（遗传学专业论文）s100a4基因dna甲基化在喉癌中的作用及调控机制的研究.pdf

目录 fifilli f i r li l l lij 1 1 1 j f il lll l l l 删 y 17 6 9 6 8 4 一、摘要1 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语8 三、论文9 论文第一部分9 前言9刖看了 实验材料和方法1 0 实验结果2 6 讨论3 1 结论3 7 论文第二部分3 8 前言3 8刖舀j 毯 实验材料和方法3 9 实验结果5 1 讨论6 1 结论6 6 四、本研究的创新性的自我评价6 7 五、参考文献6 8 六、附录7 6 综述7 6 在研期间科研成绩8 7 致谢8 8 个人简历8 9 s i o o a 4 基因d n a 甲基化在喉癌中的作用及 调控机制的研究 刖昌 喉鳞状细胞癌( 1 a r y n g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ，l s c c ) 是头颈部常见的恶 性肿瘤之一。在我国，东北地区是喉癌的高发区。过去的1 0 年中，我国喉癌的 发病率呈现上升的趋势。喉癌对放疗及化疗均不敏感，手术是目前治疗的主要手 段，但手术会给患者造成不同程度的损伤。此外，在诊断和治疗过程中普遍存在 的一个问题是：除声门型喉癌外，其他类型喉癌的发病比较隐蔽，一旦确诊，患 者往往多已进入中、晚期。因此对喉癌进行早期诊断，并在基因水平寻求新的治 疗手段成为当前急需解决的问题。 恶性肿瘤被认为是一种遗传和表观遗传性疾病。基因在疾病发生和发展的分 子机制中扮演非常重要的作用，基因序列改变可以导致相应基因的表达异常进而 导致表型的变化。不仅如此，基因的表达还受表观遗传的控制。近年来，表观遗 传学研究己成为基因表达调控的研究热点之一。表观遗传调控机制包括d n a 甲 基化、组蛋白修饰和r n a 干扰等，而d n a 甲基化是表观遗传学研究最深入、 最重要的一种机制，与许多疾病如肿瘤的发生和发展密切相关。由于d n a 甲基 化是一个可逆的修饰过程，d n a 甲基转移酶抑制剂如氮杂脱氧胞苷( 5 - a z a c d r ) 通过抑制d n a 甲基化转移酶活性，改变肿瘤基因的甲基化状态，从而使基因的功 能得到恢复或增强，进而达到肿瘤治疗的目的。前期我们应用二维电泳和质谱技 术以及丰富的生物信息资源研究喉癌5 - a z a - c d r 相关的蛋白表达谱，对 5 - a z a c d r 相关的差异蛋白点进行质谱鉴定和分析，结果发现s 1 0 0 a 4 是差异表 达显著的蛋白质之一，提示s i o o a 4 基因可能是喉癌发生过程中的一个重要基因。 人类s i o o a 4 基因定位于l q 2 1 ，编码由1 0 1 个氨基酸组成的多肽，分子量约为 1 1 7 k d a 。s 1 0 0 a 4 具有广泛的细胞内外功能，如影响细胞骨架形成、改变细胞形 状、参与信号传导等。$ 1 0 0 a 4 表达升高与食管癌、胃癌、结肠癌及黑色素瘤等 的发生有关，但$ 1 0 0 a 4 参与肿瘤发生的机制仍不十分清楚，迄今未见其与喉癌 发生的相关研究报道。本研究旨在探讨s i o o a 4 基因在喉癌发生中的作用及可能 的分子机制。 材料与方法 以临床喉癌标本和喉癌h e p 2 细胞系为实验材料，应用r t - p c r 和w e s t e r n b l o t 检测喉癌组织中$ 1 0 0 a 4 基因的表达情况。应用m s p 方法检测喉癌组织中 s i o o a 4 基因d n a 甲基化情况。针对$ 1 0 0 a 4 基因设计s i r n a ，体外转录合成 $ 1 0 0 a 4 - s i r n a ，利用t r a n s m e s s e n g e r 转染试剂将其转染喉癌细胞系h e p 2 ，通过 r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 检测转染前后喉癌h e p 2 细胞中s i o o a 4 基因表达水平以 评价转染效率；应用m t t 、流式细胞术、t r a n s w e l l 和r t - p c r 以及w e s t e r nb l o t 分别检测干扰s i o o a 4 基因表达对h e p 2 细胞生物学特性的影响；针对启动子区 甲基化位点，构建s i o o a 4 野生型及突变型荧光报告素酶表达载体，转染h e p 2 细胞，检测这些甲基化位点对$ 1 0 0 a 4 基因转录调节的作用。利用生物信息学转 录因子预测软件预测可能与$ 1 0 0 a 4 基因上游启动子区特异序列结合的转录因 子，并用e m s a 、染色质免疫沉淀技术结合p c r 技术对预测结果进行验证以评 价s i o o a 4 启动子区特异甲基化序列与相关反式作用元件的结合能力。 实验结果 1 r t p c r 和w e s t e r nb l o t 结果显示，人喉癌组织以及转移淋巴结中$ 1 0 0 a 4 m r n a 和蛋白表达水平均高于癌旁对照组织； 2 m s p 结果表明，在人喉癌组织中s 1 0 0 a 4 基因启动子以及第一内含子存在低 甲基化，且与s i o o a 4 基因表达上调相关； 3 s i o o a 4 s i r n a 对喉癌细胞中$ 1 0 0 a 4m r n a 和蛋白表达的影响： $ 1 0 0 a 4 s i r n a 转染h e p 2 细胞第5 天，s i o o a 4m r n a 表达水平在 $ 1 0 0 a 4 s i r n a 组较对照组显著降低。s i o o a 4 s i r n a 转染h e p 2 细胞第7 天， s1 0 0 a 4 蛋白表达水平在$ 1 0 0 a 4 s i r n a 组较对照组显著降低，表明s i o o a 4 表达受到抑制； 4 $ 1 0 0 a 4 s i r n a 对人喉癌h e p 2 细胞生物学行为的影响：与对照组相比，在 s i o o a 4 s i r n a 组，喉癌h e p 2 细胞的增殖能力和侵袭力显著降低、凋亡率显 2 著升高； 5 s i o o a 4 调控区转录因子结合位点的预测结果：经p m a t c h 软件预测发现在 $ 1 0 0 a 4 存在转录因子c m y b 、c e b p 、a p 2 和m s x 一1 的结合位点； 6 荧光素酶结果显示$ 1 0 0 a 4 调控区甲基化变化对基因活性起调控作用； 7 e m s a 结果显示在体外c - m y b 和c e b p 可以$ 1 0 0 a 4 特异性甲基化序列结合， 而m s x - i 和a p 2 不能与s i o o a 4 特异性结合； 8 染色质免疫沉淀结合p c r 技术检测结果证明在体内c - m y b 和c e b p 与 s i o o a 4 调控区特异性结合。 结论；口h 二 1 s i o o a 4 基因在喉癌组织和淋巴结转移组织中表达上调，其参与喉癌的发生和 发展； 2 喉鳞癌中s i o o a 4 表达上调原因之一为s i o o a 4 基因启动子和第一内含子区低 甲基化； 3 $ 1 0 0 a 4 基因具有促进喉癌细胞的增殖和侵袭、抑制细胞凋亡的能力； 4 c - m y b 和c e b p 可以与$ 1 0 0 a 4 基因特异性结合，其中c - m y b 结合位点的甲基 化状态影响s i o o a 4 基因的表达。 关键词：喉癌；$ 1 0 0 a 4 ；甲基化；r n a i ；转录调控 基金项目：国家自然科学基金( 3 0 1 7 1 0 0 8 ) ；辽宁省自然科学基金( 2 0 0 9 2 1 1 0 ) 英文论著摘要 s t u d y o nt h er o l ea n d r e g u l a t i o nm e c h a n i s m s o f s 1 0 0 a 4d n a m e t h y l a t i o ni nl a r y n g e a lc a r c i n o m a a b s t r a c t s l a r y n g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ( l s c c ) i so n eo ft h em o s tc o m m o nh e a d a n dn e c kc a n c e r s i nc h i n a ，t h en o r t h e a s tp a r ti st h eh i g hi n c i d e n c er e g i o no fl a r y n g e a l c a r c i n o m a t h ei n c i d e n c eo fl s c c sh a sb e e nr i s i n gi nc h i n ao v e rp a s td e c a d e s l a r y n g e a lc a n c e rc e l l sa r en o ts e n s i t i v et or a d i o t h e r a p ya n dc h e m o t h e r a p y ，s os u r g e r y i st h ep r i m a r ym e t h o di nt r e a t i n gl s c cp a t i e n t s h o w e v e r ，s u r g e r yc o u l db r i n g d i f f e r e n td e g r e e so fd a m a g et ol s c cp a t i e n t s a tp r e s e n c e ，ac o m m o nq u e s t i o ni nt h e d i a g n o s i sa n dt r e a t m e n tp r o c e s s i st h eh i d d e ni n c i d e n c eo fl a r y n g e a lc a r c i n o m a ，w h i c h m e a n sp a t i e n t sd i a g n o s e da r eo f t e nf o u n di nt h em i d d l eo rl a t es t a g e t h e r e f o r e ，i ti s u r g e n tr e q u i r e m e n tt of i n dan e ww a y t od e t e c to rd i a g n o s el s c ci ne a r l ys t a g e m a l i g n a n tt u m o r sa r ec o n s i d e r e da sg e n e t i ca n de p i g e n e t i cd i s e a s e s g e n e sp l a y a ni m p o r t a n tr o l ei nt u m o r i g n e s i s t h ea l t e r a t i o no fg e n es e q e n c ec o u l dr e s u l l ti nt h e a b n o r m a le x p r e s s i o n so ft h er e l a t e dg e n eu s u a l l yl e a d i n gt ot h ea b n o r m a lp h e n o t y p e h o w e v e r g e n ee x p r e s s i o ni sa l s oc o n t r o l l e db ye p i g e n e t i ce v e n t s i nr e c e n ty e a r s ， g e n ee x p r e s s i o n sr e g u l a t e db ye p i g e n e t i cm e c h a n i s m sh a v eb e c o m eah o t s p o ti n s t u d y i n g h u m a nd i s e a s e s d n am e t h y l a t i o n ，h i s t o n em o d i f i c a t i o n sa n dr n a i n t e r f e r e n c ea r ei n v o l v e di ne p i g e n e t i cp r o c e s s e s ，a m o n gw h i c hd n a m e t h y l a t i o ni s h i 曲l yc o n c e r n e d e p i g e n e t i cm e c h a n i s m sa r ec l o s e l yr e l a t e dt ot h eo c c u r r e n c ea n d d e v e l o p m e n to fm a n yd i s e a s e si n c l u d i n gc a n c e r s d n am e t h y l a t i o ni s ar e v e r s i b l e p r o c e s so fm o d i f i c a t i o n d n am e t h y l a t i o ni n h i b i t o r s ，s u c ha s57 一a z a - d e o x y c y t i d i n e ( 57 一a z a - c d r ) w h i c hc a ni n h i b i td n am e t h y l t r a n s f e r a s ea c t i v i t ya n dc h a n g et h e m e t h y l a t i o n s t a t u so ft u m o r - r e l a t e dg e n e ss ot h a tg e n ef u n c t i o ni sr e s t o r e do r e n h a n c e d ，b e c o m ep r o s p e c t i v er e a g e n t si nt r e a t i n gt u m o rc e l l s b yu s i n g2 - d e ( t w o 4 d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ) a n dm a s ss p e c t r o m e t r y ( m s ) t e c h n o l o g i e sc o m b i n i n g b i o i n f o r m a t i c s r e s o u r c e ，w ep r e v i o u s l yo b t a i n e d5 一a z a - c d r - a s s o c i a t e dp r o t e i n p r o f i l e sa n ds o m ei m p o r t a n tg e n e ss u c ha ss i o o a 4i nl a r y n g e a lc a r c i n o m a h u m a n s i o o a 4g e n e ，w h i c hi sl o c a t e do nl q 2 1 ，c o d e sa1 1 7 k d ap e p t i d ew i t h 1 0 1a m i n o a c i d s s i o o a 4p a r t i c i p a t e si nb i o l o g i c a lp r o c e s s e ss u c ha sc y t o s k e l e t o nf o r m a t i o n ，c e l l s h a p ea n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n t h ea b n o r m a le x p r e s s i o nl e v e l so fs i o o a 4w e r ef o u n d i n e s o p h a g e a lc a n c e r , s t o m a c hc a n c e r , c o l o nc a n c e ra n dm e l a n o m a ，b u tt h e m e c h a n i s mo fs io o a 4i n v o l v e di nt u m o r i g e n e s i si ss t i l lu n c l e a r , a n dt h ea s s o c i a t e d d a t ao fs i o o a 4w i t hl a r y n g e a lc a n c e rh a v en o tb e e nr e p o r t e d t h i ss t u d ya i m st o d i s c o v e rt h ef u n c t i o na sw e l la st h ep o s s i b l em e c h a n i s mo f $ 1 0 0 a 4g e n ei nt h e g e n e s i sa n dd e v e l o p m e n to fl s c c m a t e r i a l sa n dm e t h o d s c l i n i c a ll a r y n g e a lc a r c i n o m as p e c i m e n sa n dl a r y n g e a ls q u a m o u sc e l ll i n eh e p 2 w e r eu s e di nt h i ss t u d y s io o a4g e n ee x p r e s s i o nw a sd e t e c t e db yu s i n gr t - p c ra n d w e s t e r nb l o t t h e m e t h y l a t i o ns t a r t s o fs io o a 4g e n ew a sd e t e c t e db yu s i n g m a t h y l a t i o n - s p e c i f i cp c r ( m s p ) s p e c i f i cs i r n af o rs i o o a 4g e n e ( s i o o a 4 - s i r n a ) d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e di nv i t r ow a st r a n s f e c t e di n t oh e p 2c e l l sb yt r a n s m e s s e n g e r t r a n s f e c t i o nr e a g e n t t h ei n h i b i t o r ye f f e c to fs i o o a 4 - s i r n ao ns i o o a 4g e n ei n h e p 2c e l ll i n ew a se v a l u a t e db yr t - p c ra n dw e s t e r nb l o t b i o l o g i c a lc h a n g e so f h e p 2c e l l st r a n f e c t e db ys io o a 4 - s i r n aw e r ed e t e c t e db ym t t , f l o wc y t o m e t r y , t r a n s w e l l ，r t - p c ra n dw e s t e r nb l o t t h ew i l d - t y p ea n dm u t a n t t y p ef l u o r e s c e n t r e p o r tl u c i f e r a s ee x p r e s s i o nv e c t o r si n c l u d i n gt h es p e c i f i c a l l ym e t h y l a t e ds i t e so f s io o a4p r o m o t e rw e r ec o n s t r u c t e dt od e t e c ta n da n a l y s et h et r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n r o l eo fs i o o a 4g e n e t h eb i o i n f o r m a t i c sp r e d i c t i o ns o f t w a r ew a su s e dt op r e d i c tt h e t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sw h i c hm a y b i n ds i o o a 4 t h e p r e d i c t e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sw e r e t e s t e db yu s i n ge m s aa n dc h i p 5 s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u pa n di nd a y7o fs io o a 4 - s i r n a t r a n s f e c t i o nt oh e p 2c e l l s ，s io o a 4p r o t e i nl e v e lw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a t i nt h ec o n t r o lg r o u p ，w h i c hi n d i c a t e dt h a ts i o o a 4e x p r e s s i o nw a si n h i b i t e db y s l o o a 4 s i r n a 4 i n f l u e n c eo fs i o o a 4 - s i r n ao nb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fl a r y n g e a lc a r c i n o m a c e l l sh e p 2 ：c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p ，t h ea b i l i t i e so fp r o l i f e r a t i o na n d i n v a s i v e n e s sw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e r ，a n da p o p t o t i cc e l l sw e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e ri nh e p 2c e l l st r a n f e c t e db ys i o o a 4 - s i r n a 5 p r e d i c t i o n so f $ 1 0 0 a 4r e g u l a t o r ys i t eb i n d i n gt ot r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ：t h e s e a r c h i n gr e s u l t sf r o mp - m a t c hs o f t w a r ed i s p l a y e dt h a tt r a n s c r i p t i o nf a c t o ro f c m y b ，c e b p ，a p 2 ，a n dm s x 一1m i g h tb i n dt h ec o r r e s p o n d i n gs i t e so fs i o o a 4 r e g u l a t o r yr e g i o n 6 l u c i f e r a s er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em e t h y l a t i o ns t a t u so fs io o a 4r e g u l a t o r yr e g i o n c o u l dc h a n g et h ep r o m o t e ra c t i v i t i e so fs l o o a 4 7 e m s ar e s u l t ss h o w e dt h a tc - m y ba n dc e b pe x c e p ta p 2a n dm s x 一1s p e c i f i c a l l y b o u n ds i o o a 4i nv i t r o 8 c h i pr e s u l t sp r o v e dt h es p e c i f i cb i n d i n go fc m y ba n dc e b pt o $ 1 0 0 a 4i nv i v o c o n c l u s i o n 1 o v e r e x p r e s s i o no f $ 1 0 0 a 4i nh u m a nl a r y n g e a lc a r c i n o m aa n dm e t a s t a t i cl y m p h n o d e sp a r t i c i p a t e si nt h eg e n e s i sa n d d e v e l o p m e n to f l s c c 6 2 t h em e t h y l a t i o ns t a t u so f $ 1 0 0 a 4p r o m o t e ra n df i r s ti n t r o nc o n t r i b u t e st ot h e o v e r e x p r e s s i o no f s l o o a 4 i nl s c c 3 s io o a 4c a np r o m o t et h eg r o w t ha n di n v a s i v e n e s sa n di n h i b i tt h ea p o p t o s i so f l a r y n g e a l c a n c e rc e l l s ，w h i c hi n d i c a t e ss io o a 4i sa l l i m p o r t a n to n c o g e n e a s s o c i a t e dw i t hl s c c 4 c m y ba n dc e b p c o u l db i n ds io o a 4g e n e s p e c i f i c a l l y , a n d t h ec - m y b m e t h y l a t i o ns t a t u si nb i n d i n gs i t e so fs i o o a 4g e n ea f f e c t st h ee x p r e s s i o no f $ 1 0 0 a 4g e n e k e yw o r d s ：l a r y n g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ( l s c c ) ；s 10 0 a 4 ；m e t h y l a t i o n ； r n a i ；t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n s u p p o r t e db yt h en a t i o n a ln a t u r es c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a ( 3 0 1710 0 8 ， 3 0 7 0 0 9 8 0 ) ，n a t i o n a l8 6 3p r o j e c to fc h i n a ( 2 0 0 2 b a 7 11 a 0 8 - 18 ) a n dn a t u r es c i e n c e f o u n d a t i o no fl i a o n i n gp r o v i n c e ( 2 0 0 9 2 11 0 ) 7 - 英文缩略语- 缩略词英文注释 中文注释 r n a i s i r n a e m s a t s g e d t a t e m e d d t t f a c s p i l u - p c r b s a c d n a m t t d m s o c h i p r n ai n t e r f e r e n c e s m a l l i n t e r f e r e n c er n a l 矾a 干扰 小干扰r n a e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a a y 凝胶电泳阻滞实验 t u m o rs u p p r e s s o rg e n e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e d i t h i o t h r e i t o l f l u o r e s c e n c ea c t i v a t e dc e l ls o r t e r 肿瘤抑制基因 乙二胺四乙酸二钠 四甲基二乙胺 二硫苏糖醇 流式细胞仪 p r o p i d i u mi o d i d e 碘化丙锭 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i n 反转录一聚合酶链反应 r e a c t i o n b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 互补d n a t h i a z o l y lb l u e 噻唑蓝 d o m e t h y ls u l f o x i d e c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n 二甲基亚砜 染色质免疫沉淀 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 8 - 论文- - 论文第一部分- s i o o a 4 基因d n a 甲基化在喉鳞状细胞癌中作用的研究 刖菁 对肿瘤( 癌) 发生机制和防治的研究，多年来一直是人们关注和研究的热点 问题。肿瘤的发生和侵袭转移是涉及许多基因参与的、多途经和多步骤的发展过 程。 喉鳞状细胞癌( l a r y n g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ，l s c c ，喉癌) 是头颈 部常见的恶性肿瘤之一【。在我国发病率相对较低，约占全身肿瘤的1 5 ，在 耳鼻喉科领域中仅次于鼻咽癌和鼻窦癌，居第三位。好发年龄为5 0 7 0 岁，男 性较女性多见，约为8 ：1 。在我国，东北地区是喉癌的高发区域，过去1 0 年中， 随着现代工业的发展，喉癌的发病率呈现上升的趋势。喉癌对放疗及化疗均不敏 感，手术是目前治疗的主要手段，晚期喉癌发生全身转移预后差，对该期病人无 有效治疗方法【2 训。 恶性肿瘤被认为是一种遗传和表观遗传性疾病【5 1 。基因在生物发生的病变 机制中具有非常重要的作用，基因的序列异常通常会导致表型的异常。此外，基 因表达还受表观遗传的控制。近年来，表观遗传学研究己成为基因表达调控的研 究热点之一。本室利用二维电泳( t w od i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，2 d e ) 和 质谱技术以及丰富的生物信息资源建立了喉癌5 一a z a c d r 相关的基因蛋白表达 谱，对5 - a z a - c d r 相关的差异蛋白点进行质谱鉴定和分析，发现$ 1 0 0 a 4 是差异表 达显著的蛋白质，提示$ 1 0 0 a 4 基因可能是喉癌发生过程中的一个重要基因。 s 1 0 0 a 4 是s 1 0 0 蛋白家族成员之一，s 1 0 0 蛋白最先是由牛脑中提取到的一组 低分子量的钙结合调节蛋白，它能1 0 0 溶于硫酸铵溶液，因此命名为s 1 0 0 蛋白 【5 l 。迄今为止己确定2 0 多个s 1 0 0 家组成员，他们在结构上具有2 5 6 5 的同源 性，有相似的物理特性。s 1 0 0 蛋白家族成员具有共同的e f 双螺旋结构的氨基酸 9 序列( 手型钙离子结合区) ，当此区与钙离子结合后s 1 0 0 蛋白构象就发生改变， 暴露出其与靶蛋白结合的位点，进而通过相应的靶蛋白发挥其生物学效应。s 1 0 0 蛋白被认为是一种钙传感器蛋白，通过钙离子信号转导途径在细胞增殖分化、细 胞间黏附、细胞运动、基因表达及细胞凋亡中发挥重要作用睁引。 人类s i o o a 4 基因定位于l q 2 1 ，由不同研究组克隆的s i o o a 4 基因还被命名 为m e t a s t a s i n ( m t s1 ) 、p e l 9 8 、18 a 2 、f i b r o b l a s t s p e c i f i cp r o t e i n ( f s p1 ) 、p 9 k a 、 c a p l 、4 2 a 和c a l v a s c u l i n 等。s i o o a 4 基因包含4 个外显子，其中5 侧翼端中有 一个非编码的外显子，由于5 侧翼端存在剪切拼接的改变，$ 1 0 0 a 4 有两个转录 本。s 1 0 0 a 4 蛋白是由1 0 1 个氨基酸组成的多肽，分子量约为1 1 7 k d a 9 1 。在没与 钙离子结合时，它的三维结构与家族成员s 1 0 0 b ，s 1 0 0 a 1 和s 1 0 0 a 6 十分相似。 像多数s 1 0 0 家族成员一样，s 1 0 0 a 4 通过两个环的亚基( 1 ，4 ，l ，4 7 ) 的非共 价相互作用形成稳定的同源二聚体【1 0 】。但以非共价键二聚体形式存在于细胞内 的s i o o a 4 蛋白可以被分泌到细胞外，并能以共价键二聚体的形式存在于细胞间 质中，这种转换更有利于s 1 0 0 a 4 蛋白与其他功能蛋白发生作用，从而促进肿瘤 的发生和发展【l 。愈来愈多的研究表明，s i o o a 4 可以影响细胞周期，进而使细 胞发生恶变，提示其与多种肿瘤的发生有关。同时，s i o o a 4 基因还通过参与多 个肿瘤转移通路，促进肿瘤的转移和侵袭。有研究表明，$ 1 0 0 a 4 在正常肺、肾 脏和乳腺等组织细胞中无表达【1 2 - 1 4 】，而在乳腺癌、结直肠肿瘤、胃肿瘤和卵巢癌 1 5 - 1 7 1 等肿瘤中高表达。目前，有关s i o o a 4 基因在肿瘤发生发展中的分子机制仍 不清楚。在本研究中，我们在国内外首次对s i o o a 4 基因在喉癌发生、发展中的 作用和分子机制进行了探讨。 实验材料 实验材料和方法 1 组织来源 喉鳞状细胞癌标本取自解放军4 6 3 医院全军耳鼻喉中心、中国医科大学附属 第一医院耳鼻喉科，手术切取喉癌组织及距癌组织l 厘米以上的癌旁正常组织， 均经病理证实。患者术前均未接受放疗和化疗，标本术后立即冻存7 0 。c 冰箱中 l o 备用。 2 细胞系 人喉癌细胞系h e p 2 购自中国科学院上海生命科学研究所。 3 主要试剂 ( 1 ) t r i z o lr e a g e n t ( i n v i t r o g e n 公司产品) ( 2 ) r e v e r s et r a n s c r i p t i o ns y s t e m ( t a k a r a 公司产品) ( 3 ) d e p c ( p r o m e g a 公司产品) ( 4 ) p c rk i t ( t a k a r a 公司产品) ( 5 ) 蛋白裂解液( 碧云天公司产品) ( 6 ) 兔抗人s 1 0 0 a 4 蛋白质抗体( s a n t a 公司产品) ( 7 )兔抗人t u b u l i n 蛋白抗体( 碧云天公司产品) ( 8 )山羊抗兔二抗( 北京中山公司产品) ( 9 ) e c l 发光试剂( 碧云天公司产品) ( 1 0 ) 琼脂糖( t a k a r a 公司) ( 1 1 ) 丙烯酰胺( s i g m a 公司) ( 1 2 ) 甲叉双丙烯酰胺( m e r c k 公司) ( 1 3 ) m s p 试剂盒( 北京天漠公司产品) ( 1 4 ) 无内毒素质粒中提试剂盒( t i a n g e n 公司产品) ( 1 5 ) p m d l 8 tv e c t o r ( t a k a r a 公司) ( 1 6 ) r p m 1 1 6 4 0 培养基、胎牛血清( g i b c o 公司) ( 1 7 ) m t t 试剂( p r o m e g a 公司产品) ( 1 8 ) 苏木素，伊红( 北京中衫公司) ( 1 9 ) 转染试剂l i p o f e c t a m i n2 0 0 0 ( i n t r o v i g e n 公司产品) ( 2 0 ) s i l e n c e r s i r n a 化学合成试剂盒( a m b i o n 公司) ( 2 1 ) t r a n s m e s s e n g e r 转染试剂( q i a g e n 公司) ( 2 2 ) a n n e x i n - v f i t c 凋亡检测试剂盒( 凯基公司) ( 2 3 ) 6 孔板、9 6 孔板、t r a n s w e l l 小室( c o s t e r 公司) 4 主要仪器 ( 1 ) h e i d o l p hd l a x 6 0 0 匀浆器( 德国) ( 2 ) h e r m l e z 3 2 3 k 台式低温超速离心机( 美国) ( 3 ) 凝胶自动成像仪g d s 8 0 0 0 ( u v p 美国b i o r a d 公司) ( 4 )电泳仪( b i o r a d m o d e l 2 5 0 2 5 ，s w e d e n ) ( 5 ) 电泳槽( b i o r a d m i n ip r o t e a n l1t m ，s w e d e n ) ( 6 ) 紫外分光光度仪( l k b b i o c h r o m u l t r o s p e ci i ，j a p a n ) ( 7 ) p c r 扩增仪( 4 8 0 0 ，2 4 0 0 ，9 6 0 0 型p e 公司) ( 8 ) 蛋白转膜电泳槽( 美国b i o r a d 公司) ( 9 ) p o w e r l o o k l l i 扫描仪( u m a x 公司) ( 1 0 ) 光学显微镜( 日本0 l y m p u s ) ( 1 1 ) 台式高速离心机( t g l 1 6 g 上海生物仪器厂) ( 1 2 ) 真空冷冻干燥机( c e n t r iv a pl a b c o n c o ，u s a ) ( 1 3 ) 高速离心机( 德国b e i k m a n ) ( 1 4 ) 超净工作台( 上海医用仪器厂) ( 1 5 ) 恒温振荡器( t h z 9 5 型北京四环科学仪器厂) ( 1 6 ) 酶标仪( m o d e l6 8 0 ，b i o r a d ) ( 17 ) 流式