（动物学专业论文）家蝇防御素的基因克隆与重组表达.pdf

山东人学碰i 学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律责任由本人承担。 论文作者签名：墨乒戡日期：竺；? 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅：本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：兰圭亟导师签名：论文作者签名：缆型导师签名：互键日期：童：! ! 三上土z 山东大学碰士学位论文 家蝇防御素的基因克隆与重组表达 摘要 昆虫在整个动物界是种类最多的一个纲。它们之所以种类繁多，分布广泛，与它们 对病原体的有效抵御有着密切的关系。昆虫免疫防御系统不同于脊椎动物，一般认为不 存在适应免疫。其体液免疫能够通过产生有抗菌活性的肽类物质来抵御外来物质的侵 袭。自b o m a n 等于1 9 8 0 年首次从惜古比天蚕( h y a l o p h o r ac e c r o p i a ) 的滞育蛹中获得 第一个抗菌肽天蚕索( c e c r o p i n ) 以来，从各种生物体中获得的天然抗菌肽分子有 8 0 0 多种仅仅从昆虫中就得到1 7 0 多种抗菌肽，抗菌肽成了人们在昆虫免疫和先天免 疫研究中的热点。昆虫抗菌肽是昆虫经外界刺激诱导而产生的一类体液免疫物质，具有 独特的杀菌作用机制、广谱抗菌活性、热稳定性强、阳离子性、分子量小( 3 o 5 0 k d a ) 等特点。防御索( d e f e n s i n ) 是广泛存在于动物和植物体内的一类阳离子抗菌肽。昆虫 防御索( i n s e c td e f e n s i n ) 是昆虫抗菌肽家族中最为普遍的一类，同样也具有上述特点， 并且在不同物种中有很高的保守性。 抗菌肽的作用靶部位是细菌细胞质膜因此不会像传统抗生素那样很容易产生细菌 耐药性，并认为抗菌肽有望成为新一代抗菌药物目前已有多种抗菌肽药物进入l l 期和 i i j 期i 临床试验。因此，对昆虫抗菌肽进行研究具有广泛的理论和应用价值。 本研究选取家蝇( m u s c a d o m e s t i c a ) 为实验材料，在实验室已有基础上，成功克隆 到家蝇防御素基因的全长c d n a ，并在大肠杆菌g s t 融合蛋白表达系统成功表达了家蝇 防御素成熟肽的融合蛋白g s t m d d e ，且检测到有抑菌活性，另外构建了毕赤甲醇酵 母( p i 曲i a p a s t o r i s ) 表达系统重组m m d d e p a 0 8 1 5 的多拷贝载体。 根据己报道昆虫防御素氨基酸的保守序列，设计简并引物，以家蝇e d n a 文库为模 板，p c r 扩增得到一1 1 9 b p 的防御素基因e d n a 片段，再以特异性引物、1 g t l l 的下游 引物及e d n a 接头为引物进行p c r 扩增，得到了4 3 0 b p 的全长e d n a 序列，命名为m d d e ， 通过i n t e m e t 生物信息学资源进行序列分析，结果表明具有完整的编码框，编码一个具 有9 2 个氨基酸的防御索前体蛋白，与其他昆虫防御素的相似性为5 1 7 3 ，其中第1 2 2 个氨基酸残基为信号肽，成熟肽由4 0 个残基( 5 3 - 9 2 ) 组成。成熟肽分子量为4 0 k d a ， 等电点为8 6 9 ，有1 个带负电荷的氨基酸残基和4 个带正电荷的氨基酸残基。同时还对 成熟肽的二级结构进行了推测，具有昆虫防御素典型的c s a b 基序。 坐查查茎壁主兰些兰苎 ： 从家蝇体中分离纯化抗菌肽得率太低，人工化学合成成本太高，通过基因工程方法， 让抗菌肽基因在宿主载体中大量表达而获得抗菌肽是一种合理易行的方法。为了进一步 验证该c d n a 的正确性和获得有抗菌活性的防御素，分别在原核大肠杆菌表达系统( 以 g s t 融合蛋白的形式表达) 和真核毕赤酵母表达系统( 胞内表达) 做了表达研究探索。 根据克隆到的家蝇防御素基因的e d n a 序列，设计特异性引物，p c r 扩增成熟肽序列的 c d n a 片段，将成熟肽序列重组到表达载体p g e x 4 t 1 中，构成m m d d e p g e x 4 t 1 重 组表达载体，在大肠杆菌b l 2 1 中诱导表达，重组表达的融合蛋白g s t m d d e 占菌体总 蛋白的3 3 4 。纯化得到g s t m d d e 后，再用凝血酶将其从特定位点切开，得到表达的 m m d d e 。液体抑菌实验结果初步表明，表达的融合蛋自g s t m d d e 对细菌生长有一定 的抑制作用。在真核毕赤酵母( p i c h i a ) 表达系统中，选取胞内表达的穿梭质粒d a 0 8 15 为表达载体，体外构建得到1 、2 、4 、8 拷贝表达载体m m d d e p a 0 8 1 5 ，以备筛选多拷 贝表达菌株。并且将单拷贝和8 拷贝载体转化酵母表达细胞k m 7 1 ，筛选到重组转化子， 诱导表达研究正在进行中。 关键词家蝇【m u s c ad o m e s t i c a ) 防御素基因克隆重组表达 些堡查兰壁主。兰垡! l 塞一 c l o n i n ga n dr e c o m b i n a n t e x p r e s s i o no f d e f e n s i n ， an e w g e n ee c o d i n ga na n t i m i c r o b i a l p e p t i d e f r o mh o u s e f l y ( m u s c ad o m e s t i c a ) a b s t r a c t m u l t i c e l l u l a ro r g a n i s m sl i v e b ya n dl a r g e h a r m o n i o u s l yw i t hm i c r o b e s ，b o t ha n i m a l s a n dp l a n t sp o s s e s s b r o a d s p e c t r u ma n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ，w h i c ht h e yu s et of e n do f f aw i d e r a n g eo fm i c r o b e s i n c l u d i n gb a c t e r i a , f u n g i v i r u s e s a n d p r o t o z o a t h e h o s td e f e n s eo fi n s e c t s m a i n l yr e l i e so nh u m o r a lr e a c t i o n sw h o s e h a l l m a r ki st h em a s s i v es y n t h e s i so fa n t i m i c r o b i a l p e p t i d e sb y t h ef a tb o d ya n dh e m o c y t e sa f t e ra l li m m u n e c h a l l e n g e t h ep e p t i d e sa r er e l e a s e d i n t ot h e h e m o l y m p ho ft h e i n s e c t w h e r et h e yc o n t r i b u t et os u r v i v a l a g a i n s tp o t e n t i a l p a t h o g e n si n f e c t i o n s d e f e n s i n i saf a m i l yo fs m a l l ( 3 0t o5 0k d a ) c a t i o n i c i n d u c i b l e a n t i m i e r o b i a lp e p t i d et h a th a sb e e nf o u n di nl a r g er a n g eo fl i v i n go r g a n i s m s t h e yc o n t r i b u t e t oh o s td e f e n s eb yd i s r u p t i n g 。t h ec y t o p l a s m i cm e m b r a n eo f m i c r o o r g a n i s m s 。i n s e c td e f e n s i ni s am e m b e ro faw i d e l yd i s t r i b u t e df a m i l yo fa n t i m i c m b i a lp e p t i d e sw i t hac h a r a c t e r i s t i c s i x c y s t e i n e t h r e e d i s u l f i d eb r i d g e p a t t e r n w i t h b r o a da n t i m i c r o b i a ls p e c t r u ma n dm o s t p h a r m a c e u t i c a l e f f o r t 。a n t i m i c m b i a l p e p t i d e s ，i n c l u d i n g d e f e n s i n ，r e p r e s e n t as o u r c eo f p o t e n t i a ln o v e la n t i b i o t i ca g e n t s h e r e ，w er e p o r tan o v e l4 3 0b pf u l l l e n g t he d n ao f a ni n s e c td e f e n s i ng e n ec l o n e df r o m h o u s e f l y ( m u s c ad o m e s t i c a ) t oc l o n e t h ei n s e c td e f e n s i ng e n e ，w ed e s i g n e dt w o d e g e n e r a t e d p r i m e r s m d d e f la n dm d d e r lb a s e do nc o n s e r v a t i v ea m i n oa c i d s e q u e n c e so fi n s e c t d e f e n s i n s u s i n gp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) f r o me d n al i b r a r yo fh o u s e f l y w h i c hh a d b e e nc h a l l e n g e db yec o l ia n d s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s , w e o b t a i n e d1 1 1 111 9 b pc d n a f r a g m e n t h i 曲l yh o m o l o g o u s t 0t h ed e f e n s i n 眦i i i l oa c i ds e q u e n c eo ff l e s hf l y ( s a r c o p h a g a p e r e g r i n a ) c o n s e q u e n t l y , b a s e do nt h i sf r a g m e n tw ed e s i g n e da n o t h e rt w os p e c i f i cp r i m e r $ m d d e f 2a n d m d d e r 2t oc l o n et h ef u l l l e n g t he d n ao fd e f e n s i ng e n eu s i n g3 a n d5 p c r t h e4 3 0 b p f u l l l e n g t hc d n a w a sd e t e r m i n e db ys p l i c i n gt h et h r e eo v e r l a p p i n ge d n a f r a g m e n t s ：119 b p 3 - e n d ( 2 5 3 b p ) a n d5 - e n d ( 3 5 2 b p ) s e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h eo p e nr e a d i n gf r a m eo f t h ee d n ae n c o d e da9 2 一a m i n oa c i d p e p t i d e ，w h i c hc o n t a i n sa nn h 2 - t e n r t i n a ls i g n a ls e q u e n c e 1 坐奎查茎堡主兰垡堡塞 一 f1 2 2 ) f o l l o w e db y a p r o p e p t i d e ( 2 3 5 2 ) a n d am a t u r ep e p t i d e ( 5 3 9 2 ) t h es e q u e n c ei d e n t i t y c o m p a r e dw i t ho t h e rk n o w n i n s e c td e f e n s i n si sb e t w e e n51 a n d7 3 t h em a t u r ep e p t i d e ， w i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a rw e i g h to f4 0k d a , a n dp io f8 6 9 ，h a s1n e g a t i v ec h a r g e da m i n o a c i da n d4p o s i t i v eo n e s t h ep u t a t i v ei n s e c td e f e n s i ni sc h a r a c t e r i z e db y6i n v a r i a n tc y s t e i n e r e s i d u e sf o r m i n g3d i s u l f i d eb o n d s ：c y s l c y s 4 ，c y s 2 一c y s 5a n dc y s 3 - c y s 6 t h e s er e s u l t s s u g g e s tt h a t t h en o v e lf u l l l e n g t he d n ao fd e f e n s i ng e n e ，d e n o m i n a t e dm d d e h a sb e e n s u c c e s s f u l l yc l o n e df r o mh o u s e f l y t h ea n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sw e r ed i f f i c u l tt ob ei s o l a t e df r o mn a t u r a ls a m p l e sa n do n l y s m a l la m o u n t so f p u r i f i e dp e p t i d e sc o u l db e o b t a i n e d f o rt h e s er e a s o n sa n di no r d e rt of u r t h e r c h a r a c t e r i z et h ei n s e c td e f e n s i ni nt e r m so f b i o l o g i c a la c t i v i t y , al a r g e s c a l ep r o d u c t i o ns y s t e m w a sc o n s i d e r e d h e r e ，w ee x p r e s s e dt h ee d n ao fm a t u r ed e f e n s i ni ne s c h e r i c h i ac o i lu s i n g p g e x 4 t - 1f u s i o ne x p r e s s i o ns y s t e m b a s e do n t h ec d n a s e q u e n c eo f m a t u r ed e f e n s i n w e d e s i g n e dt w os p e c i f i cp r i m e r s t oo b t a i nt h em a t u r ee d n aa n d l i g a t e di t t op g e x 一4 t i w h i c h w ec h o o s ea se x p r e s s i o nv e c t o ri nec o l jb l 2 1 a n do b t a i nt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r ，竹- m d d e p g e x - 4 t 一1 a f t e ri p t g - i n d u c e dc u l t u r e t h eg s t - m d d ep r o t e i nw a sp u r i f i e db y g s t a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h em m d d ew a so b t a i n e db yt h r o m b i nc l e a v a g e t h el i q u i d g r o w t hi n h i b i t i o na s s a y ss h o w e dg s t - m d d e f u s i o np r o t e i nt h a tw a so b t a i n e db yr e c o m b i n a n t e x p r e s s i o nh a v ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t y t oe x p r e s st h em a t u r ed e f e n s i ni ny e a s tu s i n gm u l t i - c o p yp i c h i ae x p r e s s i o ns y s t e m w e c o n s t r u c t e di nv i t r ot h e1 ，2 ，4 ，8c o p i e se x p r e s s i o nv e c t o rm - m d d e p a 0 8 15 w h i c hc a nb e i n t e g r a t e di n t ot h ep i c h i ag e n o m e a n de x p r e s sr e c o m b i n a n t p r o t e i nb yi n t r a c e l l u l a re x p r e s s i o n w et r a n s f o r m e dt h es i n g l ec o p ya n dt h e8c o p i e sv e c t o r st ok m 7 1p i c h i ac e l l s ，a n do b t a i n e d t h er e c o m b i n a n tc l o n e sb yi d e n t i f i e dp c r k e y w o r d s h o u s e f l y ( m u s c ad o m e s t i c a ) ，d e f e n s i r l ，c l o n i n g ，r e c o m b i n a n te x p r e s s i o n 4 坐查查兰壁圭兰垒堡奎 缩略词 a m p a m s d b b p c d n a c s a b d n t p g s h g s t g s t m d d e i p t g l p s k b k d a m d d e m m d d e n f k b p b s p c r p i r p m s d s p a g e m i c t l r x g a 符号说明 英文全称 a m p i c i l l i n a n t i m i c r o b i a ls e q u e n c e s d a m b a s e b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a c y s t e i n es t a b i l i z e dd b m o t i f d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o z p h a t e g l u t a t h i o n ( r e d u c e d ) g l u t a t h i o ns t r a n s f e r a s e g s t m d d ef u s i o np r o t e i n i s o p r o p h y l t h i o - # - d g a l a e t o s i d e l i p o p o l y s a c c h a r i d e k i l o b a s e k i l o d a l t o n m u s c ad o m e s t i c ad e f e n s i n m a t u r em u s c ad o m e s t i c ad e f e n s i n n u c l e a rf a c t o rk - g e n eb i n d i n g p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n i s o e l e c t r i cp o i m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s d s p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t t o p h o r e s i s m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n t o l l 一l i k er e c e p t o r 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 3 - i n d o l y l - # - d g a l a c m s i d e 5 中文全称 氨苄青霉素 抗菌序列数据库 碱基对 互补d n a 半胱氨酸稳定b 基序 脱氧核糖核苷三磷酸 还原性谷胱苷肽 谷胱苷肽s 一转移酶 g s t m d d e 融合蛋白 异丙基硫代一卢d 半乳糖苷 脂多糖 千碱基 千道尔顿 家蝇防御素 家蝇防御素成熟肽 k 基因结合核因子 磷酸缓冲盐溶液 聚合酶链式反应 等电点 转每分钟 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 最小抑菌浓度 t o l l 样受体 5 - 澳- 4 一氯- 3 - 吲哚卢d - 半乳糖苷 山东大学硕士学位论文 第一部分综述 家蝇防御素是抗菌肽大家族中的一种，抗菌肽广泛分布于各种多细胞生物体中。从 昆虫、对虾等无脊椎动物到爪蟾、兔等脊椎动物和人体中都有抗菌肽的分布，在某些植 物体中也有抗菌肽的分布。为了清楚的阐述本研究的意义，首先对抗菌肽的研究进展作 一简要综述。 1 抗菌肽多样性 生物体主要有两种防线抵御病原体的侵袭：第一道防线是物理方式，例如昆虫的外 壳，哺乳动物的皮肤等：病原体一旦冲破第一道防线，第二道防线就会马上起作用，这 第二道防线就是生物体中各种免疫系统。高等生物和人体内存在复杂的免疫系统，由免 疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，此外，还有重要的局部免疫组织，如粘膜免疫系统 和皮肤免疫系统。但是，低等生物如昆虫、软体动物、甚至植物其防御免疫系统远远 没有高等生物那样复杂，依然生活在病原体繁多的世界上，它们又是如何来抵御外界病 原体的侵袭呢? 1 9 8 0 年，瑞典学者b o m a n 等首次从经细菌刺激的惜古比天蚕( m , a l o p h o l c e c r o p i a ) 滞育蛹中分离纯化得到可诱导产生、具有抗菌活性的小肽，命名为天蚕素 ( c e c r o p i n ) 。从此掀起了对抗菌肽研究的热潮，并且引起了对低等生物免疫系统的研 究重新认识到古老而又保守的先天免疫( i n n a t ei m m u n i t y ) 在生物体中的重要作用e i ， 并促进了对两大免疫方式：先天免疫和适应免疫( a d a p t i v ei m m u n i t y ) 研究的进一步深 入，肯定了这种具抗菌活性的小肽在先天免疫和宿主防御( h o s td e f e n s e ) 中的重要作用 1 3 4 1 。 随着不断的深入研究发现，不仅从昆虫体中大量得到这种具有抗菌活性的小肽。而 且在动物、植物体中也发现有大量类似的小肽存在，都具有在体外抑制细菌生长的活性， 所以人们将这类肽称之为抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ) 。不同来源的抗菌肽，抗菌的 作用也不尽相同，另外，抗菌肽不仅抗细菌，还对某些真菌、病毒、原虫、肿瘤细胞也 有一定的杀伤作用，并且在多细胞生物的先天宿主防御( i n n a t eh o s td e f e n s e ) 中起到重 要的作用卜“。最近研究结果表明，抗菌肽是大部分多细胞生物的先天免疫系统重要的组 成部分，在外界病原体侵入体内后，它是最先起到杀死病原体、引起免疫调控的活性物 质，是联系生物体先天免疫和适应免疫之间的桥梁【7 8 】。 抗菌肽典型的特点是分子量小、等电点高、多数带有阳离子、广谱抗菌等抗菌肽 坐查查兰璧主堂堡堡苎 的分勘广泛，在无脊椎动物、脊椎动物、植物体中都有抗菌肽的存在。除了上面提到的 c e c r o p i n ，还有从斑腹刺益蝽( p o d i s u s m a c u l i t ，e n t r i s 体内得到的t h a n a t i n j ，鲎( h o r s e s h o e c r a b t a c h y p l e u st r i d e n t a t u s ) 中得到的t a c h y p l e s i n i i ，非洲爪蟾( x e n o p u sm 州i x ) 中的 m a g a i n i n i ，人体内的d e f e n s i n t h n p l 4 ) 等，在植物中有从萝卜( r a p h a n u 、s a l i t y ) 种子中纯化有抗真菌活性的植物防御素( a f p l 和a f p 2 ) l 。同一生物体也可能有多种 抗菌肽，例如：从果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e t 一) 体内就得到至少7 类性质不同的抗菌 肤ld c f e n s i n 、d r o s o m y e i n 、c e c r o p i n 、d i p l e r i c i a 、d r o s o c i n 、a t t a c i n 、m e t c h n i k o w i n ) ”，并且每一类又有几个不同的成员。在抗菌序列数据库( a n t i m i c r o b i a l s e q u e n c e s d a l a b a s e ：a m s d b ) 被收录的天然抗菌肽己超过8 0 0 多种，仅仅从昆虫中得到的就有 17 0 余种，近1 0 年以来，各种抗菌肽以每年平均6 0 种的速度在各种刊物上报道i ”i 。因 此，抗菌肽的多样性也是其特点之一， 阳离子抗菌肽种类虽然繁多，但根据分子的二级结构可以分为以下3 种类型( 表1 1 ) ： l1 ) 具有双亲旺- 螺旋t f t 一h e l i c a l ) 的线性抗茵肽：这类分子不含半胱氨酸残基不 能形成分子内二硫键，有呈碱性的n 端和疏水性的c 端由水腊双亲q 螺旋构成二级 结构。水脂双亲一螺旋具有近乎完美的水脂两亲性，印圆柱形分子的纵轴一边为带证电 荷的亲水区，而对称面为疏水区。此二级结构是决定抗菌肽杀菌活性的基础，并使其具 有。谱抗菌活性铆如最早发现的c e c r o p i n 和菲澜爪蟾的m a g a i n i n 。 表1 1 动植物来源的各种代表性阳离子抗菌肽 t a b l e1 1o v e r v i e wo f c a t i o n i ca n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sf r o mp l a n t sa n da n i m a l s 具有p 片层( p s h e e t ) 或n 、螺旋和p 片层的抗菌肽 t h a n a t i n g s k k p v p i i y c n r r t g k c q r mi n s e c t阱 t a c h y p l e s i n l l u l r w c - f r v c y r g i c y r k c i r a h o r s e s h o ec r a bb c q - d e f e n s i n f h n p 3 ) 1 i d j d c t y c ：r i p a c x i a g e r r y g t c ? i y q g r l w a f c 。ch u m a n b c f p - d e f e n s i a ( t a p ) ” n p v s cr v r n k g i c ：印i r c ，冈s i d k q i g t c ：v g r a 咏c cr k kc o w e 8 c d e f e n s i n ( s a p e c i n a ) ”a t c , d i 。l s g t g i n t l s a c ? a a h c ：t l l r g n r g g y c i n g k a v c ：v c ，r ni n s e c te b c t t d r o s o m y c i n d c , l s g r y k g p c 2 a v w d n e t g r r v c , k e e g r s s g h c 2 s p s l k c ，w c 。e g c d r o s o p h i l a i i d e f e n s i n ( a f p l ) l l l o k l c e r p s g t w s g v c 正n s n a c k n q c i n l e k a r h g s c z n y v f p a h k c i c t y f p c r a d i s hs e e d s e 富禽p r o 或e j y 的抗菌肽 d r o s o c i n l “1 g k p r p y s p r p t s t l p r p i r v d h ) o h i l h m e t c h n i k o w i n l 一1 h r r o g p i f d t r p s p f n p n q p r p g p i y d r o s o p h i l a i i 1 2 q 0 g s 丌v n s d g t s g a a l k v p l t 6 k d k n v l s 1 g s a d f 哪r h k l s 从呲l a l n w n 6 h c l j t g a c c a t l n t r l p g f g e q l g v a g k n f i 州m l s a k a f a i r n s p s a l p n p h 下卅l g v w m f k 口k v g ss i l km o t h i i l s a a h s d i n r n d y s a ( ；g e l n i ，f r s p s s s l d f , a g f k i l 【f p t p f y l t s s w e p n v c f s f s k f f p , c b l o o dc e l l ：l h a e m o l y m p h ：e e p i t h e l i a lt i s s u e 些奎叁兰堡! 兰些望墨一 ( 2 ) 含有3 - 片层( b s h e e t ) 或a 螺旋和p 片层的抗菌肽：含有半胱氨酸残基，b 一 片层和1 4 个分子内二硫键，分子内可能也有d 螺旋，但没有水脂双亲的特性。如 t h a n a t i n 、t a c h y p l e s i n 、d e f e n s i n 、i n s e c td e f e n s i n 、d r o s o m y c i n 和植物防御素a f p l 、 a f p 2 。 ( 3 ) 富含脯氨酸( p r o ) 和或甘氨酸( g l y ) 的抗菌肽；富含p r o 的抗菌肽脯氨酸 残基含量在2 5 以上，它们通常与碱性残基( a r g ，l y s ) 以二联体( a r g p r o 或l y s p r o ) 和三联体( a r g p r o a r g ) 的形式存在，如d r o s o c i n 、m e t c h n i k o w i n ：富含g l y 的抗菌肽 甘氨酸含量。一般在1 8 2 2 之阳j ，如a t t a c i n 。这类抗菌肽不含c y s 不能形成分子内 二硫键，因此不能形成b 片层，据二级结构预测表明，这类抗菌肽分子不能形成d 螺旋。 最近几年，从不同动物体内发现了多种非阳离子抗菌肽 ”l ，大体可分为三类： ( 1 ) 阴离子抗菌肽( a n i o n i c p e p t i d e s ) ：有神经肽柬源的脑啡肽( e n k e p h a l i n ) 、p e p t i d e b 等1 2 5 2 6 1 ，还有类是富含天冬氨酸的抗菌肽，如绵羊的s a a p ( s u r f a c t a n t a s s o c i a t e d a n i o n i cp e p t i d e ) 【2 ”，人的d e m c i d i n 【2 9 等。 ( 2 ) 芳香一肽( a r o m a t i cd i p e p t i d e s ) ：分子中有苯环结构，主要是从双翅目昆虫中 分离得到的，如麻蝇( s a r c o p h a g ap e r e g r i n a ) 来源的 f 移丙氨酰- 5 - s - 谷胱甘酰一3 ，4 一二 羟苯丙氨酸( 邯- a l a n y l - 5 - s - g l u t a t h i o n y l 一3 ，4 - d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e ，5 - s - g a d ) 2 9 1 , 锯 蝇( a c a n t h o l y d a p a r k i ) 蛹来源的p - h y d r o x y c i n n a m a l d e h y d e p 。 ( 3 ) 氧结合蛋白( o x y g e n b i n d i n gp r o t e i n s ) 柬源的抗菌肽：这类抗菌肽由氧结合 蛋白经酶解产生，如从对虾中得到的3 种抗真菌肽的产生都与血蓝蛋白水解有关| 3 ”。 表1 2 非阳离子抗菌肽 t a b l e1 2n o n c a t i o n i ca n t i m i e r o b i a l p e p t i d e s 氧结台蛋向来源的抗菌肽( p e p t i d e s d e r i v e d f r o mo x y g e n b i n d i n gp r o t e i n s ) 血监蛋向来源”1 i对虾 寞菌 血红素米源旧 滴虫细菌 乳铁传递蚩向州 人 细菌、病每 8 山东大学硕士学位论文 相对于阳离子抗菌肽来说，阴离子抗菌肽、芳香二肽和氧结合蛋白来源的抗菌肽的 抗菌活性一般比较弱，其抗菌模式也与阳离予抗菌肽和其它抗生素不同，生理作用还有 待于进一步研究”。 抗菌肽分子结构的研究是阐明抗菌机制的基础，也是人工改造和合成高活性抗菌肽 的基础。除了对抗菌机理的研究外，还对抗菌肽在生物体中的生理功能进行研究。在昆 虫中，抗菌肽参与体液免疫，外界病原体侵入体内，受到刺激后，在几分钟之内便会产 生大量抗菌肽抵御和杀死入侵的病原体l 。低等生物中的抗菌肽产生一般被认为是诱导 产生的，外界诱导物可刺激生物体大量产生抗菌肽，诱导物有细菌、真菌、病毒等，某 些物理因素如超声波、紫外线等也可诱导产生抗菌肽，但是有的物种中的抗菌肽可能是 组成性表达，表达后储存在血细胞中，受到刺激时释放出来p ”。高等生物中的抗菌肽一 般认为是组成性表达，如人的b d e f e n s i n ，在生物体中参与正常生理功能主要参与生 物体先天免疫反应和辅助参与适应免疫应答【3 。最近比较新的观点认为某些抗菌肽是生 物体中参与免疫调节的信号传递分子【3 “。 2 防御索类抗菌肽 防御素是抗菌肽家族的一大类，除具有抗菌肽一般特性外，还有其典型的特征：6 个半胱氨酸残基组成的3 个分子内二硫键( 植物防御素有4 个二硫键) 1 3 8 1 。防御素最早 是在兔的肺巨噬细胞分离纯化出的小分子抗菌肽1 3 ”，三年后报道其氨基酸序列。8 0 年 代中期又从兔和人中性粒细胞胞浆颗粒中发现一系列一级结构相似的小分子抗菌肽，由 于其广谱抗微生物活性和其功能而命名为防御素( d e f e n s i n ) 。迄今已从不同种属动物吞 噬细胞、小肠p a n e i f h 细胞、上皮细胞、昆虫及植物中发现2 3 0 多种防御素分子i ”i ，是 一最大的内源性抗菌肽家族。 防御素是阳离子多肽，分子量为3 ，o 5 0 k d a 左右，分子中含有6 8 个c y s 残基 并形成3 4 对分子内二硫键，具有稳定的分子结构和广谱抗菌活性。根据分子结构特 征和来源的不同，防御素可分成四类：a 一防御素( a - d e f e n s i n ) 、1 3 - 防御素( b d e f e n s i n ) 、 昆虫防御素( i n s e c td e f e n s i n ) 和植物防御素( p l a n td e f e n s i n ) 。上述最早从兔中得到的 防御素被称为a - d e f e n s i n ，主要从哺乳动物嗜中性细胞或巨噬细胞分离而来，由2 9 3 6 个氨基酸组成，富含精氨酸，并含有6 个保守的半胱氨酸，由3 个反向平行的b 片层组 成，通过3 个二硫键连接，二硫键的连接位置分别为c y s l c y s 6 、c y s 2 c y s 4 、c y s 3 一c y s 5 。 c y s i c y s 6 连接n 端和c 端，形成分子大环，对革蓝氏阴性菌、革蓝氏阳性菌、真菌和 h i v 病毒都有不同程度的抑制作用。最近，z h a n g 等人在研究c a f ( c d 8a n t i v i r a if a c t o r ) 些堡垒兰堡! ：兰些丝兰 抑制h i v - 1 病毒复制作用过程中，采用蛋白质芯片技术，筛选并鉴定到人的一d e f e n s i n1 、 2 、3 对c a f 活性有明显的增强作用【4 0 l 。3 - d e f e n s i n 最早是在牛的呼吸道中发现的，命 名为t a p ( t r a c h e a la n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ) l i 8 】，在人体内己发现了4 种3 - d e f e n s i n ，分别 为h b d l “。1 3 - d e f e n s i n 分子较旺d e f e n s i n 大，由3 8 4 2 个氨基酸残基组成，也合有6 个保守的半胱氨酸残基，但二硫键连接位置不同，c