（细胞生物学专业论文）鱼类il1β和il1r1like基因的分子克隆和鉴定.pdf

浙江人学顺i j 学位论义摘要 摘要 白细胞介素1 ( i n t e r l e u k i n 1 ，i l 1 ) 是在局部和全身炎症反应中起关键作用 的细胞因子，包括i l 10 【和i l 1 1 3 ( 又分别被命名为i l 1 f 1 和i l 1 f 2 ) 。目前，i l 一1 家族在哺乳动物中共发现了i 】个因子，包括i l 1 f 1 i l i f l l ，但是在鱼类或其他低 等脊椎动物中，除i l 1 b 、i l 1 8 和i l 1 r a 之外的家族成员尚未被发现。i l 1 的 生物学效应通过结合其受体，即i l 1 受体( i l 1r e c e p t o r ) 后的信号转导来实现。 i l 1 受体家族包括i 型受体( i l 1 r 1 ) 、i i 型受体( i l 1 r 2 ) 和i l 1 受体辅助蛋白( i l i r a c p ) 。 本文利用生物信息学技术，在河豚鱼( t e t r a o d o nn i g r o v i r i d i s ) 中，成功地预 测并克隆了i l 1 1 3 基因和i l 1 r l 样基因( t e t r a o d o ni l 1 r i l i k e ) ，并且利用d n a 重组技术构建了t n l l 1 p 原核表达载体，转化表达菌株b l 2 1 ，经i p t g 诱导， 成功表达并纯化到t n l l 1 p 蛋白，制备了t n l l 1 p 兔抗血清。t n l l 1 1 3 含有4 个 外显子，3 个内含子，开放阅读框( o r f ) 长度为7 7 4 b p ，编码2 5 7 个氨基酸。启 动子区域含有t a t ab o x 、n f k b 、c e b p 、a p l 、c c a a t 等转录因子结合位点 等，3 u t r 含有5 个a t t t ai n s t a b i l i t ym o t i f , 将t n l l 1 1 3 的o r f 亚克隆到原核 表达载体p e t 4 1 a 上，成功构建了重组表达载体t n l l 1 1 3 一p e t 4 1 a 。用i p t g 诱导 使表达菌株b l 2 1 大量表达t n l l 1 d 蛋白，n i n t a 纯化后能够得到分子量为 6 0 1 k d 的纯化条带。t n l l 1 r 1 l i k e 基因共有1 1 个外显子，o r f 长度为1 9 0 2 b p ， 编码6 3 3 个氨基酸，含有3 个i gd o m a i n ，1 个跨膜区，1 个t i rd o m a i n 。 综上，本研究为后续开展鱼类i l 1 和i l 1 r 的功能和相互作用关系研究奠 定了基础，对研究鱼类免疫系统功能和基因进化具有重要的意义。 关键词：鱼类、t e t r a o d o n 、i l 1 d 、i l 1 r i 1 i k e 、基因克隆，原核表达 i l 浙江人学颁| j 学位论文摘要 a b s t r a c t i n t e r l e u k i n - 1p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h el o c a la n ds y s t e m i ci n f l a m m a t o r y r e s p o n s e ，i n c l u d i n gi l l e ta n di l - 11 3 ( n a m e da si l 一1f1a n di l 一1f 2 ，r e s p e c t i v e l y ) a t p r e s e n t ，t h ei n t e r l e u k i n - 1f a m i l ya r i s e di n v e r t e b r a t e sc o n s i s t so f11k n o w ng e n e s e n c o d i n gl i g a n d s ( i l - 1f 1t oi l 一1f11 ) b u tt od a t e ，n oo r t h o l o g u et oi l 一1pi sf o u n d i n f i s ho ro t h e rl o wv e r t e b r a t e s i l - 1f u n c t i o n sb yb i n d i n gt h e i rr e c e p t o r s ，i l 一1 r e c e p t o r , t om e d i a t es i g n a lt r a n s d u c t i o n t or e a l i z et h e i rb i o l o g i c a le f f e c t s i l 1 r e c e p t o rf a m i l yc o n t a i n st y p eir e c e p t o r s ( i l 一1ri ) ，t y p ei ir e c e p t o r s ( i l 一1r 2 ) ，a n dt h e i l 一1r e c e p t o ra c c e s s o r yp r o t e i n ( i l 一1r a p ) i nt h i ss t u d y , w ed e v e l o p e db i o i n f o r m a t i c sm e t h o d sb a s e do ng e n o m i cd a t a b a s e s ， s u c c e s s f u l l yc l o n e di l - 11 3g e n ea n di l - 1r l i k eg e n ei nt e t r a o d o n ，a n do b t a i n e d r e c o m b i n a n tt n i l 一1 1 3p r o t e i na n dr a b b i ta n t i i l - 11 3s e r u m t n i l 一1bc d n a c o n t a i n s4 e x o n s ，3i n t r o n sa n da7 7 4 b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) t h ep e p t i d ed e d u c e df r o m o r fi s2 5 7 a ai ns i z e t n l l 一1bp r o m o t e rc o m p r i s e ss e v e r a lt r a n s c r i p t i o nb i n d i n gs i t e s ， s u c ha st a t a b o x ，n f k b ，c e b p , a pi ，c c a a t , a n ds oo n ，3 u t rc o n t a i n s5 a t t t a i n s t a b i l i t ym o t i ar e c o m b i n e dp l a s m i dt n i l - 11 3 - p e t 4 1aw a so b t a i n e db y s u b - c l o n i n gt h eo r fo ft n i l 一1di n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dp e t 4 1aa n d s e q u e n c e d t a r g e t6 0 1k dp r o t e i nw a se x p r e s s e da f t e ri p t gi n d u c ea n dp u r i f i e db y n i - n t a t n i l - 1r l i k eg e n ec o n t a i n s11e x o n s ，a n da19 0 2 b po r f , c o d i n g6 33a a ， w h i c hh a s3i gd o m a i n ，1t r a n s m e m b r a n ed o m a i n ( t m d ) ，a n d1t i rd o m a i n a l lt h er e s u l t sl a yf o u n d a t i o ni nf u n c t i o ns t u d i e so ff i s hi l 一1ba n di l 一1r ，a n di s i m p o r t a n tf o rf i s hi m m u n es y s t e mr e s e a r c ha n de v o l u t i o n o fi m m u n o l o g yg e n e s k e y w o r d s ：f i s h ，t e t r a o d o n ，i l 一11 3 ，i l - 1r 1 - l i k e ，g e n ec l o n i n g ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n i i i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王j 告签字日期：伽o 年歹月9 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝婆盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝垄盘鲎 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：王浩 签字日期：扣口 年) 月c 7 日 导师签名： 签字日期：fp 断缈 年己月写日 ，t 浙汀大学硕f ? 学位论文致谢 致谢 时光飞逝，本人短短的两年半的硕士研究生生活即将结束。在此论文完成 之际，我由衷地感谢我的导师邵健忠教授和项黎新副教授在本人攻读硕士期间的 悉心指导、谆谆教诲和热情帮助。两位导师在学术研究中透露出的严谨细致的工 作作风、一丝不苟的科研态度让我受益匪浅 邵老师曾经引师说里的话对我讲：“师者，所以传道授业解惑也”，我深 以为然，学生求学之道也在于此。在年轻的时候，能够在浙江大学这样历史悠久、 学风优良的高等学府里求学问道，能够有邵老师和项老师这样负责任的老师帮助 答疑解惑，是一件非常幸运的事。能够在邵老师主持的这样一个和谐、进取、有 创造力的实验室里学习，是非常令人愉快的事。所以在此还要感谢实验室的各位 同仁，实验室良好的科研氛围是与大家的团结互助分不开的。 首先要感谢董伟仁师兄、彭博师姐、方玮师兄，温轶师姐、巩永凤师姐、金 红建师兄、林爱福师兄、胡玉兰师姐、陈烨师兄、顾一峰师兄、熊然师兄、金阳 师兄、施科云师姐、潘若浪师兄、张瑞鹏师兄、张晓蕾、王渠龙、潘萍萍、张晓 瑜，感谢你们对我的帮助和鼓励! 感谢我的父母! 他们为我的成长付出了许多，毕业之后，我一定会用我全 部的力量报答你们! 最后对所有支持、鼓励和关心我的人表示深深的谢意! 浙江人学硕i j 学位论文 文献综述 文献综述 1 i l 1 基因研究 白介素1 ( i n t e r l e u k i n 1 ，i l 1 ) 家族是一类多功能的细胞因子【i 】，现在在哺乳动 物中共发现了1 1 个成员( i l 1 f 1 。i l 1 f 11 ) t 2 1 。和成纤维细胞生长因子家族一样， i l 1 家族的成员也有1 个b 三叶草折叠( 3 - 折叠链盘绕形成近似的具有三重对称 轴的“三叶草”样结构) ，由12 个p 折叠组成【3 】( 见图1 ) 。 i l 1 有两种类型，i l 1 a 和i l 1 i j ，主要是由巨噬细胞和单核细胞产生【4 1 。i l 10 【 存留在细胞内，在剧烈炎症反应中，伴随着细胞的溶解，i l 1 a 被释放。i l 1p 前体分子在被特异性的分解之后，将i l 1 d 分泌出来，之后才具有生物学的活性， 实现多种生物学功能【5 1 。 i l 10 【和i l 1 p 具有2 3 的氨基酸同源性，主要是由巨噬细胞和单核细胞产 生。并且产生时都是没有信号肽的前体分子。i l 10 【的前体分子具有生物学活性， 主要分布于胞内，少量分布于细胞表面。细胞死亡时i l 1 a 会释放，然后被相应 的蛋白酶分解产生约1 7 k d a 的成熟肽。而i l 1 6 的前体分子却是无活性的，必须 被i l 1d 转化酶( i c e ) 分解，并由细胞分泌才能发挥作用。i c e 具有天冬氨酸 特异性，分解过程不需要信号肽，i c e 缺陷型小鼠不能释放成熟的i l 1 b 。最近 的晶体结构研究证明，i l 10 【和i l 1 b 结合在i l 1 受体( i l 1 r i ) 的两个不同位 点上，分别是受体的前两个结构域( 位点a ) 或者第三个结构域( 位点b ) 6 1 2 i l 1 的生物学功能 i l 1 是在局部和全身炎症反应中起关键作用的细胞因子，它能诱导其它炎症 细胞因子( 如i l 4 、i l 6 等) 、趋化因子、粘附分子、急性时相反应蛋白 ( a c u t e p h a s e r e a c t a n t s 。a p r ) 和组织重建酶等的合成【7 1 。 i l 1 在多种基因表达，多种细胞因子受体的过表达，氮氧复合体的招募中都 发挥重要作用。与i l 1 相关的症状包括炎症期间的发烧、食欲不振等。i l 1 可 以促进淋巴细胞、巨噬细胞、n k 细胞活化，是嗜中性粒细胞和单核细胞的化学 诱导物，参与t h 2 免疫应答反应( 引。 浙 学颅学证论文 文献综述 围1 p y m o l 软件模拟出的人类i l i b 蛋白空间结构图数据柬自p r o t e i n d a t a b a n k ( p d b ：3 i b b 数据库，使用的是晶体x 光衍射技术田中可以清晰的看到 i l - l b 的b - 三叶草折叠和其中的1 2 个d 折叠 - 7 琳巴细胞和集落刺激因子不同的是i l l 几手能影响所有的细胞类型，并 且与其它细胞四子或耆小中介分子都有联系i _ ”许多淋巴细胞和集薄刺激园子对 浩疗有益，i l 1 却是一个高度促炎因子，对人体而百，i l i 介于临床有益园子和 致病园子的边缘与此对应的是，能够抑制i l ，l 的产生或者发挥功能的固子， 在临床上都能发挥作用越来越来的证据表明，i l 1 尤其是i l - l b 的产生和功能 的发挥，都受到了严格的调控机体产生了特异性的“路障”，以减弱疾病中i l 1 的免疫应答这种调控不只体现在控制基因的表达、合成和分泌，还通过表面受 体、可溶性的受体和受体拮抗剂发挥作用研究发现，人类可以通过注射i l l ( i t i q 或i l - i i j ) ，促进骨秭恢复和治疗癌症f 1 1 l 1 和许多外舜性的疾病相关，比如寄生传染i l 1 可以彰响到多种寄生虫 病通过与免疫系统其它构件相协作的方式，或者招葬抗寄生的复合物，i l - l 可以限制寄生虫的扩散和在宿主细胞中的存活尽管如此，作为一个促炎固子， i l i 在特定情况下也能产生不利影响，还可能加剧某些寄生虫病的感染 i o 】 浙江人学硕j j 学位论义 文献综述 3 i l 1 p 与肿瘤 i l - i 3 是一非常重要的促炎症细胞因子，在免疫损伤机制中起着主要的调节 作用。近年来发现多种肿瘤中有i l 1 6 的表达，并且与c o x 2 的表达存在相关 性，提示i l 1 b 是一种有力诱导c o x 2 表达的细胞因子【1 1 】。m o o l w a n e y 等在神 经胶质瘤和神经母细胞瘤细胞中发现1 l 1 8 通过p 3 8 m a p k 途径诱导c o x 2 基因 表达【1 2 】。d u q u e 等则认为i l 1 f ) 诱导c o x 2 通过另外两种途径得以实现，即核 因子k b ( n f k b ) 依赖的转录和p 3 8 m a p k 介导的后转录【13 1 。m u k h o p a d h y a y 等通 过对n s c l c 的研究还发现，c d k 2 的活性对i l 1 b 诱导c o x 2 表达和p g e 2 的 合成起重要作用【1 4 】。j u n g 等对a 5 4 9 细胞系的研究发现，i l 1 p 通过包括n f k b 和c o x 。2 的经典炎症信号途径上调功能性h i f 1 a 蛋白，最终上调血管内皮生长 因子，后者为一种强效的血管生成因子，为肿瘤的生长和转移所必需【”】。 4 i l - 1 r a i n t e r l u k i n i r a ( i l 1 9 a ) 是i l 1 特异性的拮抗剂。通过对转录本的可变剪接， i l 1 r a 呈现和胞内型和分泌型的模式，分别对应i l 1 a 和i l 1 d 的成熟肽 1 6 】。 i l i r a 和i l 1 d 具有相对较高的同源性( 氨基酸相似度2 6 ) ，并且i l i r a 的信号肽和i l 1 b 的第一个外显子区的同源性很高，说明i l i r a 和有可能起源 于i l 1 b 基因在3 5 0 百万年前的一次复制【 】。 5 1 l l k i l 1 的生物学效应通过其受体后信号转导来实现。i l 1 受体家族包括i 型受 体( i l 1 r 1 ) 、i i 型受体( i l 1 r 2 ) 和i l 1 受体辅助蛋白( i l ir a c p ) 。转导i l - 1 刺激 信号的主要是i l 1 r i i l 1 r a c p 复合物，而i l 1 r i i 通过与i l 1 r i 竞争结合i l 1 起抑制作用。 i 型i l 1 受体( i l 1 r 1 ) 又名c d l 2 1 a ( c l u s t e ro fd i f f e r e n t i a t i o n1 2 1 a ) ，属于i l 1 受体超家族的成员，是i l 1 a 、i l 1 b 和i l 1 r a 的受体。i l 1 r l 参与多种细胞因 子诱导的免疫和炎症应答，和p i k 3 r 1 1 18 1 ，m y d 8 8 t 1 9 】【2 0 】以及i l l r a p 2 1 1 都有联系。 在人类染色体图谱上，i 型i l 1 受体( i l 1 r 1 ) 和i i 型i l 1 受体( i l 1 r 2 ) ，i l 1 3 珊太学硕i ：学n 论z 文献综述 受体样1 ( i l - i r l i ) 。i l - 1 受体样2 ( i l i r l 2 ) 聚粪成一个细胞因子受体基固簇 定位于2 号染色体上2 q 1 2 位置【2 2 脚i ， 田2 p y m o l 软件模拟出的 粪i l l r l 蛋白空闻结构图数据束自p r o t e i n d a t a b a n k ( p d b ) 数据库使用的是晶体x 光衍舸技术 i l - l r l 和i l - l r 2 都具有三个保守的胞外免疫球蛋白区，可以与i l - l 结合， 并且可以不簿要其它鞯助分子的帮助就与其配体结合研究表明，i l l 同1 型受 体和l i 型曼体的结合倾向因细胞类型的不同而不同i l - i r l 有一个长的胞质区， 錾与信号转导，而l l 1 r 2 的胞质区序列很短没有转穆转孕功能1 l - l r 2 的功 能是竞争性结合i l 1 ，降低它的生物学活性f 2 ”i l i r a 与i l 1 r 的结合则不会 诱发信号转导 i l i r 属于1 l - i t o l l 样受体( 1 l - l ，r l r ) 亚家族，i l i t l r 亚家族在哺乳动 物、昆虫和植物当中广泛存在，是参与机体防御和炎症反应的一个蹙体家族该 家族成员分子的特征是都具有2 0 0 个氨基酸组成的t o l i i l - 1r ( t i r ) 结构域，该结 构城具有三个保守的盒结构t i r 结构域对l l i 信号转导过程具有不可或缺的 作用 浙江大学硕士学位论文文献综述 6 i l 1 受体相关激酶i r a k s 途径 i l 1 r i 没有内在的蛋白激酶活性，因而需要结合并活化细胞浆蛋白激酶来进 行信号传导。i l 1 受体相关激酶 ( i n t e r l e u k i n ir e c e p t o ra s s o c i a t e dk i n a s e s ， i r a k s ) 家族就属于这样的蛋白激酶，研究表明，i r a k s 是i l 1 激活n f k b 和 a p 1 的重要调控分子【2 5 1 。 i r a k s 作为t i r 信号通路的重要连接体，在调节机体的自身免疫中起着重要 的枢纽作用家族成员包括i r a k l 、i r a k 2 、i r a k m 和i r a k 4 ，目前还鉴定出8 个剪接异构体其中i r a k l 和i r a k 4 有激酶活性，通过与m y d 8 8 和t r a f 6 连接 成复合物启动t l r s i l 1 介导的信号途径；而i r a k 2 和i r a k m 则无激酶活性，对 通路起着负调节作用2 6 1 。 7 磷脂酰肌醇3 激酶( p 1 3k ) 信号转导途径和j a k s t a t 信号通路 磷脂酰肌醇3 激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3k i n a s e ) 途径是g 蛋白偶联受体的 信号转导通路中的一种途径，在磷脂酰肌醇信号通路中胞外信号分子与细胞表面 g 蛋白耦联型受体结合，激活质膜上的磷脂酶c ( p l c d ) ，使质膜上4 ，5 二磷 酸磷脂酰肌醇( p i p 2 ) 水解成1 ，4 ，5 三磷酸肌醇( i p 3 ) 和二酰基甘油( d g ) 两个第二信使，胞外信号转换为胞内信号，这一系统又称“双信使系统”( d o u b l e m e s s e n g e rs y s t e m ) 。 p 1 3 激酶参与多种细胞因子的信号转导，细胞受到i l 1 刺激后，p 1 3 激酶与 i l ，1 i l 1 r i i l 1 r a c p 形成复合物【2 7 】。p 1 3 激酶继而通过一定的信号机制激活 n f k b 和a p 1 。有研究表明，细胞在静息状态下，p 1 3 激酶主要分布于细胞浆 中。当用i l 1 刺激细胞时，p 1 3 激酶进入细胞。这可能是p 1 3 激酶调控n f - k b 和a p 1 活化的一种机制 2 8 1 。 j a k s t a t ( j a n u sk i n a s e s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro ft r a n s c f i p t i o n ) 信号 转导途径几乎为所有细胞因子所共享。近期得研究发现i l 1 也能激活此通路。 m o r t o n 发现在i l 1 刺激的胰岛b 细胞中存在j a k s t a t 通路，该信号转导途径是 否存在于其它类型的细胞有待验证【2 9 1 。 浙汀人学顾p # 位论文 实验研究 实验研究 引言 作为最早出现的脊椎动物，鱼类在脊椎动物进化过程中占有重要的地位随着 近年来斑马鱼( d a n i or e r i o ) 、黑青斑河豚( t e t r a o d o nn i g r o v i r i d i s ) 、红鳍东方豚 ( f u g ur u b r i p e s ) 、青鲻( o r y z i a s a t i p e s ) 、三刺鱼( g a s t e r o s t e u sa c u l e a t u s ) 等模 式鱼类基因组e s t 计划的完成，给我们对于鱼类比较基因组学、生物信息学的研 究提供了极大的帮助，对于后续开展鱼类基因的发现及功能研究，探索基因在不 同物种间的遗传及进化规律，具有重要作用。要了解脊椎动物免疫系统的进化， 免疫相关基因的同系物在鱼类中的发现和功能研究无疑占有重要的地位。 i n t e r l e u k i nl ( i l 1 ) 是最早发现的细胞因子之一 3 0 】最初，i l 1 被发现能够参 与癌症的诱发，调节淋巴细胞增殖，增加骨髓细胞数量，并能造成骨关节的退化。 现在，更多的实验证实，i l 1 还具有内生性促炎因子，淋巴细胞激活因子，和单 核细胞因子的功能。1 9 8 4 1 9 8 5 年，研究发现i l 1 实际是由两个不同的因子组成， i l 10 【和i l 1 1 3 t 3 0 1 。 i l 1 亚家族最初的成员包括i l 1 a 和i l 1d ，i l 1 r a 3 1 1 ( i l 1r e c e p t o r a n t a g o n i s t ) i l 1 a 和1 l 1 d 都是免疫系统抵御感染的前炎症因子。i l i r a 则能够 与i l 1 和】l 1 1 3 的受体( i l 1 r ) 竞争性结合，阻止这两个因子发挥免疫学功能 【3 2 1 近年来，i l 1 亚家族又发现了其他因子，包括i l 1 8 3 3 】和6 个与i l 1 a 和i l 1 b 具有结构同源性的相关因子，分别被命名为i l l f 5 ，i l l f 6 ，i l l f 7 ，i l l f 8 ，i l l f i o 。 为了保持一致，i l 1 伐和i l - l f 3 ，i l 1 r a 被相应的命名为i l l f l ，i l l f 2 ， i l lf 3 t 3 4 】【3 5 】。 最近又有一个新发现的因子命名为i l 3 3 t 3 6 1 ，又名i l l f l l ，它被推定为i l l 家族的新成员，虽然这个基因还没有被h g n c 基因家族命名数据库官方网站 ( h t t p ：w w w g e n e n a m e s o r g ) 收录。 i l 1 8 由巨噬细胞、单核白细胞、树突状细胞产生，在机体炎症免疫应答中 6 浙江大学硕 ：学位论文实验研究 发挥重要作用。i l 1b 可以增加内皮细胞黏附因子的表达，促进白血球转移到感 染处，并影响下丘脑温度调节区，使之提高机体温度，促成炎症的发生。机体温 度的提高可以帮助免疫系统抵御病源入侵。i l 1 家族的另一个成员因子i l 10 【也 具有相似作用，所以i l 1 因子又被叫做内生性热源。i l 1 p 对调节造血有重要作 用。在周边组织的中产生的i l 1 b 还和炎症相关的痛觉过敏有关【5 1 。 i l 1 的生物学效应通过其受体后信号转导来实现。i l 1 受体家族包括i 型受 体( i l 1 r 1 ) 、i i 型受体( i l 1 r 2 ) 和i l 1 受体辅助蛋白( i l ir a c p ) 3 7 。转导i l 1 刺激信号的主要是i l 1r i i l 1r a c p 复合物【38 1 ，而i l 1r i i 通过与i l 1 r i 竞争结 合i l 1 起抑制作用。 i 型i l 1 受体( i l 1 r 1 ) 又名c d l 2 1 a ( c l u s t e ro fd i f f e r e n t i a t i o n1 2 1a ) ，属于i l 1 受体超家族的成员，是i l 1 a 、i l 1 b 和i l 1 r a 的受体。i l 1 r 1 参与多种细胞因 子诱导的免疫和炎症应答。在人类染色体图谱上，i 型i l 1 受体( i l 1 r 1 ) 和i i 型 i l 1 受体( i l 1 r 2 ) ，i l 1 受体样i ( i l - 1 r l l ) ，i l - l 受体样2 ( i l 1 r l 2 ) 聚类成一 个细胞因子受体基因簇，定位于2 号染色体上2 q 1 2 位置【2 2 】【2 3 1 。 浙江大学硕士学位论文实验研究 第一节河豚i l 1 p 基因的分子克隆和生物信息学分析 1 1 河豚i l - ld 基 1 1 1 数据库 因的预测与分子克隆 本章中所涉及的数据库和地址： n c b i ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) ；u c s c ( h t t p ：g e n o m e u c s c e d u ) ； e n s e m b l ( h t t p ：w w w e n s e m b l o r g ) ；s o f t b e r r y ( h t t p ：l i n u x1 s o f t b e r r y c o m 黑青斑河豚( t e t r a o d o n ) 基因组数据库 红鳍东方纯( f u g u ) 基因组数据库 三刺( o a s t e r o s t e u s ) 基因组数据库 在线网络软件主要包括： n c b im e g ab l a s t ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t t r a c e m b s h t m l ) s i g n a l pv 3 0 ( h t t p ：w w w c b s d t u d k s e r v i c e s ) c o m p u t ep i m wt o o l ( h t t p ：c n e x p a s y o r g t o o l s p i _ t 0 0 1 h t m l ) s c a n p r o s i t e ( h t t p ：c n e x p a s y o r g t o o l s s c a n p r o s i t e ) c a p 3s e q u e n c ea s s e m b l yp r o g r a m ( h t t p ：p b i l u n i v - l v o n l , f r c a p 3 p h p ) g e n e s e q e r ( h t t p ：d e e p c 2 p s i i a s t a t e e d u c g i - b i n g s c g i ) g e n s c a nw e bs e r v e ra tm i t ( h t t p ：g e n e s m i t e d u g e n s c a n h t m l ) e x p a s yb l a s t n e t w o r ks e r v i c e ( h t t p ：c n e x p a s v o r g t o o l s b l a s t ) g e r i ei n d i c e s b l a s ts e a r c h g e n e m a p e r ( b 鲢p ；g 曼坠曼蛩玉垒乜丛：g q q g ! 曼卫垒g 曼墨：璺q 皿 浙汀人# 6 ! i 学位论史 实验研究 1 1 2 实验材料和方法 1 1 2 1 试剂 本研究选用1 龄河豚鱼( t e t r a o d o nn i g r o v i r i d i ) ，体重约4 - 6 9 ，长4 5 厘米， 饲养于2 6 ( 2 的恒温循环水族箱中，每日喂以其体重o 7 的食物。所有实验鱼均 饲养两周以上，以充分适应实验室环境，并观察其外观和活动能力。确认健康后， 用于实验研究。 l p s 、r n a 酶购自s i g m a 公司；总r n a 提取试剂盒t r i z o l 购自g i b c ob r l 公司；r n ap c rk i t ( a m v ) v e r 3 0 逆转录试剂盒、3 - f u l lr a c ec o r es e t 试剂盒 及各种限制性内切酶购自t a k a r a 公司；琼脂糖购自s a n l a n d c h e mi n t e m a t i o n a l i n c ；d n at a q 酶、d n t p 和p c rb u f f e r 购自北京鼎国生物技术有限责任公司； 大肠杆菌菌种t o p l 0 ，d h 5 a ，b l 2 1 ，r o s s e t t a ( d e 3 ) p l y s s ，质粒p e t 2 8 a 为本实验 室保存；s d s 、e d t a 、t r i s 、a c r y l a m i d e 、b i s 、g l y c i n e 、氨苄青霉素、l b 液体 培养基粉剂、l b 固体培养基粉剂以及t a 克隆试剂盒p u c m tv e c t o rp c r p r o d u c t c l o n i n gk i t 、t 4d n a 连接酶购自上海生工；p c r 产物纯化试剂盒a x y g e ng e l e x t r a c t i o nk i t 购自爱思进生物技术有限公司。 1 1 2 2 总r n a 的抽提 选取健康河豚鱼，处死，取头肾和脾脏组织，放在碾钵中，边碾磨边加液氮， 直至将样品碾磨成粉末状；取粉末8 0 一1 0 0 m g ，转移至1 5 m l 离心管，加入l m l t r i z o l ，用t i p 头反复吹打直到溶液澄清透明，室温放置5 分钟；加入2 0 0 9 t l 氯仿， 剧烈混匀，室温放置3 分钟后；4 c ，1 2 0 0 0 9 离心1 5 分钟，使溶液分为上、中、 下三层，其中上层为含r n a 的水相；吸取上层水相溶液，转移至另一离心管中， 加入7 5 0 p i 异丙醇，混匀，一2 0 。c 放置1 0 分钟；4 c ，1 2 0 0 0 9 离心1 5 分钟使r n a 沉淀于管底，弃液相；加入l m l4 c 预冷的7 5 乙醇以洗涤r n a 沉淀，于4 ， 12 0 0 0 9 离心5 分钟，弃液相后再短暂离心，仔细吸尽残余液体，将离心管置空 气中将乙醇挥发除尽；加适量b u f f e rt e 充分溶解r n a 沉淀，吸取少量溶解的 r n a 样品，用紫外分光光度法测定总r n a 的含量和纯度，a 2 6 0 2 8 0 比值为 1 7 2 0 时，所提取的r n a 纯度较高。r n a 完整性则通过1 5 ( w v ) 琼脂糖凝胶 9 浙江火学硕i ：学位论文 实验研究 电泳检测。除了紫外分光光度计法测定含量外，其余r n a 可以储存于7 0 。c 待 用，或加入乙醇至终浓度为7 0 ，可以在一7 0 。c 保存1 年。 1 1 2 3e d n a 第一链的合成 使用i 玎试剂盒t a k a r ar n ap c rk i t ( a m v ) v e r 3 0 将总r n a 进行反转录以 获取p c r 反应的c d n a 模板。 按下列组成配制反转录反应液： 试剂用量 1 0 r tb u f - f e r d n t pm i x t u r e ( 各lo m m ) r n a s ei n h i b i t o r a m vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e o l i g od t - a d a p t o rp r i m e r t o t a lr n a 1l l l 1 “l 0 2 5 i ，t l 0 5 “1 o 5 9 i 1 “l t b t a l加水至1o l 逆转录反应程序为： 4 2 ，4 0 m i n - - - , 9 9 ，5 m i n 一5 ，5 m i n 反转录结束后，即进行模板的有效性检测：取0 2 “l 作为模板，以 3 - a c t i n 作为内参进行p c r 鉴定，鉴定合格后将其余模板放置于- 7 0 。c 待用。 r t - p c r 1 ) 引物设计 首先从n c b i 数据库中查找其他物种i l 1p 分子的氨基酸序列，通过序列比 对找出设计简并引物( 见附录2 ) 2 ) 中间片段的p c r 扩增 用设计好的引物以合成的第一链c d n a 为模板进行p c r 扩增，使用标准的 5 0 p l 体系，按照下列组分配制： 1 0 浙江人学硕上学位论文实验研究 反应条件为： 1 9 4 ( 24 m i n ；2 9 4 c3 0 s 一5 5 * c 3 0 s - - - 7 2 c 3 0 s ( 重复3 5 个循环) 3 7 2 1 0 m i n ；4 1 5 1 0 m i n - 3 0 m i n 3 ) p c r 产物的检测分析 取3 9 lp c r 扩增产物，加1 1 t l 澳酚兰指示剂，在1 2 琼脂糖凝胶中稳压 1 0 0 伏电泳3 0 m i n ，电泳缓冲液为0 5 t a e 。电泳完毕后，用k o d a kg e l l o g i c 2 0 0 凝胶成像分析系统( e a s t m a nk o d a kc o m p a n y , u s a ) 进行分析。 4 ) p c r 产物的回收和纯化 采用a x y p r e pd n a 凝胶回收试剂盒( a x y - g e n e ) 或g e le x t r a c t i o nk i t ( q i a g e n ) 行p c r 产物的回收，洗脱下来的d n a ，经琼脂塘电泳检测无误后，放置于一2 0 ( 2 保存待用。 1 1 2 4t a 克隆 1 ) 连接反应 采用标准的1 0 9 l 连接反应体系中，通常情况下，没有必要对p c r 产物进行 定量。t - a 克隆试剂盒购自上海生工生物工程公司，反应按以下体系进行： 试剂 用量 l i 浙江人学颁一i j 学位论文实验研究 l0 l i g a t i o nb u f f e r p u c m t ( 5 0n g t l ) 纯化后的p c r 产物 t 4d n al i g a s e p e g 4 0 0 0 1 “l 0 5 9 l 6 5 l x l ig l 1 p l t b t a l 加水至1 0 9 l 混合液短暂离心后，于1 6 2 3 。c 连接过夜。 2 ) 大肠杆菌感受态细胞的制备 挑取在l b 固体培养基上生长的受体菌d h 5 a 单菌落，接种于5m l l b 液体 培养基中，3 7 。c 摇动培养过夜；按1 ：l0 0 体积，将菌液接转到1 0 0m ll b 液体 培养基中，于3 7 ”c ，2 5 0r p m 剧烈振摇培养约o 5 3 h ，至o d 6 0 0 值达到0 4 0 6 之间；在无菌条件下，将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的5 0m l 离心管中， 在冰上放置1 0m i n ，使培养物冷却至0 。c ；4 。c ，4 0 0 0r p m ，离心1 0m i n ，回收 菌体细胞；倒出培养液，将离心管倒置lm i n ，使残留的痕量培养液流尽；用1 0 m l 冰预冷的0 1 m o l lc a c l 2 重悬每份沉淀，除尽培养液；4 。c ，4 0 0 0r p m ，离心 1 0m i n ，回收细胞，除尽培养液；每5 0m l 初始培养物用2m l 冰预冷的0 1 m o l l c a c l 2 重悬每份细胞沉淀；加入甘油至终浓度为1 5 ，2 0 0g l 分装后一7 0 。c 保 存备用。 3 ) 转化 1 0 0 9 l 感受态细胞，在冰上完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮；加入5 9 l 连 接液，轻轻混匀，冰上放置3 0 分钟，4 2 c 水浴热激9 0 秒钟( 注意不要摇动试管) ， 然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3 5 分钟；再加入4 0 0 9 l 室温的l b 培养液，于3 7 。c ，2 0 0 r p m 振荡培养l 小时。振荡培养结束后，在室温下，4 0 0 0r p m 离心5 分钟，用枪头吸掉4 0 0 i t l 上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将细菌 涂布在预先用1 0 i ，t l1 0 0 r a mi p t g 和4 0 u l5 0 m g m lx g a l 涂布的l b 平板( 含5 0 l _ t g , l a m p ) _ k 。平板在3 7 。c 正向放置l 小时后倒置培养过夜。 浙江入学硕1 ：学位论文实验研究 4 ) 蓝白斑筛选 进行蓝白斑筛选，用无菌牙签挑取5 个白色菌斑，分别放入2 m ll b 培