（细胞生物学专业论文）颠茄（atropa+belladonna+l）组织培养与新种质选育研究.pdf

颠茄的组织培养和高倍体新种质选育研究 细胞生物学专业硕士研究生：聂振朋 指导教师：梁国鲁研究员 摘要 颠茄( a t r o p ab e l l a d o n n al ) 为茄科( 肋如n 口e ) 颠茄属( a t r o p al ) 植物，多年生草本， 全草入药，为常用中草药之一。全草含颠茄碱、莨菪碱以及东莨菪碱等，有抗胆碱等功效， 可j j 于镇静、麻醉、止痛、镇痉、减少腺体( 例如涎腺和汗腺) 分泌，以及扩大瞳孔等。2 0 世纪9 0 年代，东莨菪碱应用丁戒毒，取得了显著疗效。 目前，国内对颠茄的组织培养和新种质选育研究很少，本试验通过对颠茄组纵培养的系 统研究，以期为颠茄的上厂化育卣提供参考数据；同时在组织培养的基础上，结合染色体i ： 程技术对选育颠茄多倍体新种质韵技术和方法进行了研究，以期找到最住的诱导方法，为颠 茄的倍性育种奠定基础，7 tj l 望获得高产优质的颠茄新种质。 颠茄组纵培养的研究表明：外植体最佳的消毒方式为：先以中性洗涤剂浸泡1 0 r a i n ，再用 自来水冲洗3 0 m i n ，然后用o 1 h g c l 2 消毒6 m i n ( 取材为1 2 月份) ，最后用无菌水冲洗3 - - 5 次接入培养基中，此时芽诱导率达1 0 0 ，污染率为o o 。颠茄初代培养诱导芽分化的最适 培养基为m s + 0 7 r a g l 6 b a + 0 2 m g l n a a + s u c r o s e 3 o ；继代增殖时芽分化的最适培养基为 m s + 0 5 m e 以- 6 - b a 十o z i n g l n a a + s u c r o s e 3 o 。颠茄组培时初代芽的生根较困难，必须添加 一定浓度的激素才能生根，最适的生根培养基为m s + 0 2 m g li b a + s u c r o s e 2 o ，生根率可达 1 0 0 。在生根试验中发现，继代数和继代天数对颠茄组培曲的生根有一定影响：继代数犬丁 l o 时，生根变得非常容易，在基本的m s 培养基上既可生根。继代1 5 2 0 d 时，颠茄组培苗 较易生根；当继代时间在2 0 5 5 d 之间时，组培苗不易生根；但当继代时间为9 0 d 时，组培 苗又极易生根，在一般的m s 培养基上既可生根。 在颠茄组织培养的基础上，利用秋水仙素溶液对其进行了多倍体诱导，分别采刚了浸泡 法和混培法，其中浸泡法的处理材料为颠茄的茎尖和腋芽，结果表明：两种诱导方法中浸泡 法较佳，两种材料的诱导效果以腋芽为佳。以o 1 0 的秋水仙素溶液浸泡处理腋芽3 6 h 时， 诱变效果最佳，诱导率可达4 5 。 对获得的不同倍性颠茄植株进行了外部形态、细胞学和生物学相关性状的比较观察，结 果表明：在外界环境相同的条件下，同一生长阶段的二十四倍体颠茄和十二倍体颠茄在叶片 形状上存在明显的差异。二十四倍体颠茄植株叶片的长度、宽度和厚度均大于其十二：倍体植 株：长度、宽度、厚度分剐为十二倍体的1 2 7 8 、1 7 9 5 、1 4 0 o ，叶形指数变小，为一。 倍体的7 1 o ，经配对样品t 值检验表明，二十四倍体与十二倍体叶片的长、宽、厚以及叶 形指数间差异均达极显著水平。二十四倍体和十_ _ 二倍体颠茄气孔特性比较表明十四倍体 叶片的保卫细胞明屁增大，其长度、宽度分别为十二倍体的1 5 0 2 和1 2 4 2 ，保卫细胞内 叶绿体数明显增多，为卜二倍体的1 8 3 6 ；气孔增大，长度、宽度分别为十二倍体的1 2 9 5 和1 5 0 1 ，而密度下降，仅为十二倍体的5 1 4 ，经配对样品t 值检验表明，两者气孔密 西南大学硕士学位论文摘要 度间差异达极显著水平。对不同倍性颠茄组培苗相对生长率的比较表明：处_ 】i _ 相近的生故阶 段和相同环境条件下，二十四倍体颠茄较十二倍体的相对生长率高，昂多高山1 0 ，平均高 山4 6 。 利削电导法进行了颠茄二十四倍体与十二倍体抗性比较研究，主要研究了o 。c n4 0 。c 逆 境胁迫后，一：十四倍体和十二倍体电导率和电导渗透率的变化。结果表明：在经过o o c n4 0 。c 逆境胁迫后，颠茄，：十四倍体的电导率和电解质外渗率均显著高于于十：二倍体。在o c 温度处 理下，_ 二十四倍体的电导率平均值为1 0 3 6 6 s - c m ，十二倍体的为6 0 1 3 “s c m 一，差异达极显 著水平；在o 。c 下二十四倍体屯解质外渗率为1 3 7 4 ，十二倍体为7 5 5 ，差异达极显著水 平；在4 0 4 c 温度处理下，二十四倍体的电导率平均值为8 8 3 6 “s t i l l 一，而十二倍体的为 5 3 4 0 u sc m ，著异达极显著水平；两者间电解质外渗率，_ 二十四倍体为9 5 8 ，十二倍体为 5 6 8 ，差异达极显著水平。研究表明二p 网倍体颠茄植株的抗逆性较十二倍体弱。 关键词：颠茄组织培养多倍体秋水仙素 i i 西南人学硕十学位硷文a b s t r a c t t i s s u ec u l t u r ea n dn e wg e r mp l a s mr e s e a r c ho na t r o p a b e l l a d o n n al c a n d i d a t e ：n i ez h e n p e n g s u p e r v i s o r ：p r o f l i a n gg u o l u a b s t r a c t d t r o p ab e l l a d o n n al i so n eo fn i g h t s h a d ew h i c hi so n eo fp e r e n n i a lh e r b a g ea n db e l o n g st o h e r b o lm e d i c i n e t h ef r o n do fa t r o p ab e l l a d o n n al h a ss o l t l eb e l l a d o n n a ，h y o s c y a m i n ea n d s c o p o l m n i n e i nc l i n i ci to f t e nb eu s e df o rs e d a t i o n ，n a r c o s i s ，a e e s o d y n e ，a n t i s p a s t i c ，d e c r e a s e g l a n d u l o s es e c r e t i o na n de n l a r g ep u p i l 1 9 9 0 s ，p r o f y a n gg u o d o n ga p p l i e ds c o p o l a m i n et ob eo f f t h eh a b i ta n dg e tr e m a r k a b l ec u r a t i v ee f f e c t n o w ，t h er e s e a r c ho ft i s s u ec u l t u r ea n db r e e d i n ga b o u ta t r o p ab e l l a d o n n al i sr a r e d o m e s t i c i nt h es t u d y ，t h es y s t e m i ct i s s u ec u l t u r eo f a t r o p ab e n n a d o n n al i ss t u d i e d ，w h i c hc a n b eu s e df o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o no f a t r o p ab e l l a d o n n al ，a n dt h ef u r t h e rs t u d y ；s i m u l t a n e o u s l y ， b a s e do nt i s s u ec u l t u r ea n du s e dc h r o m o s o m ee n g i n e e r i n g ，t h et e c h n o l o g ym a dm e t h o do ns e l e c t i v e l y b r e e d i n ga t r o p ab e l l a d o n n al i ss t u d i e di no r d e rt oo b t a i nt h eo p t i m u mp o l y p l o i d yb r e e d i n g m e t h o d t h er e s u l ti nt i s s u ec u l t u r eo f a t r o p ab e l l a d o n n als h o w st h a tt h eb e s ts t e r i l em e t h o di st h a t 1 0 r a i nm a r i n a t i n gb yn e u t r a ls c o u r ，3 0 m i no v e r w a s h i n gb yt a pw a t e r ，6 m i ns t e r i l i z i n gb yo 1 m e r c u r i cc h l o r i d e ，r i n s i n g3 5t i m e sb ys t e r i l ew a t e r t h eb u di n d u c e dr a t ei s1 0 0 ，a n dt i l e p o l l u t e d r a t ei sz e r o a n dt h er e s u l ts h o w st h a tt h ea p p r o p r i a t em e d i u mf o ri n d u c i n gt h e d i f f e r e n t i a t i o no i lb u do f t h ef i r s tc u l t u r ea b o u ta t r o p ab e l l a d o n n al i sm s + 0 7 m g l6 - b a + 0 2 m g l n a a + s u c r o s e 3o ：t h ea p p r o p r i a t em e d i u mo ns t e p - g e n e r a t i o na n dp r o p a g a t i o no fb u di sm s + 05 m 叽6 - b a 十o2 m g ln a a + s a c r o s e 3 o ，i ti sd i f f i c u l tt om o tf o rt h ef i r s t - g e n e r a r o nb u do f a t r o p ab e l l a d o n n al ，t h ea p p r o p f i a t em e d i u mi sm s + 0 2 m g li b a + s u e r o s e 2 0 ，t h er a t eo f r o o t i n g i s l 0 0 ；t h ee x p e r i m e n to f r o o t i n ga b o u t a t r o p ab e l l a d o n n a l a l s os h o w s t h a t t h e t i m e so f s t e p g e n e r a t i o na n dt h ed a y so fs t e p g e n e r a t i o na f f e c tt h er o o t i n go fa t r o p ab e l l a d o n n alc u l t u r e d s p r o u t a st h et i m e so f s t e p - g e n e r a t i o ne x c e e d s1 0t i m e s ，r o o t i n gi sv e r ye a s yo nm sm e d i u m t h e d a y so fs t e p g e n e r a t i o nc u l t u r ei s1 5 2 0 d ，r o o t i n gi se a s yc o m p a r a t i v e l y a si ti s2 0 5 5 d ，r o o t i n g b e c o m e sd i f f i c u l hb u tw h e nt h et i m ei s9 0 d ，r o o t i n gb e c o m e se a s i l ya g a i no nm sm e d i u m o nt h eb a s eo fa t r o p ab e l l a d o n n al t i s s u ec u l t u r e ，t h ei n d u c i n gp o l y p l o i d yo fa t r o p a b e l l a d o n n al i sd o n eb yt h es o l u t i o no fc o l c h i c i n e s t w om e t h o d sa r ea d a p t e d ：d i p p i n ga n d c o m p o s i t ec u l t u r e t h et r i a lu s e df o rd i p p i n gh a st w ok i n d s ：s t e m - t i pa n da x i l l a r yb u d t h er e s u l t s h o w st h a tt h ed i p p i n gm e t h o di sb e t t e rt h a nc o m p o s i t ec u l t u r ea n dt h ea p p r o p r i a t es t u f fi sa x i l l a r y b u d s t h eh i g h e s ti n d u c i n gr a t ei s4 5 w h e nt h ea x i l l a r yb u d sa r ed i p p e di no 1 0 c o l c h i c i n e s i 两南大学硕l j 学位论文 a b s t r a c t i s o l u t i o nf o r3 6 h p l a n tm o r p h o l o g y ，c y t o l o g ya n db i o l o g yo b s e r v a t i o no nt w op l o i d yo f a t r o p ab e l l a d o n n a l w i t hs i m i l a rg r o w t hs t a g ea n de n v i r o n m e n tb a c k g r o u n ds h o w e dt h a tt h e2 4 一p l o i d sa r eb i g g e r t h a nt h ed o d e c a p l o i d si nl a m i n am o r p h o l o g y t h el e n g t h ，w i d t ha n dt h i c k n e s so f l a m i n ao f 2 4 - p l o i d s a r eb i g g e rt h a nt h a to f d o d e c a p l o i d s t h el e n g t ho f 2 4 - p l o i d si s1 2 78 t h a to f d o d e e a p l o i d s t h e w i d t ho f 2 4 - p l o i d s i s l 7 9 5 o f t h a t o f d o d e c a p l o i d s ，a n d t h e t h i c k n e s so f 2 4 - p t o i d s i s1 4 0 0 o f t h a to fd o d e c a p l o i d s t h el a m i n ai n d e xb e c o m e ss m a l l e r ，i s7 1 0 t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h e 2 4 - p l o i ds t o m ai s d i f f e r e n to fd o d e c a p l o i d s t h er e s u l ts u g g e s t s ：t h ed e f e n d a b l ec e l lo ft h e 2 4 一p l o i d s i se v i d e n t l yb i g g e r t h ed e f e n d a b l ec e l l l e n g t ho f2 4 - p l o i d si s1 5 0 2 o ft h a to f d o d e c a p l o i d sa n dt h ew i d t hi s1 2 4 2 t h en u m b e r so fc h l o r o p l a s ti nt h e2 4 - p l o i d sd e f e n d a b l ec e l l i s1 8 3 6 o f t h a to f d o d e c a p l o i d s t h es t o m ao f 2 4 - p l o i d s i s b i g g e r t h a n t h a to f d o d e c a p l o i d s t h e l e n g t h o f s t o m ao f 2 4 - p l o i d s i s1 2 9 5 o f t h a to f d o d e e a p l o i d sa n d t h e w i d t h i s1 5 0 1 w h i l e t h e d e n s i t yo fs t o m ao f2 4 一p l o i d sd e c r e a s e s i so n l y5 1 4 o ft h a to fd o d e e a p l o i d s t h es t u d yo n r e l a t i v eg r o w t hr a t eo f2 4 - p l o i d sa n dd o d e c a p l o i d so fa t r o p ab e l l a d o n n al s h o w ：t h er e l a t i v e g r o w t hr a t eo f2 4 - p l o i d sa t r o p ab e l l a d o n n al i sh i g h e rt h a nd o d e c a p l o i d sa ss i m i l a rg r o w t hs t a g e a n de n v i r o n m e n tb a c k g r o u n d t h em a xo fr e l a t i v eg r o w t hr a t eo f2 4 一p l o i da t r o p ab e l l a d o n n al i s 1 1 0 t h a to f d o d e c a p l o i d s ；t h em e a no f r e l a t i v eg r o w t hr a t eo f 2 4 - p l o i d sa t r o p ab e l l a d o n n ali s 1 0 4 6 t h a to f d o d e c a p l o i d s t h ee l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y w a sm e a s u r e da n d c o m p a r e db e t w e e n t h e 2 4 - p l o i d s a n d d o d e c a p l o i d s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t yo f2 4 - p l o i d sa n dd o d e c a p l o i d s w a s l 0 36 6g s c m a n d6 0 1 3g s - e m w h e n t r e a t e d w i t ho cr e s p e c t i v e l y t w h i l e t h ec o n d u c t i v i t yo f 2 4 p l o i d sa n dd o d e c a p l o i d s w a s8 8 3 6u s c m a n d5 3 4 0r t s c m 1w h e nt r e a t e dw i t h4 0 。c r e s p e c t i v e l y t h ee l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t yo fd o d e c a p l o i d sw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to f d o d e c a p l o i d s s o ，t h er e s i s t a n tc a p a b i l i t yo f 2 4 - p l o i d so f a t r o p ab e l l a d o n n ali sw e a k e rt h a nt h a to f d o d e c a p l o i d so f a t r o p a6 e f 胁d o n n al ， k e y w o r d ：a t r o p ab e l l a d o n n al ；t i s s u ec u l t u r e ；p o l y p l o i d ；c o l e h i c i n e s 独创性声明 y9 3 7 6 3 9 学位论文题目：题蕴f ! ! 望g 纽出8 gl ：! 塑塑壁差生堑盘厦选直盟盔 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特j j t l d n 以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者：孩振聃签字日期：卅年月夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：致推酮 导师签名： 签字日期：刎莎年莎月圹日签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 渤丝益狸鲻殖 通讯地址：一潮芝坶苹翱物盔籀量姐陧一 l 鼽从 两南大学硕士学位论文 文献综述 第一部分文献综述 1 1 颠茄的研究现状 颠茄( a t r o p a b e l l a d o n n a l ) 俗称毒茄( d e a d l y n i g h t s h a d e ) 、阿托布等，为茄科( s o l a n a c e a e ) 颠茄属口t r o p a l ) 中的一种，多年生草本植物，全草入药，主要药用成分为颠茄碱( b e l l a d o n n a ) 、 莨菪碱( h y o s c y a m i n e ) 以及微量东莨菪碱( s e o p l a m i n e ) 等，为常用的中草药品种 1 。”。 1 11 颠茄的起源与分布 颠茄原产于欧洲和哑洲西部。现主要分布于欧洲各国、中国、印度和美国等地。2 0 世纪 3 0 年代引进我国，在浙江、北京、上海和山东等地有栽培l lj 。 11 2 颠茄的生物学特。陛 颠茄株高1 - 12 m 。叶互生，叶片j 、。卵圆形或卵状长圆形，全缘，叶表面呈蝉绿色，背面 灰绿色。花冠钟状，淡紫褐色。浆果球形，成熟时黑紫色。种子多数，褐色，小而扁，旱肾 形。花期6 月至8 月。粟熟期8 月至1 0 月。 喜温暖湿润气候，怕寒冷，忌高温，以2 0 2 5 。c 的气温生艮快，超过3 0 c 生长缓慢。雨水 多，易患根病。北京地区5 月至6 月植株生长快，7 月生长慢，冬季不能露地越冬，只作一年 生栽培；长江以南产区可作多年生栽培。选阳光充足、排灌方便的肥沃砂质壤土为宜，易积 水的低洼地和盐碱地不宜种植，用种子繁殖，忌连作。常见的病害有疫病、立枯病等。 1 1 3 颠茄的药用成分及应用 颠茄全草入药。全株富含莨菪类生物碱，如颠茄碱、茛菪碱以及东莨菪碱等口。3 】。 颠茄的根茎叶均可入药，是民间传统的药用植物。有抗胆碱能神经传导或副交感神经阻 滞作用。可_ h j 于镇静、麻醉、止痛、镇痉、减少腺体例如涎腺和汗腺分泌，以及扩大瞳孔。 曾用于治疗胆石绞痛和肠绞痛、神经性腹泻以及心律失常。搽剂外用可治痛风和风湿病等。 从颠茄提取的托烷类生物碱具有重要的药用价值。现常将其制成片剂或注射剂使用。例如从 颠茄中提取的阿托品是一种很重要的镇痉药 3 o 可治腹部脏器包括胃肠、膀胱和尿道、胆管和 胰管阏痉挛而引起的急腹痛，痉挛性便秘，妊娠时的剧烈呕吐，以及流涎和排汗过多，鼻咽 和支气管过度分泌，支气管炎和哮喘。亦可缓解冈心传导阻滞而引起的昏厥、动脉瘁挛和其 他重要的血循环疾患，例如可纠正心肌梗塞后的心动过缓或窦性心动过缓，以及早期心传导 阻滞。由于能抑制眼虹膜缩瞳肌，可用于眼科验光和扩瞳检查。还由于它可通过抑制脑呕吐 中枢，因而可用于防i p 晕动病( 晕车、晕船和晕飞机) 时的呕吐。早年还曾用于治疗帕金森震颤 麻痹综合征( 现已与左旋多巴合用) ，以及胃十二指肠消化性溃疡。此外，阿托品等抗胆碱能生 物碱，也是抗胆碱酯酶类有机磷农业杀虫剂，以及现代化学战争中使用的抗胆碱酯酶毒品的 解毒药“j 。 2 0 世纪6 0 年代初，在钱潮和祝寿河对莨菪类药物研究的启发f ，杨国栋开始观察莨菪类 药对微循环的影响，经过3 0 多年的研究现已取得了显著的成效。现已基本弄清莨菪类约具有 两南大学硕上学位论义 文献综述 调* 微血管，改善微血流流态、流速、流量，增强微动脉自律返动，减轻微血管渗漏，降低 血粕度增加红细胞变形性，抑制血小板和红细胞聚集及白细胞附鼙。莨菪类药对微血管和 札流的多种奇妙作用得到了许多微循环研究者的青睐，微循环与莨菪类药相结合的研究，不 仅促进了对多种疾病微循环障碍变化规律的认识，也找到了改善微循环障碍的有效药物。杨 国栋教授在药效学研究的同时，以莨菪类药为一【具研究疚痫发生发展，提出以微循环障碍为 疾病中间环节的“信息一效应一能量”发病学认识剐。 2 0 世纪9 0 年代，杨国栋基于国内吸毒人数急剧增加的趋势和对社会的责任感，吸取东莨 菪碱1 毫克拮抗吗啡2 0 毫克对呼吸抑制的经典认识，东莨菪碱静脉复合麻醉的经验，发明以 东莨菪碱为主治疗海洛因依赖的“1 + 1 戒毒法”现己取得中国和美国专利。该方法主药为非成瘾 性。病人控制戒毒症状迅速，无痛苦，多数脱毒病人有性功能障碍者一周后可望改善。 据心理评分、临床随访和动物实验均表明，东莨菪碱能使海洛因依赖者降低对毒品的耐 受性和依赖性，毒品代谢和排泄加快。该法脱毒病人能早期进入纳曲酮预防复吸给药，使纳 曲酮接受率由通常的2 0 提高到1 0 0 ，延艮了脱毒后操守时间。应某些特殊病人的需要，他 还开发了东莨菪碱伍用纳曲酮快速戒毒方法，8 小时内完成脱毒。使用上述二种方法宁波戒毒 研究中心已治疗海洛因依赖者超过9 0 0 0 例次。其中有意大利、秘鲁、泰国、新加坡和港澳台 地区5 9 人。对吗啡尿检阳性的新生儿“毒婴”和“毒娃”的脱毒也取得满意疗效。1 9 9 8 年为俄罗 斯等四个国家戒毒专家进行了技术培训。东莨菪碱为主脱毒法获得了较好的社会效益和经济 效益，1 9 9 4 年7 月在戒毒新疗法国际研讨会上美国专家c l a r kh w 主任( 全美约物滥刚治疗中 心) 、v o c c if j 主任( 美国国立卫生研究院药物滥用研究所开发部) 指出：“1 + 1 杨氏戒毒法” 具有中国特色的非成瘾新方法，有很大潜力和发展前景”j 。 1 14 颠茄的组织培养和育种研究 目前，关于颠茄的组织培养和育种1 ：作国外有相关报道，国内相关报道极少。k o n a r 等1 6 1 ( 1 9 7 2 ) 通过对颠茄根愈伤组织培养得到完整植株；r a s h i d 等h 3 ( 1 9 7 3 ) 通过花药培养得到 了颠茄的单倍体植株；细胞融合方面，g k r u m b i e g e l 等”1 ( 1 9 7 9 ) 已培育出了毛曼陀罗和野山 颠茄的体细胞杂种植株；在颠茄的转基因育种方面，s a i t o 等【9 1 ( 1 9 9 0 ) 将构建好的嵌合载体 p a r k 5 ( 含有3 5 s - b a r 基因) 转入发根农杆菌1 5 8 3 4 菌株中，进而感染颠茄叶盘，得到了抗除草 剂草胺膦和般丙胺膦的转基因植株，而其颠茄碱的合成不受任何影响。 1 1 5 颠茄染色体研究 关- j 二颠茄染色体方面的研究，自1 9 2 0 年以来国内外均有相关报道。m a r c h a l ( 1 9 2 0 ) 1 0 首次 报道颠茄染色体2 n = 7 6 ，随后u i l m o r i n 、d e l a y ( 1 9 2 8 ，1 9 4 7 ) 1 1 - 1 2 分别报道了颠茄染色体2 n = 7 6 ； o l i n s t e a d p a l m e r ( 1 9 9 2 ) 、b a d r ( 1 9 9 7 ) 以及o l m s t e a de ta l ( 1 9 9 9 ) 【1 3 1 5 1 研究茄科植物染 色体，认为颠茄属染色体基数为x = 1 2 ；国内t i e _ - a ot u 等【1 6 】在前人研究的基础上，综合考虑 了奇倍数多倍体育性的不稳定以及不能够形成完整的天然居群等因素，认为颠茄属植物的染 色体基数为x = 6 。本文v a x = 6 为颠茄染色体基数。 2 西南人学硕= t 学位论文 文献综述 1 2 植物组织培养的研究进展及应用 1 2i 植物组织培养技术的发展概况 植物组织培养指在无菌条件下，将离体的植物器官( 如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果 实、种子等) 、组织( 如形成层、花药组织、胚乳、皮层等) 、细胞( 如体细胞、生殖细胞等) 、胚 l l ( i n 成熟和未成熟的胚) 、原生质体( 指脱壁后仍具有生活力的原生质体) 培养在人上配制的培 养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织或潜伏芽等，或氏成完整的植株的技术， 统称为植物组织培养。由于是在试管内培养，而且培养的是脱离植物母体的培养物，因此也 称离体培养和试管培养m j 。 s c h w a n n ( 1 8 3 9 ) 提出细胞有机体的每一个生活细胞在适宜的外部条什f 都有独立发育的潜 能。m o r g a n ( 1 9 0 1 ) 首次提出一个全能性细胞应具有发育 h 一个完整植株的能力。 h a b e r l a n d t ( 1 9 0 2 ) 首次提出细胞培养的概念，也是第一个用人工培养基对分离的植物进行培养 的人，但没有成功。w h i t e ( 1 9 3 4 ) 用番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) 的根尖离体培养成功。 二r 世纪4 0 6 0 年代是组织培养快速发展时期，目前人们所用的培养基和一些培养方法，大 多都是在这一时期建立或演变过米的。o v e r b e e r 、c o n k l i n 等( 1 9 4 1 ) 用附加椰乳到培养基中，获 得了离体胚培养成功。s k o o g ( 1 9 4 4 ) 报道的降解产物腺嘌呤和腺苷可以促进愈伤组织的生氏， 解除生长素抑制芽形成的抑制作用，诱导芽形成。c a p l i n 和s t e w a r d ( 1 9 4 8 ) 用实验证明椰乳与2 ， 4 - d 配合，对胡罗h ( d u c u sc a r o t av a r s a t i v ad c ) 和马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u ml ) 组织的增殖 作用起到明显的促进作用。美国的s t e w a r d 和德国的r e i n e r t ( 1 9 5 8 ) 分别由培养的胡罗h ( d a u c u s c a r o t av a r s a t i v ad c ) 细胞诱导形成了胚状体。v a s i l 和h i l d e b r a n d t ( 1 9 6 5 ) 用单个分离的细胞培 养获得整个植株的再生，从而使植物细胞的全能性理论真正得到了科学的证实。从此以后， 一批又一批植物的组合子或器官通过培养的方法获得了再生植株【1 7 - j 9 。 由于植物组织培养的快速发展，现在已经不能确切统计有多少植物通过组织培养的方法 获得了再生植株。植物组织培养已经成为一种常规的实验技术，j 。泛的应用于植物的脱毒、 快繁、基因l ：程、细胞工程、遗传研究、次生代谢物的生产、工厂化育苗等多个方面。并广 泛应用于农业、林业、t 业、医药业等多种行业，产生了巨大的经济效益和社会效益，己成 为当代生物科学中最有生命力的一门学科i l “u 。 122 植物组织培养的应用 植物组织培养发展到今天，已经不仅仅局限于最初的组织培养，已经广泛应用j ：农业、 林业、上业、医药业等多种行业，已经渗透到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种学 以及生物化学等各个研究领域，成为生物学科中的重要研究技术和手段之一 1 9 - 2 3 。 1 2 2 1 在植物快速繁殖及脱毒上的应用 植物组织离体快速繁殖是植物组织培养技术1 3 前应用最多、最广泛和最有成效的一种技 术。冈为植物组织培养不仅打破了植物种子繁殖的常规，不受地区、季节和温度的限制，而 且繁殖速度快，为大量、快速的获得苗木提供了一条高效的途径。 西南大学硕l 学位论 文献综述 在植物跃期的栽种过程中，植物病毒侵染导致寄主植物生活力降低，作物产量和晶质下 降。特别是无性繁殖作物感染病毒后，通过营养繁殖连续传代，病毒不断积累，造成的病毒 危害更为严熏。植物病毒造成无性繁殖作物产量降低和品质退化的现象已经引起广泛的关注， 国内外学者对其进行了大虽的研究报道口。 多年来，各国植保学者从各个方面寻求解决的方法，但姓由于植物病毒的复制和植物代 谢密切相关，迄今采用生物、化学、物理等途径来防治植物病毒收效甚微。直到2 0 付纪5 0 年代发现通过植物组织培养的方法，可以脱山植物病毒，恢复种性，提高产量、品质。目前， 植物组织培养脱毒技术在花卉、果树、蔬菜和中草药等植物上取得了广泛的应用。 w h i t e 丁：1 9 4 3 年首先发现，在感染烟草花叶病毒的烟草( n i e o t i a n at a b a c u ml ) 植株生长点 附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒，并且病毒的含量随植株部位和年龄而异。m o r e l 等在这 个启示下，于1 9 5 2 年利用感染花叶病毒的大丽菊茎尖分生组织培养，得到了无毒植株。从此， 茎尖培养成为解决病毒的一条有效途径。这以后相继有马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u ml ) 、菊花 ( c h r y s a n t h e m u mm o r i f o l i u mr a m a t ) 、百合( l i l i u ms p p ) 、草莓( f r a g a r ia n a n a s s a ) 、鸢尾( i t e c t o r u m m a x i n 1 等茎尖培养脱毒研究成功的报道口”。随后各国学者又相继研究出了不同的脱毒方式。 迄今为止，常用的植物组织培养脱毒方法大致可以分为以下几种：热处理法脱毒，苇尖 培养法脱毒，愈伤组织培养法脱毒，原生质体培养法脱毒，珠心胚培养法脱毒，花药培养法 脱毒。每种脱毒方法都有其优缺点，生产上麻视具体情况采用不同的脱毒方法，有时几种方 法结合使用 2 4 o 1 2 2 2 组织培养在植物育种方面的应用 利用组织培养，可以生产大量的优良无性系：细胞融合可打破种属问的界限，克服远缘 杂交不亲和性障碍，在植物新晶种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力：还可获得单倍体、 三倍体及其它多倍体、非整倍体。 1 2 22 1 利用细胞融合培育新种质 植物细胞融合又称原生质体融合。植物原生质体是除去了细胞壁的裸露细胞，通过原生 质体融台可以产生种、属间的杂种，从而克服远缘杂交障碍。近年来，原生质体培养及细胞 融台的研究取得了一定的进展。如柑桔( c i t r u sl ) 、草莓僻a n a n a s s ad u c k ) 、龙眼晖l o n g a n d l a m ) 、葡萄( n t i sv i n i f e r al ) 、苹果( mp u m i 脑m i l l ) 、猕猴桃口c h i n e n s i sp l a n c h ) 【2 6 ”1 原生质 体培养已获得再生植株。原生质体融合也取得了，突破性进展，柑桔类细胞杂种已有儿十种之 多。o c h a t t 等【”1 成功地实现了野生梨砧木品种和樱桃杂种砧水晶种的原生质体融台。 1 2 2 2 2 花药培养和单倍体育种的应用 花药培养是指把来成熟的花药接种在人工培养基上分化成植株的过程。通过花药培养， 可诱导雄配子发育成单倍体植株，使染色体加倍，即可获得纯合的二倍体，这能缩短育种周 期，提高选择率，而且还在异花授粉作物的朵种优势利用及远缘杂交方面具有较大的利片j 价 值。自从1 9 7 5 年首次获得果树花粉植株以来，已有葡萄( m 出v i n i f e r al ) 、猕猴桃口c h i n e n s i s p l a n c h ) 、草莓怛口dd u c k ) 、枣( z 倒“妇m i l l ) 、小麦( t r i t i c u ma e s t i v u ml ) 等。2 。3 6 1 植物花 4 西南大学硕士学位论文 文献综述 药培养单倍体成功。 1 2 2 2 _ 3 利用胚乳培养获得三倍体植株 被子植物的胚乳是天然的三倍体组织，具有烈亲的遗传成分，且同样具有细胞全能- 陛， 因此通过胚乳的细胞培养可以获得三倍体植株。三倍体植物在减数分裂时，染色体间1 i 能正 常配对，育性极低，产生的果实少籽或无籽，因此引起了众多育种工作者的注意，在过去的 儿十年间，进行胚乳培养的植物已有近百种，如柚 c i t r u sg r a n d i s ( l ) o s b e c k 97 1 、猕猴桃凹 c h i n e n s i sp l a n c h ) 9 8 1 9 、苹果( mp u m i l am i l l ) 4 0 4 1 1 枇杷僻j a p o n i c al i n d l ) 、柿( d k a k l f l 【4 3 】【4 4 】、枸杞( l y c i l u mc h i n e n s i s m ) f 4 5 】、柑橘( c i t r u s l ) 4 6 1 等。 1 2 2 3 植物组织培养在植物资源离体保存上的应用 n a g 等【4 1 ( 1 9 7 3 ) 将胡萝h ( d a u c u sc a r o t av a r s a t i v ad c ) 悬浮培养细胞细胞保存在液氮中一 段时间后，再培养又观察到细胞的生陡，这是超低温保存植物材料的首次报道。h e n s h a w 和 m o r e l ( 1 9 7 5 ) 首次提山离体保存植物种质的策略以来，该项技术受到植物界的极度重视。1 9 8 0 年，国际植物遗传资源委员会增加了对营养繁殖材料收集保存研究的支持，并于1 9 8 2 年还专 成立了离体保存咨询委员会。随厉，有关国际组织和许多国家相继建立了植物种质离体基 冈库，许多不能用常规种子保存的植物己采用这种方法得以保存。常用的离体保存方法有低 温保存和超低温保存。迄今为i l ，已对1 0 0 多种植物材料进行过超低温保存的研究，并已取 得了重要进展【4 8 “1 1 2 2 4 植物组织培养在人造种子上的应用 美国科学家m u r a s h i g e ( 1 9