（遗传学专业论文）人类肿瘤发生候选基因lass5的克隆及其相互作用蛋白鉴定.pdf

：、! ：n j 0 摘要 l l ll ll l1 1 ) l1 ) i i ) i iiii y 1818 13 6 肿瘤严重危害着人类的身心健康，研究表明，肿瘤发生相关基因 在时空上的表达紊乱可导致肿瘤的发生。鉴定与肿瘤发生相关的基因 及其分子途径，对于从分子水平认识肿瘤发生的机制和肿瘤的治疗均 具有重要的意义。 为了鉴定与肿瘤发生相关的基因，本研究从h e l ac d n a 文库中克 隆了一个人类基因朋孓甄i a s s 5 位于1 2 号染色体上，编码一个含h o x 结构域和t l c 结构域的蛋白质。研究发现l a s s 家族基因从果蝇到哺 乳动物之间都具有高度的保守性，说明此蛋白所在的家族可能具有相 当重要的功能。通过酵母双杂交实验，我们筛选到一个与l a s s 5 相互 作用的候选蛋白s d h b ，s d h b 为一介导呼吸链生物功能和调控细胞生 长的相关蛋白。c o - i p 及p u l ld on 分析结果进一步证明，l a s s 5 和 s d h b 无论是体内还是体外都存在着较强的相互作用。亚细胞共定位 分析表明这两个蛋白在细胞质发生相互作用。与正常组织比较分析表 明，l a s s 5 和s d h b 在肿瘤组织中的表达量均大幅上调。在h e k 2 9 3 细 胞中过表达l a s s 5 或s d h b 蛋白均可以显著抑制m a p k 信号途径下游 转录因子p 5 3 和p 2 1 的转录激活。综合目前的研究结果来看，l a s s 5 有可能通过参与m a p k 信号途径调控细胞生命活动从而引起肿瘤发 生。 此外，作者在读期间还进行了一些其他研究工作。例如，为了利 用酵母双杂交技术进行c - g a p l 基因的功能研究而构建了 p g b k t 7 一g g a p i 重组质粒；成功构建t h o l e 转基因小鼠重组质粒以便 利用转基因小鼠进行h o l e 基因的功能研究；针对一骨胳石化症家系， 运用p c r 扩增和测序分析等技术对骨质代谢候选基因c i c n 7 的2 5 个 外显子及其与内含子交界区进行了突变检测，除了多态现象外未发现 碱基突变，证实该基因不是该家系患者的致病基因。 关键词：肿瘤，l a s s 5 ，酵母双杂交，m a p k ，转录活性 i i a b s t r a c t c a n c e r sh a v eb e e nt h r e a t e n i n ga n dd a m a g i n gh u m a nb e i n g s s e v e r e l y a si tk n o w n ，m i s t a k e si ns p a t i o t e m p o r a le x p r e s s i o n o fc r i t i c a l g e n e sr e s u l ti nc a n c e r t h ei d e n t i f i c a t i o n o f t u m o r i n d u c i n gg e n e sa n dt h em o l e c u l a rp a t h w a y st h a tc o n t r o l t u m o r i g e n e s i sa r es i g n i f i c a n tt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s m s u n d e r l y i n gt h ec a u s e so fc a n c e r sa n dc u r et h i sk i n do fd i s e a s e s w i t ht h ea i mo fi d e n t i f y i n gr e l a t e dg e n e si n v o l v e di nh u m a n c a n c e rd i s e a s e s ，ah u m a ng e n e ，l a s s s , w a si s o l a t e df r o mh e l a c d n ali b r a r y t h i sg e n el o c a t e si nc h r o m o s o m e1 2 qa n dc o d e sa p r o t e i nw i t hah o xd o m a i na n dat l cm o t i f t h em e m b e r so fl a s s f a m il ya r eh i g h l yc o n s e r v e df r o my e a s tt om a m m a l ，s u g g e s t i n g ap o t e n t i a li m p o r t a n c eo ft h i sf a m i l y u s i n gay e a s tt w o - h y b r i d s y s t e ms d h b ( s u c c i n a t e u b i q u i n o n eo x i d o r e d u c t a s ei r o ns u i f u r s u b u n i tb ) ，w h i c hh a sb e e ns u g g e s t e dt op l a yar o l ei nm e d i a t i n g t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n o fr e s p i r a t i o n c h a i na n dc e l l u l a r g r o w t h 。w a ss c r e e n e da sac a n d id a t ep a r t n e ro ft h eh u m a ni a s s 5 c o i pa n d p u lld o w n e x p e r i m e n t sf u r t h e rp r o v e dt h a tt h e r e e x i s t sa ni n t e n s ei n t e r a c t i o nb e t w e e nl a s s 5a n ds d h b ，e i t h e r i nv i v oo rv i t r o s u b c e l l u l a r c o l o c a l i z a t i o n a n a l y s e s i n d ic a t e dt h a tt h ei n t e r a c ti o nb e t w e e nt h et w op r o t e i n so c c u r i l l i nt h ec y t o p l a s m i nc o n t r a s tt ot h en o r m a lc o n t r o l ，e x p r e s s i o n a s s a y s m a n i f e s t e dt h a tb o t hl a s s 5 a n ds d h b p r e s e n t a s u b s t a n t i a li n c r e a s e m e n ti nt u m o u rt i s s u e s t h er e s u l t so f t r a n s c r i p t i o na c t i v i t ya s s a y ss h o w e dt h a to v e r e x p r e s s i o no f l a s s 5o rs d h bi nh e k 2 9 3c e ll sc o u l dr e m a r k a b l yi n h i b i t t h e t r a n s c r i p t i o n - s t i m u l a t i o na c t i v i t yo fp 5 3a n dp 2 1 ，w h i c ha r e d o w n s t r e a me f f e c t o ro fm a p kp a t h w a y i nc o n c l u s i o n ，w es u g g e s t t h a tl a s s 5li k e l yt a k ep a r ti nr e g u l a t i o no fc e lllif ep r o g r e s s t oc a u s et u m o rm o r p h o g e n e s i st h r o u g ha c t i n gar o l ei nm a p k p a t h w a y b e s i d e sa b o v ew o r k s ，o t h e rr e s e a r c h sw e r ef l n l s h e dl nt h e 。 t h r e ey e a r s f o re x a m p l e ，r e c o m b i n a n t so fp g b k t t - c , g a p l f o r y e a s tt w o - h y b r i da n a l y s i sa n dh o l et r a n s g e n e t i c - m i c ep l a s t i d f o rt r a n s g e n e t i cf u n c t i o ns t u d y ，w e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d f u r t h e r m o r e ，m u t a t i o n so fo s s e o u s - m e t a b o l i c c a n d i d a t eg e n e c i c n 7w e r es c r e e n e di n a no s t e o p e t r o sisf a m il yb yp c ra n d s e q u e n c i n g n om u t a t i o nw a sf o u n di nb o t h2 5c o d i n ge x o n sa n d i n t r o n e x o nb o u n d a r ie so ft h ec 1 c n 7g e n e ，e x c e p tf o rs e v e r a l p o l y m o r p h i s m s t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ec i c n tg e n ei sn o t r e s p o n s i b l ef o rt h ea f f e c t e di n d i v i d u a l si nt h i sf a m i l y k e y k o w d s ：c a n c e r ，l a s s 5 ，y e a s tt w o h y b r i d ， m a p k ， t r a n s c r i p t i o na c t i v i t y i v 目录 中文摘要i 英文摘要i i i 第一章文献综述 1 1 肿瘤发生的相关基因( 5 ) 1 2m a p k 信号转导途径与肿瘤发生( 1 8 ) 1 3 肿瘤发生与新陈代谢( 4 0 ) 第二章材料与方法 2 1 材料( s t ) 2 2 方法”( 5 4 ) 第三章i a 8 8 5 基因克隆及功能研究 3 1 人类l a s s 5 基因的克隆( 7 7 ) 3 2 酵母双杂交( 7 8 ) 3 3s d h b 的功能( 8 0 ) 3 4l a s s 5 和s d h b 细胞双杂交( 8 1 ) 3 5l a s s 5 和s d h b 在体外发生相互作用( 8 3 ) 3 6 l a s s 5 和s d h b 在体内发生相互作用( 8 5 ) 3 7s d h b 和l a s s 5 共定位在细胞质( 8 8 ) 3 8l a s s 5 和s d h b 在人体的表达以及在肿瘤组织中的表达 情况( 9 5 ) 3 9l a s s 5 和s d h b 相互作用调节p 5 3 ( 9 7 ) 3 1 0 小结( i 0 0 ) 第四章其他工作 3 1g g a p l 基因的初步研究( 1 0 3 ) 3 2h o l e 基因转基因小鼠质粒的构建( 1 0 4 ) 3 3 骨胳石化症家系c 1 c n 7 基因突变筛选( 1 0 6 ) 参考文献( 1 1 1 ) i 跗录1 ”“”“”( 1 2 9 ) 附录2 ”“”( 1 3 1 ) 后记”- ”一”“”“”( 1 3 3 ) 学位论文原创性声明( 1 3 5 ) 人类肿瘤发生候选基因l a s s 5 的克隆及其相互作用蛋白 第一章文献综述 肿瘤是一种常见多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最 严重的一类疾病。据统计，全世界每年约有5 0 0 万人死于恶性肿瘤， 对人民健康的威胁日益突出。随着人类基因组计划的完成和分子生物 学的快速发展，肿瘤发生机制正在逐步被阐明。 在已知的肿瘤病因中，肿瘤的发生都伴有先天家族性遗传或后天由于 一些致癌因素如病毒、离子辐射、化学致癌剂等引起的基因突变。这 ， 些相关基因常与细胞增殖、分化、凋亡等基本生命活动有关，它们的 异常表达将引发体细胞突变从而造成功能变化。不同基因座上的遗传 性或体细胞获得性突变积累的结果，促使具有有侵袭性能的细胞克隆 导致肿瘤的发生。极大多数肿瘤的基因突变发生在体细胞，即只出现 在患者的癌细胞中。但大约1 的肿瘤发生在有明确遗传性癌综合 征( h e r d i t a r yc a n c e rs y n d r o m e ，h c s ) 的个体，这些个体中每个细胞 都有携癌易感基因的生殖细胞系突变( g e r m l i n em u t a t i o n ) 。目前已发 现的引发h c s 的相关癌基因及其症状见表1 1 。h c s 虽然并不多， 但在生物学上却很重要，通过对这些特殊综合征的研究，不仅对遗传 性肿瘤的分子起源和发病机理提供了理论仍据，也为一般散发性肿瘤 。的发生机制提供了分子基础。散发性肿瘤的体细胞突变( s o m a t i c m u t a t i o n ) 常累及癌症易感基因，它们在正常细胞生长的控制中也起 作用，因此研究h c s 为阐明一些由突变癌症易感基因编码的蛋白质 所破坏的细胞信号途径提供了新的信息和指导策略。 硕士学位论文 表卜1已发现的引发h c s 的相关癌基因及其症状 综合症 原发及有关肿瘤或其他特征i 染色体定位i 基因 l 基因产物功能 由显性方式遗传自争综合症 家族性视网膜母 细胞瘤( 髓) l if r a u m c n i 综合症 家族性腺瘤性 息肉病( f a j p 遗传性非息肉病性 结直肠癌 ( h n p c c ) 神经纤维瘤病l 型 ( n f l ) 神经纤维瘤病i i 型 ( n f 2 ) 肾母细胞瘤( w i l r n s ) w i e d m a n n b e c k - w i t h 综合症 痔样基底细胞癌 综合征( n b c c s ) 骨和软组织肉癯、 自血病、脑瘤 肉瘤、乳腺癌、脑瘤、自血病、 肾上腺皮质癌 结直肠癌、胃洱肿瘤c h r p e 、 颌骨瘤、带状瘤、髓母细胞瘤 结直肠癌、子宫内膜癌、 肝胆泌尿道癌、 胶质母细胞瘤 神经纤维瘤、脑瘤 神经纤维肉瘤a m l 听神经瘤、脑膜瘤、脑胶质瘤、 室管膜瘤 w i l m s 瘤，器官或半身肥大、 肝母细胞瘤、肾上腺皮质瘸 基底细胞癌、卵巢纤维瘤、 皮肤癌、颌骨囊肿、掌跖凹陷、 髓母细胞瘤、 1 3 q 1 4 3 1 7 1 , 1 3 1 2 p 2 1 2 2 ， 3 p 2 1 3 ， 2 p 3 2 , 7 p 2 2 1 7 q 1 1 2 2 2 q 1 2 2 l l p l 3 l l p l 5 l 璩l p s 3 a p c m s h 2 , m l h i ， p m s l , p m s 2 ， m s h 6 n f l n f 2 w 1 r 2 ，w t 3 ， p 5 7 ，k i p 2 调节细胞周期、转录， 结合f 2 f 转录因子，d n a 损伤 应答。调控细胞凋亡 调节1 3 连环蛋白， 结合微管 d n a 错配修复 p 2 i m s 的g a p 蛋白质 膜蛋白与 细胞骨架连接 抑制转录 调节细胞周期 h h 信号分子的 透膜受体 2 人类肿瘤发生候选基因翻跚的克隆及其相互作用蛋白 家族性乳腺癌1乳腺癌、卵巢癌 1 7 1 ) 2 1 b r c a l 与r a d 5 1 相互作用，修 复双链d n a 断裂 家族性乳腺癌2乳腺癌、胰腺癌 1 3 q 1 2 b r c a 2 同b r c a i 功能 v o nh i p p e l - l i n d a u 肾透明细胞瘤、嗜铬细胞瘤、3 p 2 5 - p 2 6 v h l 结合r n a 多聚酶l l ( v h l ) 综合症视网膜血管瘤、眼和脑血管细调节转录的延伸 胞瘤、肾和胰囊肿 遗传性乳头状肾癌乳头状肾癌 7 p 3 1 m e t 肝细胞生长因子 ( 肿l 配) ( h g f ) 的透膜受体 家族性黑素瘤 黑素瘤、胰腺瘤、异型增生症、9 p 2 1 p 1 6 ( c d k n 2 )c d k 4 和c d k 6 抑制物 非典型性黑痣 1 2 q 1 4 c d k 4 周期索依赖酶 1 p 3 6 c 删l 多发性内分泌肿痛i胰岛细胞瘤、甲状腺增生、 l l q l 3 m e n l 转录产物“m e n i n ” 、 型( m e n l )垂体腺瘤功能未明 多发性内分泌肿瘤i ii i a 型：髓样甲状腺癌、 l o q l l 2 r e t g d l w 的透膜受体 型( m e n 2 )嗜铬细胞瘤、甲状旁腺增生酪氨酸激酶 l i b 型：嗜铬细胞瘤、f m t i c 、 粘膜错构瘤 多发性错构瘤综合肠错构瘤性息肉、乳腺癌、l o q 2 3 3p 麟与张力蛋白相似的双 症( c o w - d e n 病)甲状腺癌、皮肤粘膜毛膜瘤( m m c a l ) 重特异性磷酸酶 家族性胃癌 胃腺癌 1 6 q 2 2 1 c d h l e 钙粘附蛋白 家族性副神经节瘤副神经节瘤、颈动脉瘤、 1 1 q 2 3 p g l未明 嗜铬细胞瘤 o e u t z - j e g n e r 缩合症胃肠错构瘤、乳腺癌、1 9 p 1 3 3 s t k l l 丝氨酸苏氨酸激酶 宫颈癌、卵巢癌 家族性肾细胞瘤 乳头状肾细胞癌 7 q 3 1 1 3 4 m e th g f ，s f 3 硕士学位论文 t ( x ：1 )仃e 3 p r c c 结节性硬化室管膜下巨细胞星形细胞瘤、9 q s 4 t s c lh a m a r t i n 面部血管瘤、 ) 6 p 1 3 3 t s c 2 t u b c r l i n ，与g a p 3 同 肾癌、心脏横纹肌瘤源，具r a p l g a p 活性 由隐性方式遗传的综合症 毛细血管扩张共济淋巴瘤、免疫缺陷、乳腺癌1 1 q 2 2删d n a 修复，诱导p s 3 失调( a l t ) 蝴蝶状红斑综合症白血病、淋巴瘤、免疫缺陷 1 5 q 2 6 1 b l m d n a 解旋酶 色素性干皮病皮肤癌、脑瘤、肺癌、胃癌、 9 p 3 4 1 ，x p - a ， d n a 修复解旋酶，核 ( x p ) 白血病皮肤对光敏感、2 q 2 1 ，x p - b ，营酸修复，对紫外线照 色素化异常、毛细血管扩张、 3 p 2 5 1 ，x f - c , 射弓i 起的d n a 嘧啶二 性腺发育不全、神经系统异常 1 9 q 1 3 2 ， x p - d 聚体的切除修复 身材矮小、头颅小、早老、 l l p l 2 - p l l ， x p - e ， 眼结膜乳头状瘤、血管瘤、 1 6 p 1 3 2 1 3 i x p f 唇表皮瘤、角化束皮瘤 1 3 q 3 2 - q 3 3 x p g 先天性再生不良性全血细胞减少、肝癌、食管癌、 9 q 2 2 3 f a c d n a 修复 贫血( f a n c o n i 贫血) 头颈部鳞癌、宫颈癌、 1 6 q 2 4 3 f a a 阴部及肛门鳞癌 3 p 2 6 - p 2 5 f a - d w c n c r 综合症软组织肉瘤、黑色素瘤、 s p l 2 - p 1 1 2 w r n d n a 解旋酶 骨肉瘤、甲状腺瘤、胃癌、 乳腺癌、肝癌、脑膜瘤 遗传方式未定的综合症 家族性霍奇金病霍奇金淋巴瘤 6 p m h c 家族性睾丸癌 精原细胞癌、性细胞瘤 1 2 q 2 2 未明 4 人类肿瘤发生候选基因l a s s 5 的克隆及其相互作用蛋白 1 1 肿瘤发生的相关基因 肿瘤的发生涉及一系列基因如原癌基因、抑癌基因、转录调控因 子、激素受体等的功能活动。因此，肿瘤发生机制有着其更深层次的 分子基础，如基因突变或调节紊乱等。现在很多癌基因和抑癌基因已 被发现并进行了深入研究，如c m y c ，c - f 0 8 、p 5 3 、r b 、n f 2 等，它们 大都参与正常细胞的生命活动，具有持家基因的特征。此外，还有大 量的肿瘤相关或者候选相关基因尚未得到鉴定。 细胞的生长是推动细胞周期进行的基因产物与抑制其进行的基 因产物之间微妙平衡的结果。癌的生成是一个涉及多种癌基因活化和 抑癌基因失活的多步骤累积变化的过程。这些基因的过度激活或缺失 零 或失活会引起相关信号途径的信号转导异常，导致细胞增殖的调控失 衡，最终决定癌细胞的产生。 1 1 1 原癌基因 ；： j 癌基因是指其编码的产物与细胞的肿瘤性转化有关的基因，可以 分为两大类：病毒癌基因和细胞癌基因。早在1 9 7 2 年b i s h o p 就证 实，几乎所有的高等脊椎动物细胞基因组中都拥有细胞癌基因 ( c e l l u l a ro n c o g e n e ，c o n c ) 。原癌基因( p r o t o o n e ) 是指尚未被激 活，不具有致癌作用的细胞癌基因。它们具有正常的生理功能同时又 具有潜在致癌能力，当其被活化后能诱导细胞的异常增殖和肿瘤发 生。原癌基因在正常细胞基因组中都存在，它们在进化过程上高度保 守，属于看家基因( h o u s e k e e p i n gg e n e s ) 。原癌基因正向调节细胞生 长，基因的结构发生异常或表达失控将会使细胞无限增殖和分化异常 硕士学位论文 导致肿瘤形成。在正常情况下，原癌基因处于静止或低表达状态，对 机体无害且对于维持细胞的正常功能具有重要作用。但在射线、化学 致癌剂或逆转录病毒诱导作用下，这些基因则可能发生点突变、易位、 基因重排等变异，从而改变表达蛋白的氨基酸组成，造成蛋白质结构 的变异。如h r a s 中密码子1 2 从g g c ( 甘氨酸) 突变为g t c ( 缬 氨酸 ，使细胞发生转化而诱发肿瘤。不同的原癌基因在不同的情况 下可通过不同的途径被激活，其结果可以是：( 1 ) 出现新的表达产物， 即原来不表达的基因开始表达，或不应该在这个时期表达的基因进行 表达；( 2 ) 出现过量的正常表达产物；( 3 ) 出现异常、截短的表达产 物。以上异常情况，在肿瘤细胞中可以出现一种或二种以上的组合。 1 1 2 抑癌基因 抑癌基因对细胞起生长负调节作用，能抑制细胞恶性生长。如果 抑癌基因发生突变，失去了细胞增生的阴性调节因素，细胞就会发生 瘤性转化和异常增生f 1 1 。 t 1 2 1r b 基因 位于染色体1 3 q 1 4 的r 6 基因是第一个被发现和鉴定的抑癌基 因。细胞遗传学研究显示，在某些视网膜母细胞瘤患者的细胞中有染 色体1 3 q 1 4 的缺失，提示缺失肋基因可能导致肿瘤的发生。后来在成 人的某些常见肿瘤，如膀胱癌、乳腺癌及肺癌中也发现它的丧失或失 活。r b 基因编码一个分子量为1 0 5 1 0 7 k d 的核磷酸蛋白，该蛋白 具有调节细胞内d n a 合成的功能。 r b 基因作为一种参与细胞周期转录调控的因子，在g 1 s 期转换 人类肿瘤发生候选基因l a s s 5 的克隆及其相互作用蛋白 中起着关键的作用，其肿瘤抑制功能与基因表达调控细胞生长作用之 间存在着直接的联系。多种病毒癌基因编码的蛋白质可结合和( 或) 灭活宿主的抑癌基因蛋i 兰t r b ，导致细胞分裂和增殖失控。! z h s v 4 0 病 毒的t 抗原、腺病毒e 1 a 署i i e l b 及乳头状瘤病毒的e 6 春i e 7 等基因蛋 白质，它们的转化作用都是通过干扰尺6 的活性而使细胞周期的调节改 变所致。肋与c m y c 可发生复合作用：c - m y c 基因蛋白可结合r 1 5 i 蛋 ， 白c 端序列，并与s v 4 0 的t 抗原、腺病毒e 1 a 及乳头状瘤病毒e 7 等 蛋白相竞争。非磷酸化的r 6 可结合至转录因子e 2 f d n a 复合物上， 在启动子上阻止其本身m r n a 的转录以及c - m y c 在g l 期的表达；同 时又可活化转录因子a f 2 促进细胞分裂抑制因子的转录【2 1 。当r 6 磷爹 酸化时，e 2 f 转录因子被释放，使c - m y c 活化与r 6 结合。p 1 6 基因 又称m t s l 或c d k n 2 ，能够抑制c d k 4 c d k 6 介导的r b 基因蛋白产 物的磷酸化。在g l 期，c y c l i n d c d k 4 复合物具有激酶活性，促进 哮 r b 磷酸化；而p 1 6 与c y c l i n d 竞争结合c d k 4 ，从而抑s u r b 磷酸化， 阻止细胞从g 1 期进入s 期，p 1 6 失活将导致细胞的过度增值【3 1 。 1 1 2 2p 5 3 基因 p 5 3 是第二个被鉴定的抑癌基因，其突变是导致人类肿瘤发生的 最常见的分子改变。p 5 3 基因位于染色体1 7 p 1 3 ，编码一个分子量为 5 3 k d 的核蛋白。野生型p 基因参与调控细胞周期，致死突变因子 引起的d n a 破坏可迅速诱导p ”，其活性可能通过磷酸化调节【4 】。体 外发现p 在s 期可被p 3 4 础激酶矛n c k i i 磷酸化。p 5 3 产物能阻滞细 胞周期于g 1 期，并结合增殖细胞核抗株( p c n a ) 而抑制d n a 复制， 硕士学位论文 使破坏的d n a 在复制之前有修复的时剐5 1 。如果无法抑制，它还可 以引起细胞凋亡，清除携带有突变的细胞【6 1 。p 5 3 可以相互结合形成 寡聚体( 可能是四聚体) ，该寡聚体能与一段d n a 序列结合而起转录 调控作用。p 5 3 在转录水平上可以正向调节m d m - 2 基因，促进其转 录；而m d m - 2 贝吐能结g p s s 使其失活，形成自我调节反馈途径。故 m d m - 2 能抑制野生型p ”的反式激活功能使细胞发生癌变。突变型 p 5 3 会干扰野生型p ”活性，与其结合后抑制其正常功能( 显性抑制 作用) ，与癌基因m d m - 2 蛋白产物一起抑制野生型p 的抗癌活性。 此外，突变型p 丧失了d n a 破坏后细胞周期停顿的能力，导致突变 频率的增加及细胞基因组的不稳定同。缺y _ p 5 s 的肿瘤细胞不能凋 亡，维持了肿瘤细胞的生存，也增加了对化疗药物和放射治疗的耐药 性和抵抗性。 p 5 3 基因与多种恶性肿瘤发生有关。l i f r a u m e n i 综合征( l f s ) 是常染色体显性遗传病，其家族成员有种系细胞中i 拊p 5 3 突变。患者 年轻时就会发生骨肉瘤，其亲属可发生肾上腺皮质癌、乳腺及脑肿瘤 等许多类型的恶生肿瘤。在m d a m b 2 3 1 乳腺癌细胞系中，突变p 5 3 呈现高水平表达，且由高活性的磷脂酶d ( p l d ) 来维持其表达稳定， 从而抑制癌细胞的凋亡【孙。此外，多种散发性肿瘤如脑瘤、肺癌、胃 癌等也涉) f z p 5 3 基因，常表现为一侧1 7 p 等位基因缺失 6 1 ，另一侧含 有突变。即使双侧1 7 p 等位基因都无缺失者，也可检出突变。这些突 变集中在4 个“热点”，分别为密码子第1 3 2 1 4 3 位、第1 7 4 1 7 9 位、 第2 3 6 位2 4 8 位和第2 7 2 位2 8 1 位，这4 个区段恰好是p 5 3 基因的 人类肿瘤发生候选基因l a s s 5 的克隆及其相互作用蛋白 高度保守部位。研究表明p 5 3 基因缺失或突变可能在肿瘤发生中有重 要作用【9 1 。 1 1 2 3 刀j 基因 户2 j 7 基因位于染色体6 p 2 1 ，编码的蛋白分子量为2 1 k d 。p 2 j 基 因属于依赖周期蛋白激酶抑制剂( c k i ) q b c i p k i p 家族的一员，负向 调节依赖周期蛋白激酶( c d k ) 的活性。当它与c d k - c y c l i n 复合物结 合后抑制其活性，阻滞细胞周期g 1 期和g 2 期从而维持基因组稳定 性【1 0 1 。然而，心j 和1 p 2 7 又能帮助c y c l i nd ( 周期蛋白d ) j g l c d k 复 合物的形成，激发c d k 4 6 c y c l i nd 的活性【n 】。许多原癌基因和抑癌基 因( 乃3 和r b ) 都能被c d k 磷酸化。r b 被c d k 磷酸化而失活，失 去抑制肿瘤的能力。尸2 j 通过抑制c d k 的活性而抑制r b 的磷酸化， 阻止细胞周期进行。p 5 3 正向调节刀j ，p 5 3 的失活使凹j 表达缺失 造成c d k 的活性失控，导致细胞周期的失控。t g f i b l 、n 师q 、p t e n 、 i g f 等因子均可诱勖2 ，基因表达增高，而e 1 a 、c - j u n 、t b x 2 、p l d l 署h p l d 2 等因子则抑带o p 2 1 基因表达。p 2 1 基因的异常表达对前列腺 癌、肠癌等的发生具有重要的促进作用。 1 1 2 4n f 2 基因 恶性肿瘤转移是肿瘤患者死亡的主要原因，而肿瘤转移是个多基 因参与的过程。目前认为，肿瘤细胞转移基因的激活和转移抑制基因 失活和或丢失可诱发肿瘤细胞转移表型而导致转移的发生；另外许 多正常的细胞基因如i v 型胶原蛋白酶、识别细胞外基质的某些整合蛋 白、转移因子及其受体、各种生长因子及其受体女o b f g f 等的过度表 硕士学位论文 达，使得细胞更具粘附性、侵润性、运动性及繁殖能力。原发部位肿 瘤组织中具有转移潜性的细胞群是肿瘤转移的细胞生物学基础。 朋眩基因位于染色体2 2 q 1 2 ，其编码产物m e r l i n 为6 6 k d 的细胞 骨架相关蛋白，与其它骨架相关蛋白m o e s i n 、e z r i n 、r a d i x i n 具有同 源性，介导细胞骨架白a c t i ns t r e s sf i b e r s 、k e r a t o h y a l i n 、g r a n u l e s 1 2 】 与细胞膜连接，参与细胞骨架信号传导调节及细胞间接触，提示朋叼 与肿瘤转移有关。n f 2 是一种罕见的以脊骨和大脑多发肿瘤为特征 的遗传病。m c c l a t c h e y 和她的研究伙伴通过建立野生n f e 基因缺失 小鼠品系来比较n f e 突变小鼠和正常小鼠的同型细胞以识别基因功 能，并以小鼠模型来探讨人类间皮瘤发生的分子机制【1 3 】。研究发现， - 虽然n f e 缺失细胞看上去完全正常也正常增殖，但它们在培养皿中与 其它细胞接触时无法停止增殖。正常细胞当充满培养皿时就会停止生 长，脚缺失细胞仍然不停地增殖，说明它们不能感知与其它细胞 的接触。明缺失细胞缺少个粘连交叉点( a d h e r e n sj u n c t i o n s ) ，该 细胞结构位于细胞膜上，与毗邻细胞相连，在细胞通讯中起着关键作 用。当把正常m e r l i n 蛋白添加到肥缺失细胞培养物中，粘连交叉点 的形成和对依赖接触的细胞生长的抑制都得到恢复。虽然m e r l i n 与细 胞骨架相连，但其正常情况下是加强粘连交叉点的一部分。交叉点完 整性的丧失与肿瘤发育和肿瘤侵入有关，这为n f e 突变小鼠中转移癌 细胞的快速发育提供了一个解释【1 4 1 。n f 2 的突变在神经鞘瘤、听神 经瘤、脑膜瘤等多种肿瘤发生中起着广泛的作用，对其的功能阐明是 进一步研究肿瘤细胞诱发和转移的分子基础【1 5 1 。 人类肿瘤发生候选基因l a s s 5 的克隆及其相互作用蛋白 1 1 3 转录因子 生物有机体在其分化发育过程以及对外环境所表现的各种生理 活动中，多种相关基因有条不紊地表达起着重要作用。特异基因在时 间上和空间上的表达调控是生物学上的一个中心问题，转录因子在这 个过程中发挥着关键的作用，这些蛋白通过与结构基因的顺式作用元 件结合来调节转录过程，是结构基因转录过程中的“调节器”。近几年 来越来越多的转录因子及其结合区被人们所认识。转录因子对肿瘤发 生起着重要作用【1 6 1 。与肿瘤发生相关的转录因子很多，包括编码碱性 螺旋环螺旋( b h l h ) 结构、同源框结构、半胱氨酸富集锌指结构、 r e l 结构的蛋白及甲状腺素类固醇激素受体等，这些转录因子受累 常引起白血病发生。某些癌基因表达蛋白( 如m y c 、f o s 等) 定位于细 胞核内，它们能与靶基因的调控元件结合直接调节转录活性起转录因 子作用。这些蛋白通常在细胞受到生长因子刺激时迅速表达，促进细 胞的生长与分裂过程。 1 1 3 1c - m y c 基因 c m y c 基因是m y c 基因家族的重要成员之，定位于染色体 8 q 2 4 ，产物为6 2k d 的核蛋白。c m y c 基因参予细胞凋亡，与多种肿 瘤的发生有关。c - m y c 的表达变化与细胞的增殖及分化状态有关，其 表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥作用。c m y c 基因 表达的失控是多种细胞发生凋亡的主要原因，细胞发生凋亡的速度及 其对诱导因素的敏感性均依赖于细胞m y c 蛋白的含量。尚未成熟胸 腺细胞中c m y c 基因的高表达是胚胎胸腺细胞凋亡的诱因，而且在凋 硕士学位论文 亡细胞中也观察n c m y c 基因的高水平表达。如果用反义寡核苷酸阻 断c m y c 基因的表达，则细胞凋亡受到严重干扰。e v a n 研究发现， c m y c 的表达失调也会启动去除生长因子后培养细胞的成熟前凋亡。 他们对小鼠i l 3 依赖性髓样细胞素3 2 d 进行观察，发现在洗去i l 3 后，可立即观察至惦m y c 基因表达下调使培养细胞停止于g l 期。将 携带c m y c 基因的载体转染3 2 d 细胞获得稳定表达c m y c 基因的 3 2 d 细胞克隆，在细胞去除h 3 后，不停止于g 1 期，而是启动以凋 零为特征的程序性细胞死亡。结果揭示细胞凋零是清除固定突变及细， 胞周期调控失衡的细胞的重要机制，一旦细胞发生障碍，c m y c 基因 就会启动凋亡程序；相反，则导致肿瘤形成【1 7 1 。c m y c 基因主要通过 扩增和染色体易位重排的方式激活，对组织肿瘤的发生有着重要作 用。在不同的人体肿瘤细胞系中，包括粒细胞性白血病细胞系、视网 膜母细胞瘤细胞系、神经母细胞病细胞系、人结肠癌细胞系、乳腺癌 细胞系及肺癌细胞系，已发现c m y c 或与其相关序列的扩增【m 。c - m y c 基因在成骨肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤中也发 现有扩增现象，当扩增达到3 0 倍时，染色体上表现h s r 和d m s ，而 且c m y c 过量表达与肿瘤的早期复发有关【1 9 】。在肿瘤形成过程中，发 现m s 与m y c 、s i s 与m y c 、m y c - 与f o s 偶联激活以协同致瘤f 斟。 c m y c 蛋白在结构上可分为转录激活区、非特异d n a 结合区、 核靶序列、碱性区、螺旋环螺旋及亮氨酸拉链区，在已知的转录因 子中可介导蛋白的寡聚化，这两个区同时存在是c m y c 蛋白所特有 的。以原核生物为实验对象的研究表明，碱性区以一个自由环存在， 人类肿瘤发生候选基因l a s s 5 的克隆及其相互作用蛋白 当以特殊方式结合至u d n a 上时，则变成螺旋，该区是c m y c 蛋白与 d n a 特异序列的结合部位。c m y c 中的亮氨酸拉链区是抑制细胞分化 及肿瘤转化所必需的区域。s m i t h 等研究发现该区介导各种转录因子 的二聚作用，在亮氨酸重复部位的突变能显蓍降低c m y c 抑制鼠红 白血病( m e l ) 细胞分化能力；同样地，此区的插入突变能消除c m y c 的转化活性，阻止细胞进入细胞周期，从而抑制许多细胞系的分化【2 1 1 。 对c - m y c 亮氨酸拉链区的亮氨酸进行致死突变，发现这些突变不能 自身抑制，说明了亮氨酸拉链区在自身抑制中的重要性。研究发现， c m y c 分子的中间1 3 以及n 端、c 端是肿瘤转化所必需的，是 c - m y c 基因与肿瘤转化有关的c m y c 区段。这些功能区域的存在，使 擎 c m y c 在胞浆内合成后与其它蛋白形成寡聚体，再转移到核内结合到 特异性的d n a 序列上，从而激活和抑制许多靶基因的转录，引起细 胞生长和分化的改变，发挥其生理调节功能及恶性转化作用【2 2 】。 鼍 1 1 3 2c - f o s 基因 c f o s 基因属于即刻早期基因( i e g ) ，可被第二信使所诱导。c f o s 基因定位于染色体1 4 q 2 1 3 1 ，编码分子量为5 5 k d 的核内磷酸化蛋 白，可与d n a 结合。与c m y c 相似，c f o s 蛋白结构包括三大功能 区：碱性d n a 结合区、亮氨酸拉链区和c 端转录调节区。c f o s 基因及 其蛋白产物参与细胞的正常生长、分化过程以及细胞内信息传递和细 胞的能量代谢过程，在生命活动中起着重要的作用。c f o s 是真核细 胞转录调控因子，可以磷酸化对应的苏氨酸和谷氨酸，其本身不能形 成二聚体，无法与d n a 结合。但f o s 可以与j u n 通过l z 途径形成异 1 3 硕士学位论文 源二聚体的核蛋白复合物，以高亲和力结合在靶基因的d n a 相关序 列即a p 1 结合区与其相互作用，影响靶基因的表达，参与信号传导 使细胞增殖。c f o s 基因的表达与细胞生长、分化有着密切关系。研 究资料显示，c f o s 能使细胞由g o 期启动进入细胞周期。在细胞周 期中，细胞周期蛋白( c y c l i n ) 与相应的c d k 结合，并经磷酸化脱 磷酸化修饰后活化，促使与周期有关的蛋白基因女i f o s 等l e g s 表 达，从而决定细胞周期的进程，c f o s 同时正负调控细胞周期的各个 阶段。f o s 基因及其蛋白产物的异常表达或突变，会直接干扰细胞周 期诱发细胞恶变或在细胞周期的不同时期诱发细胞凋亡。还有研究表 明，神经细胞对外界刺激的应答依赖c f o s 等基因的表达。神经元兴 奋可引起一系歹l 协调反应，刺激引起的一连串生物化学与生物物理事 件，显示出特殊细胞的神经生理表型。而短暂的刺激与长期的表型变 化有着一定的联系，这其中必然存在着_ 种或多种机制将细胞表面束| j 激与神经元转录调节装置偶联起来，从而对细胞分化和可塑性起作用 【2 舢。它们的即行表达在细胞膜受l ! l j i i 激开始，到细胞表型发生改变为 止。c - f o s 可被多种刺激诱导表达，包括：甘油脂依赖的蛋白激酶 c ( p k c ) 、c a m p 和钙调蛋白、有丝分裂原、与神经兴奋有关的刺激、 电生理刺激、血浆多肽以及生长因子等。与c m y c 蛋白类似，c f o s 蛋 白结构包括三大功能区：碱性d n a 结合区、亮氨酸拉链区和c 端转录调 节区。 1 1 3 3h o x 基因 同源框基因与肿瘤发生的关系已经受到重视。同源框基因家族起 1 4 人类肿瘤发生候选基因l a s s 5 的克隆及其相互作用蛋白 初被认为在昆虫阶段发育中起重要作用，目前在哺乳类动物，包括人 类都发现含同源框结构域蛋白质，它们在机体发育过程中起重要作 用。同源框基因所编码的蛋白质是转录因子，通过螺旋转角螺旋 ( h l h ) 模式与启动子或增强子序列结合