ，可推测微核幼红 细胞可能在脾脏被加速清除“。 3 微核试验的产生与发展 微核试验创建于2 0 世纪7 0 年代初，首先由h e d d l e 和s c h m i d 利用啮齿类 骨髓细胞建立了微核测定方法“”1 。1 9 7 0 年s c h m i d 及h e d d l e 给中国金黄地鼠 注射抗肿瘤药三亚胺醌后，观察了骨髓与外周血细胞学的变化，并且提出用本 来无核的外周血嗜多染红细胞中删发生率来作为微核试验的基本指标，并正式 命名为m n t 。此后至7 0 年代中期，该研究小组的工作，全面奠定了m n t 的理论及 应用基础。经h e d d l e 等人3 0 多年的发展，许多国家和国际组织已将其规定为 新药、食品添加剂、农药、化妆品、环境化学物质等毒理安全性评价必做的实 验“”1 。 随着分子生物学技术的迅速发展和不断渗透到微核研究中，微核试验的检 测应用范围不断扩大，现已发展成为能同时检测染色体断裂、染色体丢失、分 4 裂延迟、不分离、d n a 损伤修复障碍、h p r t 基因突变、细胞凋亡、细胞分裂不 平衡等多种遗传损害终点。“。 自2 0 世纪7 0 年代h e d d l e 和s c h m i d 利用啮齿类骨髓细胞建立了微核试验 检测方法以来，各国都在不断研究探索微核试验技术。主要从三个方面来进行： 一是探索微核试验的实验技术，即研究材料、实验方法、给药方式、染毒途径、 制片方法、染色方法等：二是利用微核试验来检测各种致突变物质；三是通过 微核试验来预测疾病。 我国第篇关于微核的文章发表于1 9 7 8 年，是中科院云南动物研究所利用 食道癌病人外周血分离淋巴细胞，研究放射治疗时诱导的淋巴细胞微核率”“。 8 0 年代以后我国一批学者如薛开先、钟宝珍等开始进行微核研究。从研究状况 上来看，微核试验在我国的发展可分为四个阶段1 ：1 ) 1 9 7 8 1 9 8 1 年间，论 文年发表量在3 0 篇以下，主要是微核试验引入和初步研究阶段，人员较少，比 较集中；2 ) 1 9 8 2 1 9 9 1 年间，是微核试验的的传播和推广阶段，近十年间发 展较快，论文年发表数量在3 0 6 0 篇之间，并将微核试验用于评估食品、药品、 环境污染物等；3 ) 1 9 9 2 1 9 9 6 年间，微核试验的成熟阶段，5 年阃论文年发表 数量在1 0 0 篇以上，论文的质量和数量近一步提高，应用范围进步扩大和普 及，如预防医学、卫生检验、毒理学、环境科学等方面，同时出现了新技术， 如抗着丝粒抗体染色( c r e s t 染色) ，荧光原位杂交( f i s h ) ，自动化检测等；4 ) t 9 9 7 年以后，论文年发表量少于1 0 0 篇，由于技术成熟，人们对之缺乏新鲜感， 加之新技术的应用对设备要求较高，试验难以开展。 4 微核试验技术的种类 4 1 常规微核试验是利用细胞生物学方法经显微制片后在显微镜下直接计 数待测材料微核率的方法。这是普遍采用的基本方法，可以分为两类；1 ) 将微 核试验材料在加入待测物质的环境中培养一段时间，染色制片，显微观察计算 微核率。2 ) 直接将受遗传毒理损害生物的相应材料制片，显微观察计算微核率。 4 2 细胞分裂阻滞徽核分析法1 9 8 5 年f e n e c h 等人建立的方法，用胞质分裂 阻滞剂阻断胞质分裂，但不影响细胞核分裂，有丝分裂细胞呈特殊形态的双核 细胞，未发生核分裂的细胞则维持单核细胞形态。检测致突变因素作用后的双 核细胞率和双核细胞微核率，可同时获得致突变因素对细胞的遗传毒性损害和 5 对细胞周期影响的信息”。 4 3 荧光原位杂交试验与d n a 探针荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei n s i t u h y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 技术是近年来开展起来的分子生物学新技术。它是使用 生物荧光素标记的各类d n a 和r n a 探针与细胞或组织在玻片上进行原位杂交， 被观察的特定d n a 片段( 或序列) 在荧光显微镜下固定在细胞核或染色体的原 有部位显示荧光。利用荧光原位杂交试验可以检测是染色体断裂还是染色体丢 失，以及可以判断是哪一条染色体，哪一段所产生的微核。目前己成功用于荆 实验的d n a 探针主要有两类：第一类是含d n a 重复序列的探针，主要用于检测 染色体着丝粒的d n a 。第二类是含染色体端粒d n a 序列的探针，它主要显示染色 体臂的存在。 若两种探针结合使用，则可以较为准确地判心的组成情况，即是染色体断 片还是整条染色体，以及各自的数目。 目前，在原位杂交的基础上又发展出了多彩色荧光原位杂交技术，它使用 几种不同的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，在荧光最微镜下显现 不同的颜色，因而可以同时检测间期或中期细胞中的几个特异核酸序列。它可 以广泛应用于物理图谱绘制、致突变研究、肿瘤病理和产前诊断等方面啪1 。 4 4 抗着丝粒抗体染色( c r e s t 染色)抗着丝粒抗体( a n t i k i n e t o c h o r e a n t i b o d i e s ) 是美国学者m o r o i 及其同事于1 9 8 0 年在硬皮病病人血清中发现的 一种自动抗体“”1 ，这些自动抗体可以通过免疫荧光技术检测到。他们与染色 体着丝粒蛋白( 抗原) 成份相结合，具有较强的特异性。但并不是所有硬皮病 病人的血清中都含有该自动抗体，含该抗体的病人皮肤损害往往并不严重和广 泛，但却有显著的c r e s t 征。所以将用该种病人的血清对染色体着丝粒的染色 直接称为c r e s t 染色( c r e s ts t a i n i n g ) 。c r e s t 染色用来区分心来源( 染色 体断片还是整条染色体) ，了解诱导删的化合物性质( 断裂剂还是整倍体剂) 2 目- - a 4 口 4 5 自动化检测法 4 5 1 流式细胞仪检测方法流式细胞仪( f l o wc y t o m e t r y ) 检测方法是2 0 世纪7 0 年代发展起来的定量测定细胞和亚细胞成份的方法。流式细胞仪是利用 激光束为光源，将待测样品进行荧光染色，然后在液体载体里以单个细胞通过 激光束产生荧光信号并转变为电信号通过仪表显示来达到定量测定的目的。流 式细胞仪检测删有很多优点：1 ) 检测速度至少比人工读片快4 0 1 0 0 倍：2 ) 减少了人为因素；3 ) 新型流式细胞仪具有分选功能，对判定为含m n 的细胞， 可以分类检出并收集在玻片上或试管里，在显微镜下检查验证，以证实其真实 性并计算其可置信度”1 。 4 5 2 计算机图像分析系统检测计算机图像分析系统是将高分辨力摄像机 和计算机结合起来，将图像分解为若干点，再将每个点的图像色差转换为数字 信号，储存在计算机里进行各定量参数的计算。从8 0 年代中期开始利用计算机 图像分析技术，其检测速度也至少比人工计算快1 0 倍以上，但容易受条件因素 影响，还需进一步完善o “。 5 微核试验的应用 微核试验广泛应用于药品、食品添加剂、农药、化妆品、工业化学品、环境 污染物等遗传毒性的检测、安全性评价和遗传损害的监测，为接触有害物质人 群提供遗传损害检测和工作环境监测，为行政管理部门的决策、立法奠定理论 依据，主要体现在以下几个方面： 5 1 环境物质监测和致突变物检测污染物对人体或生物产生的损害可以方 便快速地通过微核检测出来。在普查致畸、致癌、致突变物等方面应用广 泛，如物理因子( 射线) ，化学因子( 毒物) ，生物因子( 毒素) ，污染气体，工 业、生活污水，洗涤剂，重金属，农药等致突变物的检测。目前全世界已检出 的有毒物质近5 0 0 种。由于微核监测方便，判断环境中的有毒物质对人体损 害时，可以快速得出科学的结论。通过人体或动物m n f 的变化的观察，在监测 空气、河流和城市的污染起到重要的作用汹3 。研究发现造鞋厂工人接触有机溶 剂后出现外周血淋巴细胞m n f 明显升高，而姊妹染色体互换检查尚正常。“。h a n c 等汹1 在研究b e i c u n 乡村地区环境污染，调查空气、河水、饮用水、蔬菜和人血 清时，发现该地区苯芘、空气总悬浮颗粒、饮用水及蔬菜中的硝酸根和亚硝酸 根都明显高于其它受控的乡村地区( p o 0 1 ) 。被培养的该地区居民淋巴细胞微 核和染色体畸变显著增多，且与苯芘、空气中的悬浮颗粒、饮用水及蔬菜中的 硝酸根和亚硝酸根含量呈显著相关。推测空气和水源严重污染可能是升高该地 区居民细胞遗传学损伤和癌症死亡的重要因素。 5 2 化疗后的细胞学损伤观察化疗后机体的淋巴细胞及骨髓细胞微核率明 显上升，反映化疗后的遗传损伤程度啪1 。e l i a s l 等对1 5 例化疗或放疗急淋儿 童外周血淋巴细胞微核变化进行分析，结果用长春新碱、甲基喋啉、柔红霉素、 强的松化疗和首次化疗末期使用了头部放疗的病人，他们的淋巴细胞微核( 平 均1 9 9 6 1 2 9 ) ，明显高于对照组( 平均3 6 7 1 5 5 ) ，6 例作了2 年治疗期 动态观察，多数病人贯穿治疗期淋巴细胞微核频率显著增高。因而认为微核检 测法是评价抗白血病化疗药物诱导机体细胞遗传学损伤的有效方法。化疗后微 核率都有明显的升高，但与预后的关系尚不能确定。a c a r 等。1 的研究发现，化疗 后患者淋巴细胞m n f 显著增离，反映了化疗药物对细胞遗传物质的损伤，且是 非特异性的。r y t w i n s k i k 等分析1 4 0 例急性淋巴细胞白血病的儿童骨髓细胞 幼红细胞微核率与贫血和复发的相关性，发现幼红细胞微核与贫血密切相关而 与复发无关，b f m 方案治疗后儿童幼红细胞微核率低于孟菲斯( m e m p h i s ) 方案。 b f m 方案化疗的基因毒性更小，因而认为微核检测法是评价抗白血病化疗药物 诱导机体细胞遗传学损伤的有效方法，但m n f 与预后的关系尚不清楚。 5 3 放疗的遗传学损伤分析微核是遗传损害的生物标志物，用于癌症患者、 肿瘤患者等放射剂量的估算及放射事故的事后遗传损伤检测。有文献介绍用细 胞动力封闭微核分析法评价放射治疗8 位病人后的淋巴细胞辐射线损伤情况， 结果治疗后每5 0 0 个双核细胞的微核平均值( 1 7 1 3 0 ) 明显高于治疗前的对 照细胞( 6 0 1 7 ) 。微核作为遗传物质损伤的标志物，可以在放射事故后作为 指标判断吸收剂量，具有简便、快速的特点，且与物理法所得结果一致。肿瘤 的放射治疗时，内照射的计量估算较麻烦，有作者采用内照射前后的微核率的 改变来确定等效全身剂量( e q u i v a l e n tt o t a lb o d yd o s e ，e t b d ) ，发现相同剂 量的照射量内照射后微核率明显增高，但升高水平不一致，存在个体差异，即 e t b d 不一致，说明个体差异对内照射的影响，因此治疗时应该注意治疗的个体 化啪1 。w i d e lm 等“对比了体外培养和活检宫颈癌细胞的微核率在放射前后的 变化，活检体外培养的癌细胞予2 g y 的照射，在放疗量d t 2 0 g y 时，活检取癌细 胞检测微核率，并且与放射治疗的疗效比较，发现体外培养的癌细胞的微核率 变化与疗效和预后关系不明显，而2 0 g y 照射后取活检检测微核率的增加与局部 控制率有密切关系，可以预测放射反应性和对晚期肿瘤患者执行个体化的治疗 方案。 5 4 特定人群的突变损伤检测和早期预报在诱变因子和致癌物下的特定人 群的血液淋巴细胞和上皮细胞的微核率会明显上升，通过上皮细胞的微核数量 变化可以快速安全地早期检测癌变或预报受损伤程度删。 5 5 利用微核试验筛选抗癌物质将待测物质应用于微核材料中，检测微核率 发生情况来判断物质的抗癌性。 5 6 利用微核试验指示环境污染的程度检测环境中生活的生物材料的微核 率的发生情况来预警环境的污染情况。 总之，用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培 养细胞遗传学损伤仍是一个直观有效可行的方法，在遗传毒理、医学、食品、 药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用，随着科技的进步微核试验技术也将 不断向纵深方向发展，相信在不远的将来微核试验技术在各行业的应用将越来 越广泛，发挥的作用也必将越来越大。 9 二引言 铅及其化合物都有毒，会造成大气、土壤、水体的污染，是对人类和生物 影响较大的重金属元素之一。铅是植物的非必需元素，当它与植物接触后就会 对植物产生一定的毒害作用，轻则使植物体内的代谢过程发生紊乱生长发育受 到抑制，重则导致植物死亡“”。当铅进入植物体时，由于质膜是有机体与外界 环境的界面，所以首先受到铅的毒害n “。铅离子还可以通过质膜进入细胞，影 响细胞内一系列生理生化过程，使新陈代谢紊乱”“。例如，在铅胁迫下，光合 系统和一些光合酶的活性以及叶绿素的合成受到影响，甚至叶绿体的结构遭到 破坏，导致植物的光合作用降低“7 “1 ；铅又能损伤线粒体的结构，抑制根系多 种脱氢酶等其它呼吸酶的活性，干扰植物的呼吸作用“4 ；通过与蛋白质上- s h 基团结合而破坏蛋白质结构，影响蛋白质活性，干扰n 素代谢；铅能造成植 物体内s o d 、p o d 、c a t 3 种酶活性比的不平衡，引起生理生化过程紊乱，并最终 导致植物的伤害”：铅与带负电荷的核酸结合引起染色体畸变、降低d n a 和r n a 活性，干扰核酸代谢嘟1 ；铅还能通过拮抗作用导致植物体内元素失调，造成营 养胁迫，间接地影响植物的生长发育o ”。以上是铅在细胞水平和分子水平上对 植物的影响，在个体水平上，铅对作物根系的影响较为显著，能降低细胞的有 丝分裂速度，阻碍根系的生成。在高浓度的铅处理下，可使植物种子萌发率、 胚根长度及胚芽长度显著降低，重者出现胚根组织坏死。以不同浓度的铅处理 水培的玉米和大豆，随着铅浓度的增加，植株高度、叶数、生物量及产量下降 “1 。土壤高浓度铅延缓水稻生长，推迟成熟而导致减产。 铅不仅影响作物的产量和品质，并且可以通过食物链影响动物和人类的健 康“”。德国铅和锌冶炼厂周围5 k m 之内吃草的马和牛发生铅中毒，动物消瘦， 关节肿胀并疼痛，有的喉返神经( 支配声带的神经) 麻痹，动物有特殊的马嘶 声和马喘鸣症，并伴随有呼吸短促”1 。中国鲎的卵径发育大小随铅离子浓度的 增加而减小，胚胎孵化率随着水体中铅离子浓度的提高而下降，铅离子浓度提 高至l _ 6 m g l 时，胚胎致畸率高达5 0 。 人类通过呼吸道、消化道和皮肤吸收铅，进入呼吸道的铅中有约2 0 4 0 1 0 留在了人体里。据估计，空气中1ug m 3 浓度的铅可使血管中铅的浓度达到1 2pg d l 。不论摄入的途径如何，小孩比成人对铅化合物敏感得多，某些数据表 明，摄取率高达5 0 ，相当于5 倍成人的吸收量。铅严重影响幼儿的智力发育， p e t e rb a g h u r s t 领导的澳大利亚研究者发现，幼年期间的血铅含量为1 0 3 0 ug d l 的7 岁儿童，其智商比低血铅含量的同龄儿童低5 ，更有甚者，先前暴 露于铅的较大孩子似乎连中学毕业都有困难”1 。 铅最能影响的人体系统是：( a ) 造血系统：铅在人体中一个最早、最重要 的影响是改变血红素的合成，这使得红细胞改变，造成贫血；( b ) 中枢神经系 统( c n s ) ：铅对中枢神经系统产生重要影响，导致常见的忧郁脑疾病，症状包 括细微的生理和行为变化。当铅源从无机铅变为有机铅时，还可产生其他不同 的影响：( e ) 外部神经系统( p n s ) ：导致忧郁麻痹症，它的主要外在表现是手部 缺乏力量。此外，泌尿系统、胃肠道系统、心血管系统、生殖系统、内分泌系 统和关节等生理系统也会受到铅污染的影响。 铅在地壳中的含量为0 0 0 1 6 “，在火成岩或变质岩中的含量为0 0 0 1 0 0 0 2 ，未受污染的南极土壤为0 0 0 1 ，可作为表层土壤中铅的自然本底值。”。 自然环境中铅的本底值较低，而当今人们铅摄入量及铅负荷升高，主要是人为 因素造成的环境污染( 据估计，自古以来铅的消耗总量几乎没有超过3 0 m r ，而 目前铅的消耗每年大约5m t ) ，具体有以下几方面： 1 铅的开采、冶炼和精炼 铅的物理化学性质如延展性和对腐蚀的抵抗性从古代就为人们所知，人类 开采、冶炼铅已经有8 0 0 0 年的历史。铅的开采、冶炼和精练过程会对周围大气 和土壤有很大影响，排出的重金属颗粒大小为0 0 0 1 1 0 0u i l l ，烟气颗粒为 0 0 1 2p m ，靠近冶炼厂的表层土壤，其铅含量为1 0 0 0 m g k g 。 2 工业“三废” 生产和使用铅及含铅化合物的工厂排放的废气、废水、废渣可造成环境污 染，进而造成食品的污染。环境中某些微生物可将无机铅转变成毒性更大的有 机铅。当前世界许多地区，特别是工业发达的城市，大气中含铅已达极高水平。 欧洲的大气含铅量为0 0 5 5 1 0 1 o 3 4 1 0 “g m 3 ，日本大气含铅的平均值为 0 2 1 0 “g g ，我国北京市1 9 8 0 年大气含铅量平均值为0 5 6 1 0 “g 打。我国 一些地区对土壤中铅的含量进行过调查研究，结果( m g k g ) 是：北京1 8 ，7 8 ； 华南地区2 6 4 7 ；长江三峡库区2 0 5 1 ；上海2 3 0 ；南京2 4 8 ：重庆2 2 2 。 3 蓄电池 1 8 5 9 年，法国物理学家g a s t o np l a n t e 发现当一个铅氧化物和铅金属电极 浸入硫酸电解液时，产生电能，而且以后还可以再充电。之后，这个技术不断 成熟，1 8 8 9 年，铅酸电池投入商业生产。随着机动车的发展，电池市场在2 0 世纪发展很快( 最终消耗了世界铅产量的7 5 左右) 。铅酸电池在机动车中用于 启动、照明和点火。不采用安全有效的措施对铅酸电池进行回收处理，势必造 成资源的浪费和环境的污染。 4 汽油添加剂 四乙基铅 p b ( c ：h 。) 。 生产于1 9 2 1 年，它在常温下呈液体，沸点为2 0 0 ， 有抗震性能。它作为一种汽油添加剂，用于解决高温时高压发动机运行的爆震 音问题，故排除的尾气中含有大量的铅，造成公路干线附近的铅污染。四已基 铅在5 0 年代后达到生产顶峰。另外，它的毒性比无机铅的毒性大1 0 0 倍。 5 含铅肥料 氮、钾肥料中重金属含量较低，而磷肥中含有较多的有害重金属。磷肥不 同于氮肥，它的生产原料是磷矿石，成分不像由合成氨制造氮肥那样单纯，往 往含有一定量的重金属，其中铬、铅、砷元素含量较高。农田施入磷肥将这些 有害物质带入土壤环境，对作物产生危害。而且这些有害物质在土壤一植物系统 中积累、迁移和转化，进入食物链，对人体健康造成危害， 6 另外，含铅农药( 如砷酸铅) 的使用、污水灌溉、垃圾农用以及铝合 金、马口铁、陶瓷及搪瓷等材料制成的食品容器和食具的使用等都会造成环境 污染。 铅对植物生长的影响，如前面所述，已经有很多报道。目前，也已有人研 究了铅对洋葱有丝分裂指数的影响“”和铅诱发蚕豆根尖细胞微核的形成m 1 ，但 从种子萌发率、根长、有丝分裂指数、微核率、染色体畸变率这五个指标进行 铅对植物的毒害的完箍研究还未见报道，故我们以蚕豆为实验材料，研究了铅 对蚕豆种子萌发率、根长、有丝分裂指数、微核率、染色体畸变率的影响，以 便更好地探讨铅对植物的毒害机理。 1 2 钙是植物生长发育过程中的必需元素，关于它的一些重要生理功能，我们 已经有所了解，如：作为细胞壁的物质组