（动物学专业论文）斑马鱼spr2互作蛋白的筛选和功能初步研究.pdf

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1 i k e 转录因子家族与锌指蛋白密切相关，它们可以调控大量的复合g c 一 启动子的基因，在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化和细胞转化中都可能发挥作用。 独立的s p l l i k e 转录因子可与不同的启动子和互作蛋白结合，发挥增强子或抑 制子的作用。 最新研究发现在斑马鱼胚胎发育的后囊胚期和前原肠胚阶段，s p r 2 在上胚 层和下胚层中表达；其后在中胚层和一些神经组织中表达。通过s p r 2 基因敲除 实验和过量表达实验，可知s p r 2 的活性受到f g f 、n o d a l 、w n t 信号通路的协同 控制。在中胚层发生早期，s p r 2 可以通过调控f g f 信号通路调控中胚层的发生， 从而表达一些活性蛋白因子来调控中胚层相关组织器官的发育。由于中胚层是器 官发生的重要基地，这一发现对研究脊椎动物早期胚胎的发育机理非常重要。因 此，我们以s p r 2 为诱饵蛋白，通过酵母双杂交系统从斑马鱼早期胚胎c d n a 文库 中筛选可能与s p r 2 蛋白相互作用的蛋白，进一步探索其在f g f 信号通路中的作 1 山东师范大学硕士学位论文 用机制。 本论文通过酵母双杂交系统在斑马鱼早期胚胎c d n a 文库中筛选可能与s p r 2 相互作用的蛋白，以酵母融合的方法在6 3 1 0 8 个转化子中筛选到7 8 个阳性克 隆，测序鉴定后最终得到1 1 种可能与s p r 2 蛋白相互作用的蛋白，它们是p a i r e d b o xg e n e6 a 、m s i n 3 a a s s o c i a t e dp r o t e i n1 3 0 等，通过结果分析推测s p r 2 可 能通过f g f 8 参与f g f 信号通路的调控。 在所得的1 1 种同源蛋白中，我们经过分析发现重复克隆数最多的l 号蛋白为 斑马鱼眼睛发生的标志基因，它可以特异的在眼睛和中枢神经系统中表达，最新 研究成果显示p a x 6 基因的表达与f g f 8 有关，这提示t s p r 2 可能会通过f g f 8 与f g f 通路产生联系：2 号m s i n 3 a a s s o c i a t e dp r o t e i n1 3 0 ( s a p l 3 0 ) 也是我们感兴趣 的一个蛋白，它是一种胞质蛋白，其c 端含有一个r e p r e s s i o n 区域，n 端含有一个 参与转录激活功能的区域，s a p l 3 0 可以通过c 端功能区与m s i n 3 a 复合物相互作用。 m s i n 3 a 复合物含有多个蛋白与蛋白相互作用的功能区，它可以作为辅阻遏复合物 的支架；而它的辅阻遏复合物可以特异的与大量不同的转录抑制物相互作用，在 哺乳动物胚胎发育中起着至关重要的作用，例如s i n 3 a 可以作为b m p 中介的转录调 控抑制剂影响b m p 信号通路；因此，我们认为该蛋白很有研究价值。另外，3 号和 5 号蛋白都与肌肉发生有关；4 号、8 号、9 号蛋白与磷酸化作用有关，提示它们可 能也是蛋白信号通路中的重要调控分子：6 号、7 号都与体内造血作用有关；而f g f 通路主要调控血管生成、中胚层的形成及神经轴突的延伸，因此这些蛋白因子也 是很有意义的筛选结果。我们将通过细胞生化和胚胎实验进一步研究它们与s p r 2 的互作机制和互作功能区域，期待破解s p r 2 受f g f 信号通路调控的分子机制，提 出脊椎动物胚胎中胚层发生的新理论。 关键词：斑马鱼、s p r 2 、酵母双杂交、e f 一2 、p a x 6 、s a p l 3 0 分类号：q 7 8 山东师范大学硕士学位论文 a s t u d yo fs c r e e n i n go ft h ep r o t e i n si n t e r a c t i n gw i t h z e b r a f i s hs p r 2 l i k e 2v i ay e a s tt w o h y b r i ds y s t e m a b s t r a c t z e b r a f i s h ( b r a c h y d a n i or a t i o ) ，a san e wm o d e la n i m a lw i l d l yu s e do ne m b r y o d e v e l o p m e n ts t u d yo fv e r t e b r a t e , b e c a m ep o p u l a ra n du s e f u l i nr e c e n tt e ny e a r s ，t h e s t u d yo fv e r t e b r a t ee m b r y od e v e l o p m e n tu s i n gt h i sm o d e lh a sd e v e l o p e dr a p i d l y t h e r ea r es e v e r a la d v a n t a g e so f z e b r a f i s ht ob eam o d e la n i m a l f i r s t l y , t h e ya r es m a l l a n d e a s yt ob er a i s e d t h ef e m a l ec s nm ym o r et h a n2 0 0e g g so n c eaw e e ka n dt h e e m b r y o sn e e do n l y3m o n t h st ob eh a t c h e d s e c o n d l y , t h ez y g o t e so f z e b r a f i s ha r eb i g a n dl i m p i d , s oi ti sq u i t cc o n v e n i e n tt oo b s e r v et h ew h o l ed e v e l o p m e n t a lp r o c a s s e so f z e b r a f i s he m b r y oa n da n a l y s et h ef e a s i b l ee n d p o i n t si ne m b r y o t o x i c o l o g i c a lt e s t i n g f i n a l l y , t h ed e v e l o p m e n to fz e b r a f i s he r u l ，r y oi 暑q u i t er a p i d o n l yn e e d3d a y sf r o m i m p r e g n a t e dt oi n c u b a t e d r e c e n t l ya n e wm e t h o dw h i c hm i c r o i n j e c tm o r p h o l i n oi n t o t h ee m b r y oo f z e b r a f i s ht oi n h i b i ts p e c i a lg e n e sa c t i v i t yh a se f f e c t i v e l yt ob eu s e d a s ar e s u l t , w ed e c i d e dt ou s ez e b r a f i s ha sam o d e lt os t u d ya ni m p o r t a n tp r o t e i nn a m e d z e b r a f i s hs p r 2 s p r 2i sar e s t r i c t l ye x p r e s s e dg e n ei nb e t hm e s o d e r ma n de c t o d e r md u r i n gt h e d e v e l o p m e n to fz e b m f i s he m b r y o s p l - l i k ep r o t e i n sa n dk r f i p p e l l i k ef a c t o r s ( k l f s ) a r eh i g h l yr e l a t e dz i n c f i n g e rp r o t e i n st h a ta r ei m p o r t a n tc o m p o n e n t so f t h ec u k a r y o t i c c e l l u l a ri m n s c r i p t i o n a lm a c h i n e r y b yr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fal a r g en u m b e ro f g e n e st h a th a v eg c - r i c hp r o m o t e r s , s p l - l i k e k l ft r a n s c r i p t i o nr c g u l a t o mm a yt a k e p a r ti nv i r t u a l l ya l lf a c e t so fc e l l u l a rf u n c t i o n , i n c l u d i n gc e l lp r o l i f e r a t i o n , a p o p t o s i s d i f f e r e n t i a t i o n , a n dn e o p l a s t i ct r a n s f o r m a t i o n i n d i v i d u a lm e m b e r so ft h e s p l l i k e k l ff a m i l yc a nf u n c t i o na sa c t i v a t o r s0 1 r e p r e s s o r sd e p e n d i n go nw h i c h p r o m o t e rt h e yb i n da n dt h ec o r e g u l a t o r sw i t hw h i c ht h e yi n t e r a c t s p r 2i se x p r e s s e di nb o t hh y p o b l a s ta n de p i b l a s tc e l l sd u r i n gl a t eb l a s t u l a t i o n e a r l yg a s t r u l a t i o n , a n di ns o m em e d e r m a la n d n e u r a lt i s s u e sa tl a t e rs t a g e s t h es p r 2 k n o c k d o w na n do v e r e x p r e s s i o nd a t as h o w st h a ts p r 2e x p r e s s i o ni sd e p e n d e n to n 瞄 n o d a la n dw n ts i g n a l s a n di ti si m p l i c a t e di nm e s o d e r mi n d u c t i o nd u r i n ge a r l y 3 山东师范大学硕士学位论文 d e v e l o p m e n ti n z e b r a f i s he m b r y o s b e c a u s eo ft h e i m p o r t a n c eo fm e s o d e r m d e v e l o p m e n td u r i n go r g a n g c n e s i s , w eu s ey e a s tt w oh y b r i ds y s t e mt os e a r c hf o r p r o t e i n si n t e r a c t i n g w i t hs p r 2f r o mt h ee a r l ye m b r y o so f z c b r a f i s hc d n a l i b r a r ya n d e x p l o r et h em e c h a n i s mo f s p r 2f u n c t i o ni nf g f ss i g n a lp a t h w a y i nt h i ss t u d y , t h ey e a s tt w o h y b f i d ss y s t e mi su s e dt os e a r c h e df o rp r o t e i n s i n t e r a c t i n g 耐t l ls p r 2 f r o mt h ee a r l ye m b r y o so fz e b r a f i s hc d n al i b r a r y , 7 8p o s i t i v e c l o n i c sf r o m6 3 x 1 0 6t r a n s f o r m a n t sw e r ef o u n db yy e a s tm a t i n g 1 1k i n d so f p r o t e i n s a r ci d e n t i f i e da f t e rs e q u e n c i n gt h ep l a s m i d so f t h ep o s i t i v ec l o n i e ss u c ha sp a i r e db o x g e n e6 a 、m s i n 3 a - a s s o c i a t e dp r o t e i n1 3 0 w es u g g e s tt h a ts p r 2c a l lp a r t i d p a t ei nf g s s i g n a lp a t h w a yb yt h ei n t e r a c t i o n 稍t l lf g f s k e yw o r d s ：z e b r a f i s h ，s p r 2 ，y e a s tt w o - h y b r i d ，e f 一2 ，p a x 6 ，s a p l 3 0 c a t e g o r yn u m b e r ：q 7 8 4 山东师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 斑马鱼是脊椎动物早期胚胎发育研究中的模式动物 1 1 斑马鱼作为模式生物的优点 理想的研究系统是科学研究与发展的关键，果蝇( 1 h o s o p h i l a ) 和线虫 ( c a e n o r h a b d i t i se e g a n s ) 作为无脊椎动物发育生物学研究的模式动物莫定 了分子发育生物学研究的基础它们之所以能够作为模式动物，其主要原因就 在于它们将胚胎学和遗传学二者有机的结合起来因为我们不但可以对它们胚 胎的发育过程进行观察，而且可以对其进行突变研究，分析遗传方面的影响。 但是，由于脊椎动物在胚胎结构及形态形成等方面都与无脊椎动物存在差异， 其中有些特征根本不能用无脊椎动物进行研究，进行脊椎动物胚胎的形成及人 类发育方面的研究就必须借助于理想的脊椎动物的模式种。鼠类虽然带动了现 代高等遗传学( 特别是基因转移方面的) 的发展，但其胚胎深埋于母体子宫中无 法进行观察；爪蟾一直是胚胎学的好材料，但因其繁殖太慢而难以成为遗传学 研究的好对象；其他的模式动物也存在着一些缺点。在脊椎动物发育生物学研 究方面，始终难以找到像果蝇和线虫一样理想的模式动物，而繁育能力强、体 外受精、胚胎透明的鱼类开始引起了发育生物学家们的注意。 图1 1 斑马鱼照片 美国俄勒冈大学已故的著名遗传学家g e o r g es t r e i s i n g e r 在二十多年前 把目光转向了一个小型的鱼类斑马鱼( d a n i or e r i o ) ，并开始了对其发育 山东师范大学确士学位论文 生物学方面的研究【l 】斑马鱼是在印度和巴基斯坦河里发现的一种鲤鱼，成年 鱼3 - 4 c m 长，身上有漂亮的斑马花纹，群居生活，( 如图1 1 ) 随着近十几年 来大批分子生物学家对斑马鱼的重视，斑马鱼在提示生命本质及其运行机制的 发育生物学领域中的地位日趋重要。此后，越来越多的发育生物学家开始把目 光投向了斑马鱼，使其做为研究脊椎动物发育的模式生物而得到越来越广泛的 应用。目前斑马鱼已成为胚胎发育遗传控制研究中盛行的动物模型，被誉为“脊 椎动物中的果蝇”团。 斑马鱼之所以可以作为一种理想的模式生物，主要因为其具有以下几点特 征： 斑马鱼价格便宜，容易获得。成年斑马鱼的体长仅3 c m 左右，而且能承受高密 度饲养每升水中最多可容纳5 尾，意味着容易饲养大量群体，管理饲养易 行 斑马鱼的胎间距短，为3 个月，每条雌性斑马鱼每周可产生大量后代( 2 0 0 枚胚胎) 。受精及发育都在母体外进行，因此容易进行观察和操作，如进行组 织移植或化学药物刺激等。 斑马鱼的胚胎在母体外发育，可以在母体外对胚胎进行独立操作；胚胎发育 非常迅速( 从受精到孵出大约3 d ，主要器官都在受精后2 4 h 内形成) ，而且， 来自于同一母体的胚胎是同步发育的，易于大量收集特定阶段的同期胚胎材 料。 受精卵大( 直径约l m ) ， 早期胚胎完全透明，因而易 于观察内部结构。单倍体， 雌核发育二倍体的制备和 突变体自噘得均较容易。胚 胎是完全透明的，这样即使 在发育的高级阶段，仍然可 以观察到全部的细胞。这使 得研究者不仅能跟踪观察 每一个细胞的发育命运，而图1 2 斑马鱼胚胎发育时空图谱 6 山东师范大学硕士学位论文 且也可观察得到原肠期的细胞运动、脑区的形成和心跳等胚胎发育事件，还 可以在胚胎之问移植组织甚至细胞，发育过程中的突变体也很容易就能被鉴 定出来。 在胚胎发育时期，其体型不会发生多大变化。一些技术和荧光染色获得胚胎 发育图，细胞及组织移植技术，全胚组织标本制作技术，及全胚原位杂交技术， 都可以在后期胚胎上实施。通过显微注射操作实施的转基因技术也已经比较 成熟1 3 埘。 目前一种新的手段注射反义吗咻环寡聚核苷酸以抑制某一特定基因的 表达的方法已经在斑马鱼上得到了很好的应用，这对研究某一个基因的功能 有了巨大的推动作用【9 1 。 此外，斑马鱼基因组的测序工作也已经完成i 。 目前，斑马鱼已应用于细胞系谱分析，突变鉴别，饱和诱变分析，基因转移 研究等领域，其可以将经典遗传学和胚胎观察与胚胎操作结合起来的优势使我们 有条件去鉴定分析控制胚胎发育和器官发生的基因，从而在发育生物学领域获得 突破性的进展，并带动生命科学和相关学科的变革和发展【1 1 】。 1 2 斑马鱼早期胚胎发育阶段 根据斑马鱼在受精后3 d 之内发育过程中的主要形态变化，可以将其胚胎发 生过程分为8 个大的时期受精卵期( 受精开始) 、卵裂期( 受精后o 7 5 h 开 始) 、囊胚期( 受精后2 2 5 h 开始) 、原肠胚期( 受精后5 2 5 h 开始) 、分节期( 受 精后1 0 h 开始) 、咽胚期( 受精后2 4 h 开始) 以及孵化期( 受精后4 8 h 开始) ，然 后进入幼鱼阶段( 受精后3 d ) 1 1 2 】( 见表1 1 和图1 2 ) 。 1 3 斑马鱼早期的细胞运动以及命运图谱 斑马鱼的胚胎发育过程为一个不完全卵裂的过程( 又叫偏裂) ，即卵裂的过 程主要发生在动物极，为端黄卵。在发育n t1 2 8 细胞期时，胚胎进入囊胚期， 这时胚胎除分裂外主要的细胞运动为外包，它的基本任务是将积累的分裂球或者 胚盘铺展到卵黄细胞的表面。在经过两次分裂进入中囊胚过渡期，此时细胞分裂 变慢，分为3 种细胞：与卵黄接触的卵黄多核层( y s l ) ，位于胚胎最外层的表 山东师范大学硕士学位论文 胚层( e v l ) 以及位于上述二者之间的深层细胞( 仅有该细胞才发育为胚 表1 1 斑马鱼早期发育的各个时期 胎的本体) 。在胚胎进入原肠胚之后，细胞除了外包外还进行内卷和汇聚运动。 分裂球的内卷发生在胚盘的全部边缘。导致了内部细胞层的形成。内部细胞层， 即下胚层，将会衍生出中胚层( m e s o d e r m ) 和内胚层( e n d o d e n n ) 。而外层细胞， 即上胚层( 外胚层e c t o d e r m ) ，将产生表皮和神经外胚层。在外包和内卷的同时， 上胚层和下胚层的细胞都向胚胎的背侧集中，形成了躯体轴线的原基，也就是所 谓的“胚盾( e m b r y o n i cs h i e l d ) ”，它是胚胎背部的标志。胚盾是斑马鱼发育的组织 中心，具有类似与爪蟾的胚孔背唇或者鸡与小鼠的亨氏节( h e n s e n sn o d e ) 的功 能。斑马鱼在形成了3 个胚层后，其各部分细胞也就有了相应的发育命运。图 8 山东师范大学硕士学位论文 1 3 表示了斑马鱼胚胎原肠作用的主要运动，图1 4 简要的列出了斑马鱼胚盾时 期各个胚层的位置以及各处细胞的不同发育命运3 1 在胚胎原肠期随着原肠作用的进行，胚盾两侧的细胞通过胚盾分别向其前后 两端运动，在背部向前形成脊索前板区域，向后运动形成了脊索【1 4 - 1 5 。脊索前部 将发育为胚胎前部的孵化腺以及头部中胚层组织【l q ，而后部的脊索则会对后部 的神经组织、体节、脊髓等的发育有影响旧 圈1 3 原肠中期斑马鱼胚胎的原肠运动，包括延伸( e x 把- n s i o n ) 。内卷( i n v o l u t i o n ) ，外包 ( e p i b o 哆) 汇聚( c o n v e r g e n c e ) 等 图1 4 胚盾期斑马鱼的结构草图c a ) 以及各处细胞的命运图谱( b ) ，其中p c p 指的是 脊索前板，n o t o c h o r d 指的是脊索 2 s p r 2 的研究综述 2 1s p r 2 的研究综述 9 山东师范大学硕士学位论文 2 2 is p r 2 的分子结构和功能 s p r 2 是斑马鱼胚胎发育过程中在中胚层和外胚层中特异表达的基因，基因 全长为1 9 8 1 b p ，最大编码框为1 0 7 5 b p 。它可编码一种s p l l i k e 转录因子家族成 员大多数s p l - l i k e 家族的成员在哺乳动物中被鉴定，其中人类基因组中有2 1 个s p l - l i k e 编码蛋白，在其他物种如爪蟾、蠕虫和果蝇中也有发现。s p l 在1 9 8 0 年被鉴定出来，成为此家族中第一个在哺乳动物细胞中被纯化和克隆的转录因 子通过原位杂交的方法，s p r 2 首次从斑马鱼c d n a 文库中被鉴别出来，被认为 是在斑马鱼的早期发育中具有特定表达模式的基因s p l - l i k e 转录因子家族的 系统发生分析如图所示， 图2 is p l - l i k e 家族系统发生图 作为一个位点特异性的转录因子，s p l l i k e 拥有三个基本的结构域：d n a 结合结构域、核定位信号结构域、转录调节结构域。s p l li k e 家族蛋白的显著 山东师范大学硕士学位论文 特征是拥有一个高度保守的与d n 结合的碳端锌指结构域。除d n a 结合功能外， 锌指结构同时也拥有通过蛋白之间的相互作用来调节d n a 结合的特异性之功能。 氮端有转录激活结构域，在各家族成员中差异显著，包含转录激活或抑制结构域。 s p l l i k e 家族蛋白结构如图所示 圈2 2s p l - l i k e 家族蛋白结构 s p l - l i k e 转录因子家族与锌指蛋白密切相关，它们可以调控复含大量g c 启动子的基因，在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化和细胞转化中都可能发挥作用。 独立的s p l - l i k e 转录因子可与不同的启动子和互作蛋白结合，发挥增强子或抑 制子的作用。最新研究表明大多数s p l - l i k e 家族成员可以通过与转录抑制因子 或激活因子相互作用发挥其转录调控的功能。 2 2 2s p r 2 的作用机豺和研究现状 l l 山东师范大学硕士学位论文 从5 体节时期斑马鱼胚胎的c 1 ) n a 文库中应用基因芯片技术筛选得到了对 f g f 信号通路响应的新基因s p r 2 。最新研究发现在斑马鱼胚胎发育的后囊胚期和 前原肠胚阶段，s p r 2 在上胚层和下胚层中表达；其后在中胚层和一些神经组织 中表达。 整铺片原位杂交显示：s p r 2 转录首先在3 0 的胚胎背部外包发现。随着外包 继续进行，s p r 2 表达区域向腹部延伸，在这个时期，s p r 2 在上胚层和下胚层都 有表达。s p r 2 表达的边缘区域与n t l 表达区域重叠，暗示了这些表达s p r 2 细胞 将会向发育为中胚层。根据斑马鱼原肠胚原基分布图( k i m m e le ta 1 ，1 9 9 0 ) 以 及s p r 2 晚期转录产物的分布，位于动物极n t l 区域前的s p r 2 表达细胞应该会发 育为神经外胚层。在原肠期，s p r 2 表达区域继续沿前后轴向背部扩展，在7 5 的外包期，s p r 2 在背部的表达延伸至前部限制区域，预示了中脑的标志沿背 部中线的径向切片揭示了s p r 2 表达在下胚层和上胚层从而暗示了s p r 2 表达细胞 可能会发育为中胚层和外胚层组织。在外包末期，s p r 2 表达谱与前期基本一致。 在分节前期。s p r 2 在尾部神经脊处大量表达，在分节期s p r 2 也表达在如血液、 尾芽和发育中体节等组织部位其后的发育过程中，在2 4 h p ts p r 2 表达量降低， 仅仅在尾部的大部分区域可以检测到，而在一3 6 h p t ，原位杂交没有检测到s p r 2 的表达。 图2 3 斑马鱼s p r 2 表达谱 山东师范大学顼士学位论文 2 2 s p r 2 研究前景 功能与相关信号通路信号通过s p r 2 基因敲除实验和过量表达实验，可知 s p r 2 的活性受到f g f 、n o d a l 、i n t 信号通路的协同控制。在中胚层发生早期。s p r 2 可以通过调控f g f 信号通路调控中胚层的发生，从而表达一些活性蛋白因子来调 控中胚层相关组织器官的发育。除f g f 信号外，s p r 2 还与多个信号转导过程如 v n t ，n o d a l 等相关，这些信号通路在胚胎早期发育过程中都起到重要作用因 此我们将其作为重点研究对象，拟通过酵母双杂交、免疫共沉淀，显微注射和整 胚原位杂交等实验手段对其进行深入研究。f g f ( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ) 是 由2 0 多种多肽因子成员组成的一个大家族，其中f g f l 是酸性f g f ，f g f 2 被称作 碱性f g f ，f g f 7 被称作角质化细胞生长因子在脊椎动物中已经发现多种不同的 f g f ，它们可以通过改变r n 的剪切或起始密码子从而在不同组织中形成上百种 蛋白异构产物。f g f s 与受体酪氨酸激酶( f g f r 卜f g f r 4 ) 及h s p g s 结合使后者 形成二聚体，从而激活了受体酪氨酸激酶活性，引起细胞内c a ”水平升高、磷酸 酯酶c 的活化以及特定信号通路的激活，如促有丝分裂蛋白激酶姒p k 途径及 p 1 3 - 激酶a k t 途径的激活。m a p k 途径在细胞增殖与分化中起重要作用( 图2 4 ) ， 丽p 1 3 - 激酶a k t 途径与细胞的生存有关。f g f s 与许多发育功能密切相关，包括 血管生成、中胚层的形成及神经轴突的延伸。不同f g f s 之间具有替代效应，很 难准确确定单个f g f 的特异性功能，一般可根据其时空表达谱推断功能。f g f 2 在血管生成中起着至关重要的作用，f g f 8 在中脑和四肢的发育过程中发挥重要 作用 图2 5f 6 f 信号通路的调控 山东师范大学磺士学位论文 在上面一条信号激活通路中，f g f 信号通路通过f g f r ，f r s 2 ，s h p 2 ，g r b 2 ， s o s ，r a s 和r a f 途径传递信号；在下面一条抑制通路中，由于s p r o u t y 2 ( s p r y 2 ) 与f r s 2 和g r b 2 结合从而使s h p 2 从f r s 2 和g r b 2 上脱落，从而阻止下游的s o s ， r a s 埘p ，r a f 途径的激活，最终导致m a pk i n a s e e r k 2 不能被激活。 f g f 信号通过转录因子b r a c h y u r y x b r a n t l ，介导，在脊椎动物中胚层形成 的早期发育过程中起到至关重要的作用。同n o d a l 信号一样，其在脊椎动物中胚 层诱导中的作用高度保守。f g f 信号被认为是接替n o d a l 信号从而起到中胚层诱 导的作用，s p r 2 参与此信号接替过程。实验表明，注射s p r 2m r n 提升n t l 表 达量，并且可以降低x f d 对n t l 的抑制作用。相反，s p r 2 敲除抑制n t l 的表达 并且降低了f g f 对n t l 的诱导作用。在对n t l 的正调控过程中，s p r 2 起到调节 者丽非激活者的作用。同时，n t l 表达的维持也需要s p r 2 的作用。实验推测 b r a c h y u r y x b r a n t l 可能是s p r 2 直接作用的靶点，然而我们需要进一步的生化 和分子方面的研究去证明s p r 2 在b r a c h y u r y x b r a n t l 转录调节中的作用。 圈2 5s p r 2 过量表达与敲除实验结果 1 4 山东师范大学硕十学位论文 s p r 2 的表达依赖于n o d a l ，f g f ，w n t 信号。实验表明，n o d a l 信号在背侧为 s p r 2 的激活所必需，在腹侧为维持s p r 2 表达所必需。f g f 信号是s p r 2 在下胚层 表达所绝对必需的，从而引起中胚层组织的发生，然而在上胚层中s p r 2 的表达 只是部分依赖于f g f 信号。f g f 与w n t 两条信号通路对于s p r 2 在神经外胚层中 的表达所必需。 w n t 信号调控脊椎动物发育过程中的多个过程，包括原肠形成期沿背腹轴的 中胚层的模式形成以及沿前后轴的神经外胚层的模式形成。最新研究表明，整个 胚胎的基于微阵列的d n a 分析已经可以精确的探测到斑马鱼中的w r i t 调控基因。 研究发现，s p l 相关的转录因子s p 5 一l i k e ( 以前被称作s p r 2 ) 是斑马鱼原肠形 成过程中的w r i t 信号的直接靶点并且与其旁系同源物s p 5 一起于w n t 8 下游介导 信号传递从而调控中胚层和神经外胚层的模式形成。 最新研究发现在原条发育过程中，s p r 2 可调控a t f 7 a 的表达而a t f c r e b ( 激活转录因子环腺苷酸应答元件绑定蛋白) 转录因子家族在控制细胞增殖、 凋亡和肿瘤形成的方面都起到重要的调控作用。 由于中胚层是器官发生的重要基地，这一发现对研究脊椎动物早期胚胎的发 育机理非常重要。因此，我们以s p r 2 为诱饵蛋白，通过酵母双杂交系统从斑马 鱼早期胚胎e d n a 文库中筛选可能与s p r 2 蛋白相互作用的蛋白，进一步探索其在 f g f 等信号通路中的作用机制。 3 酵母双杂交系统综述 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相 互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式 生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间 的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏 度的研究蛋白质之间关系的技术。 山东师范大学硕士学位论文 3 1 酵母双杂交系统的发展简史和应用现状 1 9 8 9 年，f i e l d s 和s o n g 创立了一种崭新的遗传学方法用于研究蛋白质之间 的相互作用，即酵母双杂交系统【4 1 1 ，它是一种直接作用于细胞内部检测蛋白与 蛋白相互作用、灵敏度很高的新方法，自建立以来得到了不断的完善和改进，已 经成为分析蛋白质相互作用的重要方法之一。 近几年来，双杂交系统不断改进，发展出了许多的新技术，对传统的双杂交 系统做出了重要的补充和扩展。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于只采用 p 一半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，其表达往往不能十分严谨的加以控制， 容易产生一些假阳性。目前大多数双杂交系统往往同时使用两个或三个报告基 因，其中一个是l a c z ，这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结 合位点，可以被相同的转录激活因子激活，通过多重选择既提高了检测的灵敏度 又降低了假阳性的几率【4 2 】。 1 9 9 5 年，l e o o u a r i n 等i 卸构建了一套新的双杂交系统，用 g a 3 基因作为 报告基因，该方法比l a c z 基因表达在含有x - g a l 的培养基上生长的颜色反应更 为精确。由于双杂交系统中b d - x 与a 胪y 在酵母细胞核内才能发生相互作用，限 制了大量非核内蛋白的相互反应，a r o n h e i m 等构建了s o s 恢复系统，通过r a s 途径冲破了该限制。近几年来还建立了哺乳动物细胞的双杂交系统，r o s s i 掣4 5 】 利用b 一半乳糖苷酶构建的杂交体系成功地在成肌细胞中表达。1 9 9 3 年还发展了 一种研究蛋白质与d n a 相互作用的酵母单杂交系统 4 6 1 ，与双杂交系统的不同之 处在于a d 融合蛋白y 直接与d n a 结合位点相结合，使a d 直接激活启动子下游报 告基因的表达。一些科学家如v i d a l 等f 4 7 j 发展出了反式双杂交系统，s h i n 等发 展出了分裂双杂交系统，z h a n g 和l a u t o r 等 4 8 1 成功应用了蛋白三杂交系统。这 些发展为杂交系统的完善和应用做出了可喜的贡献。 经过发展的酵母双杂交技术应用领域广阔，目前主要应用在高灵敏度的检测 蛋白一蛋白相互作用，寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白，寻找具有药物治疗作用 的小分子多肽，寻找调控蛋白质相互作用的化合物，蛋白质相互作用图谱绘制等 领域。其中酵母双杂交系统最广泛最有价值的应用是寻找与靶蛋白相互作用的新 蛋白，这已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定 的c d n a 文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可 1 6 山东师范大学硕士学位论文 以分离得到a d - l i b r a r y 载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的c d n a 片段， 并对该片段的编码序列在g e n e b a n l 【中进行比较，研究与己知基因在生物学功能 上的联系另外，也可作为研究已知基因的新功能或寻找筛选到的多个已知基因 之间功能如何相互关联的主要方法。 3 2 酵母双杂交系统的应用原理 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控起始过程的认识。细胞起 始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录 因子g a l 4 在结构上是组件式的( m o d u l a r ) ，往往由两个或两个以上结构上可以 分开，功能上相互独立的结构域( d o m a i n ) 构成，其中有d n a 结合功能域( d n ab i n d i n g d o m a i n ，d n a - b d ) 和转录激活结构域 ( a c t i v a t i o nd o m a i n ，d n a - a d ) 。这两个结 合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能 激活转录，只有当被分开的两者通过适当的 途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完 整的g a l 4 转录因子活性，并可激活上游激 活序列( u p s t r e a ma c t i v a t i n gs e q u e n c e ， u a s ) 的下游启动子，使启动子下游基因得 到转录( 见图3 1 ) 。 图3 1 酵母双杂交应用原理示意 3 3 酵母双杂交系统的基本程序和关键因素 根据这个特性，将编码d n a - b d 的基因与已知诱饵蛋白( b a i tp r o t e i n ) 的 基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白( b d - b a i t p r o t e i n ) 。将编码 d 的基因和c d n a 文库的基因构建在a d - l i b r a r y 表达载体上 同时将上述两种载体转化改造后的酵母细胞，这种改造后的酵母细胞如 m a t c h m a k e r 酵母双杂交系统的a h l 0 9 酵母菌株和y 1 8 7 酵母菌株( 见图3 2 ) 的 基因组中既不能产生g a l 4 ，又不能合成l e u 、t r p 、h i s 、a d e ，因此，酵母在缺 1 7 山东师范大学确士学位论文 乏这些营养的培养基上无法正常生长当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相 互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因h i s 、 a d e 、i a c z 、m e l i ，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应 的酵母菌株中的a d - l i b p “i r y 载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因 进行测序和分析工作 图3 2 酵母菌株a h l 0 9 和y 1 8 7 的报告基因结构 值得提出的是在阳性克隆筛选中，除用缺陷型培养基进行初筛，要辅以x g a l 检测。( 分为x o c a l 和x b - 6 a l 检测) 下面以x 一9 嘲1 检测为例说 明。x - g a l 分析是一种敏感的比色检测方法，x - g a i 是作为b 一半乳糖苷酶的底 物丽起作用的( 对于琼脂平板来说不推荐使用g a l a c t o n - s t a r 是因为会造成较高 的背景) 。这种检测b 一半乳糖苷酶活性的方法最早用来去除在g a l a 酵母双杂交 或单杂交中从h i s 3 筛选中剩余的共转化体。酵母中的l a c z 基因在完整的g a l l u a s 的调控下可以诱导8 一半乳糖苷酶以较高水平表达，所以当诱饵蛋白和文库 蛋白相互作用时，6 a l lu a s 被激活，会开启l a c z 的表达，从而产生8 一半乳糖 营酶使底物显蓝色 3 4 酵母双杂交系统的应用优势 同以往研究蛋白质蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有 独特优势： 山东师范大学硕士学位论文 3 4 1 真实性 融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天 然的折叠状态，表达的融合蛋白能进行一些基本的修饰( 如糖基化和磷酸化等) ， 并可在细胞核中产生交互作用，类似其在体内生理状态下的情况。而生物化学史 上所应用的交联、免疫、共沉淀、亲和层析等方法均采用体外实验来研究蛋白间 的相互作用，受到外界实验条件、环境、方法的影响，因而较之后者，双杂交系 统所证实