（遗传学专业论文）functional+analysis+of+a+cc+chemokine+receptor+5+mutant.pdf

摘要 c c 类趋化因子受体5 ( c c r 5 ) 属于g 蛋白偶联的受体家族，也是巨噬细胞 趋向性的h i v 1 病毒的辅助受体之一。作者在研究c c r 5 和免疫缺陷的相关性 的过程中，在中国人群里发现了一个单核苷酸缺失的突变，c c r 5 8 9 3 ( - ) 。该突 变在第8 9 3 号密码处缺失一个核苷酸( t ) ，导致基因翻译提前终止，其产物缺 失整个c 末端的胞内区域。为了检测这种c 末端的缺失是否会对蛋白质在膜上 的表达及由其介导的信号传导产生影响，作者构建了几种表达质粒。流式细胞 分析和共聚焦显微技术都观测到突变的c c r 5 在细胞膜上的表达水平相对于正 常的c c r 5 有显著的降低，而胞内的c c r 5 8 9 3 ( 一) 水平则和正常的相当。在2 m g l 4 植物凝集素( p h y t o h e m a g g l u t i n i n ，p h a ) 的诱导下，突变的c c r 5 在细胞 膜上的表达水平有所恢复。但无论对突变的c c r 5 8 9 3 ( ) 还是正常的c c r 5 ， p h a 都不影响其胞内的水平。此外c c r 5 8 9 3 ( - ) 丧失了胞内信号传导的能力， p h a 的诱导也无法恢复这一功能。这些研究说明，突变影响了受体的向膜运输 和信号传导；并且在p h a 的存在下，某些受p h a 诱导的因子参与了c 末端缺 失的蛋白质向膜运输的过程。 关键词：c c r 5 ，c c r 5 。8 9 3 ( ) ，膜表达，p h a 诱导 a b s t r a c t c cc h e m o k i n er e c e p t o r5 ( c c r 5 ) i sam e m b e ro fg - p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r s ( g p c r ) s u p e r f a m i l ya n da c t s a sa i le s s e n t i a l c o r e c e p t o rf o rt h ec e l l u l a re n t r yo f m a c r o p h a g e t r o p i c h i v - 1 v i r u s e s c c r 5 8 9 3 ( - ) i s a s i n g l e - n u c l e o t i d e d e l e t i o n m u t a t i o na tc o d e8 9 3w h i c hw a ss c r e e n e di nc h i n e s ep o p u l a t i o n t h eg e n ep r o d u c t l a c k st h ee n t i r ec t e r m i n a lc y t o p l a s m i ct a i l t oa s s e s st h ee f f e c to ft h i st r u n c a t i o no n m e m b r a n e e x p r e s s i o no f t h i sp r o t e i na n ds i g n a lt r a n s d u c i n ga c t i v i t yr e s p o n d i n gt oi t s l i g a n d s ，e x p r e s s i o ns y s t e m sw e r e c o n s t r u c t e d f l o wc y t o m e t r i ca n a l y s e sa n dc o n f o c a l m i c r o s c o p yo b s e r v a t i o nr e v e a l e dt h a t s u r f a c el e v e l so fm u t a n tc c r 5w e r eg r e a t l y r e d u c e d ，w h i l ec y t o p l a m i cc c r 5 l e v e l so ft h em u t a n tc c r 5w e r ec o m p a r a b l et ot h a t o ft h ew i d et y p ec c r 5 u n d e rt h et r e a t m e n to f2m g l p h y t o h e m a g g l u t i n i n ( p h a ) ， t h ed e f e c t e ds u r f a c ep r e s e n t a t i o no fm u t a n tc c r 5w a sg r e a t l yr e c o v e r e d h o w e v e g t h e p r e s e n c e o fp h ai n d u c e m e n td i dn o ta f f e c tt o t a li n t r a c e l l u l a r e x p r e s s i o no f c c r 5 - 8 9 3 ( 一) a n dc c r 5 a n dt h ei m p a i r e di n t r a c e l l u l a rs i g n a l i n go fc c r 5 8 9 3 ( 一) c a u s e db yt h em u t a t i o nc o u l dn o tb er e c o v e r e db yp h ai n d u c e m e n t t h e s es u g g e s t e d t h a tt h em u t a t i o na f f e c t e di n t r a c e l l u l a rt r a n s p o r t a t i o na n ds i g n a l i n go fc c r 5 ，a n d t h e r ee x i s t e ds o m ep h a i n d u c e df a c t o r ( s ) t h a tc o u l dm e d i a t et h ep r e s e n t a t i o no ft h e t r u n c a t e dc c r 5 k e yw o r d s ：c c r 5 ，c c r 5 8 9 3 ( 一) ，m e m b r a n ee x p r e s s i o n ，p h ai n d u c e m e n t 2 i n t r o d u c t i o n t h ep a s tt e ny e a r sh a v ew i t n e s s e dt h er a p i dm e r g i n go fc h e m o k i n ea n d c h e m o k i n er e c e p t o rf i e l d s t h ed i s c o v e r i e so ft h e i rc r i t i c a lr o l ei nt h ed e f e n s ea g a i n s t i n f e c t i o n , m o u n t i n ga l li m m u n er e s p o n s ec a p a b l eo fc o n t r o l l i n ga n d o re l i m i n a t i n g t h e o f f e n d i n gp a t h o g e np r o p e l l e dt h e s ef i e l d si n t ot h el i m e l i g h t t h et e r m “c h e m o k i n e i san e o l o g i s ms h o r tf o r “c h e m o t a c t i c c y t o k i n e ”m o r e t h a n4 0c h e m o k i n e sh a v eb e e nd e s c r i b e dt od a t e t h e ya r eas u p e r f a m i l yo fs m a l l r e l a t e dp r o t e i nm o l e c u l e sr a n g i n gf r o m6t o1 4 k d at h a ts e c r e t e db yav a r i e t yo fc e l l s a n dt h a th a v e ，a m o n gt h e i rd i v e r s eb i o l o g i c a lp r o p e r t i e s ，t h ea b i l i t yt or e c r u i taw i d e r a n g eo fi m m u n ec e l l s ( n e u t r o p h i l s ，m o n o c y t e s ，a n dl y r n p h o c y t e s ) t ot h es i t e so f i n f e c t i o na n dd i s e a s e c h e m o k i n e sh a v eb e e nc l a s s i f i e di n t of o u rm a j o rg r o u p st h a t a r ed e t e r m i n e db yt h en u m b e ra n dp o s i t i o no ft h ec y s t e i n ea m i n o - t e r m i n a lr e s i d u e s ： c x c ，c c ，ca n dc x 3 cf a m i l i e s a c c o r d i n g l y , t h ec h e m o k i n er e c e p t o r sa r ed e f i n e db y t h e i ra b i l i t yt oi n d u c es i g n a l i n ga f t e rr e l e v a n tc h e m o k i n eb i n d i n g a tl e a s te i g h t e e n c h e m o k i n er e c e p t o r sh a v eb e e nc l o n e ds of a r t h e yc o n s t i t u t eas u p e r f a m i l yo fs e v e n t r a n s m e m b r a n eg - p r o t e i n - c o u p l e dr e c e p t o r s ( g p c r ) a n da l s oc l a s s i f i e di n t of o u r f a m i l i e sa c c o r d i n gt ot h e i rb i n d i n gl i g a n d s a l t h o u g he a c ho ft h e s er e c e p t o r sb i n d s o n l yas i n g l ec l a s so fe h e m o k i n e s ，t h e yc a l lb i n ds e v e r a lm e m b e r so ft h es a l n ec l a s s w i t hh i l g ha f f i n i t y s e v e r a lc h e m o k i n e sc a na l s ob i n da n da c t i v a t ean u m b e ro f c h e m o k i n er e c e p t o r s c h e m o k i n er e c e p t o r ss h a r eac o m m o n es t r u c t u r a lt h e m et h a tc o n s i s t so fa l l e x t r a c e l l u l a ra n i n o f n ) t e r m i n a ls e g m e n t ，s e v e nt r a n s m e m b r a n e ( t m ) a h e l i c a l s e g m e n t sf o r m i n gt h et mc o r e ，t h r e ee x t r a c e l l u l a rl o o p s ( e c l ) ，t h r e ei n t r a c e l l u l a r l o o p s ( i c l ) a n dac a r b o x y ( c ) t e r m i n a lc y t o p l a s m i cs e g m e n t ( f i g1 ) c h e m o k i n e r e c e p t o rb i n d i n gi n i t i a t e sac a s c a d eo fi n t r a c e l l u l a re v e n t st h a tc u l m i n a t ei nt h e e x p r e s s i o no fb i o l o g i c a le f f e c t s 1 】t h ef i r s ts t e pi i lt h i sc o m p l e xp r o c e s si st h e l i g a t i o no ft h er e c e p t o rb yi t sh i g ha f f i n i t yl i g a n d s e v e r a lm o d e so fl i g a n d r e c e p t o r i n t e r a c t i o n sh a v eb e e nd e s c r i b e dd e p e n d i n go nw h e t h e rl i g a n db i n d st ot h et m c o r e ， t ob o t hc o r ea n de c l s ，t oe c l sa n dt h en t e r m i n u s ，o re x c l u s i v e l yt ot h ent e r m i n a l 3 f i g 1 s t r u c t u r eo f ag - p r o t e i n - c o u p l e dn = 。叩仞ci tc o n s i s t so f a ne x t r a c e l l u l a rn - t e r m i n u s ，s o v e r l 臼a n 潮锄b l 黜l o o p s t h i n ee x t r a c e l l u t a rl o o p s , t h r e ei n l 您c e b r l a rl o o p sa n d ac - t e r m i n a l c y t o p l a m i cs e g m e n t d o m a m 2 ，3 ，4 】r e g a r d l e s so ft h ev a r i a b i l i t yo fl 蟾髓d sa n dl i g a n d r e c e p t o r i n t e r a c t i o n s ，ac o n l m o na n dc h a r a c t e r i s t i cf e a t u r eo fg p c r si st h e i ra b u i t yt oa c t i v a t e a s s o c i a t e dk t e r 0 妇盱i cg p r o m i n sa f t e rl i g a n db i n d i n g ( f i g2 、t h ec h a n g eo f c o n f o r m a t i o no fr e c e p t o rl e a d st oad i s s o c i a t i o no ft h eg p r o t e i n si n t oaa n d 聊 s u b u n i t s 。t h e s egp r o t e i ns u b u n i t sc 狮t h e na c t i v a t ev a r i o u se f f e 吐o re n z y m e s i n c l u d i n gp h o s p h o l i p a s e s w h i c hl e a d st oi n o s i t o lp h o s p h a t ep r o d u c t i o n , a ni n c r e a s ei n f i g 2 ab r i e f d e s c r i p t i o no f g p c r si n d u c e ds i g n a i n gp a t h w a y t h e 驯d e n o t e ss o m ek i n do f c h e m o k i n e s t h ee f f c t o rd e n o t e s “b 猡i y lc y c l a s ei nt h i si l l u s t r a t i o n 。b e s i d e s 她i tc o u l db e p h o s p h o f i p a s e s ，c a ”c h a n n e l s , k ? c l m n n e l s 4 i n 廿a c e l l u l a rc a 2 + a n da c t i v a t i o no fp r o t e i nk i n a s e s t h i ss i g n a lt r a n s d u c t i o nc a s c a d e l e a d st ot h ea c t i v a t i o nn o to r a yo fc h e m o t a x i sb ym o d u l a t i n ga d h e s i o np r o t e i n ，b u t a l s oo faw i d er a n g eo ff u n c t i o n si nd i f f e r e n tl e u k o c y t e ss u c ha sa ni n c r e a s ei nt h e r e s p i r a t i o r yb u r s t ，d e g r a n u l a t i o n ，p h a g o c y t o s i sa n dl i p i dm e d i a t o rs y n t h e s i s a si ti ss e e nt h a tc h e m o k i n e sb yv i r t u eo ft h e i ra b i l i t yt oo r c h e s t r a t et h ed i r e c t e d m i g r a t i o na n da c t i v a t i o no fl e u k o c y t e sp l a yam a j o rr o l ei n t h i si m m u n er e s p o n s e h o w e v e r , u n d e rc e r t a i nc i r c u m s t a n c e st h ei m m u n er e s p o n s ec a nb ei n a p p r o p r i a t e l y a c t i v a t e da n dt a r g e t e dt o w a r dn o r m a lh e a l t h yt i s s u el e a d i n gt oa u t o i m m t m i t ya n d d i s e a s e c h e m o k i n e sh a v e b e e ns h o w nt ob ea s s o c i a t e dw i t han u m b e ro f a u t o i n f l a m m a t o r y d i s e a s e i n c l u d i n gm u l t i p l es c l e r o s i s ，r h e u m a t o i da r t h r i t i s ， a t h e r o s c l e r o s i s ，a s t h m a ，o r g a nt r a n s p l a n tr e j e c t i o n ，e r e f u r t h e r m o r e , c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e sd e m o n s t r a t et h a tt h ec h e m o k i n er e c e p t o r sc a nb ee x p l o i t e db yi n t m c e l l u l a r p a t h o g e n sa sc e l le n t r ya n dd i s e a s et r a n s m i s s i o nf a c t o r s t h em o s ts t r i k i n ge x a m p l e s a r et h ep r o m i s c u o u sc h e m o k i n eb i n d i n gp r o t e i nd a r c ( d a f f ya n t i g e n ) w h i c hi su s e d a sap o r t a lo fe n t r yi n t oh u m a ne r y t h r o c y t e sb yt h em a l a r i a p a r a s i t ep l a s m o d i u m v i v a x , a n dt h ec h e m o k i n er e c e p t o r sc c r 5a n dc x c r 4w h i c ha r eu t i l i z e da s c o r e c e p t o r sb yt h eh i v - 1v i r u st op r o m o t ec e l l u l a rf u s i o na n di n f e c t i o nw h i c h c u l m i n a t e si nt h ed i s e a s ea i d s 5 ，6 】i na d d i t i o n , v i r u si n c l u d i n gm e m b e r so ft h e h e r p sa n dp o x v i r u sc l a s s ，h a v ep i r a t e dc h e m o k i n er e c e p t o r sf r o mt h e i rh o s t s p r e s u m a b l y t oh e l pt h e mo v e r c o m et h ei m m u n e r e s p o n s e 【7 ，8 】 c c r 5a n di t sr o l ei nv i r u st r a n s m i s s i o na n dd i s e a s ep r o g r e s s i o n c c r 5b e l o n g st ot h ec cc h e m o k i n er e c e p t o rf a m i l y h u m a nc c r 5g e n ei s l o c a t e da tc h r o m o s o m e3 p 21 3 i tc o n t a i n s4 e x o n s ，s p a n n i n ga p p r o x i m a t e l y6k b ，a n d o n l y2i n t r o n s t h e r ei sn oi i 1 1 1 0 1 1b e t w e e ne x o n2a n d3 e x o n4c o n t a i n st h ew h o l e c o d i n gr e g i o n ，i n c l u d i n gc o m p l e t e3 - p r i m eu t r , a n d11n u c l e o t i d e so ft h e5 - p r i m e u t r t r a n s c 却t sa r ei n i t i a t e df r o m2d i s t i n c tp r o m o t e r s ，b o t ho fw h i c ha r ea t - r i c h a n dl a c kc a n o n i c a lt a t ao rc a a tm o t i f s ：o n ei sa tu p s t r e a mo f e x o n1a n dt h eo t h e r b e t w e e ne x o n1a n d3 t h e r e g u l a t o r ys e q u e n c e sa n dn o n c o d i n ge x o n sa r e 5 p o l y m o r p h i c c o m p l e xa l t e r n a t i v es p l i c i n gp a t t e r n si n t h e5 - p r i m eu t ra n de x o n s g i v er i s et om u l t i p l ec c r 5t r a n s c r i p t s c c r 5w a s f i r s tc l o n e di n1 9 9 6 ，w h i c hw a s n a m e dh c h e m r l 3 9 t h eg e n ep r o d u c th a s3 5 2a m i n oa c i dr e s i d u e sa n db i n d s m t p 一1 诅( m a c r o p h a g ei n f l a m m a t o r yp r o t e i n - 1 ，m i p l pa n dr a n t e s ( r e g u l a t e db y a c t i v a t i o n , n o r m a lt c e l le x p r e s s e da n ds e c r e t e d ) 埘t l lh i 曲a f f i n i t y i nr e s p o n s et o t h o s el i g a n d s ，t h i sr e c e p t o rt r a n s d u c e ss i g n a l si nl e u k o c y t e st h a tr e s u l ti n t h e i r c h e m o t a x i st o w a r d sa r e a so fi n f l a m m a t i o n c c r 5e x p r e s s e so nav a r i e t yo fc e l lt y p e s ， i n c l u d i n gt h em o n o c y t e - m a c r o p h a g el i n e a g e ，d e n t r i t i cc e l l s ，l y m p h o c y t ep o p u l a t i o n s ， a n db r a i nm i c r o g l i a la n dv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e i l s c d 4h a sl o n gb e e ni d e n t i f i e da st h em a j o rr e c e p t o rf o rh i v i ti n t e r a c t sw i t l lt h e v i r a le n v e l o p eg l y c o p r o t e i nw i t hh i 啦a f f i n i t y h o w e v e r ，e x p r e s s i o no ft h ec d 4 g l y c o p r o t e i ni sn o ta l w a y ss u f f i c i e n tt op e r m i ti n f e c t i o n s o m eo t h e rm o l e c u l e sa r e i n d i s p e n s a b l ef o rv i r u se n t r y t h ed i s c o v e r yo fc c r 5a sac o r e c e p t o rf o rh i v - 1e n t r y w a sa c h i e v e db a s e do nt h ep h e n o m e n at h a tm i p l a ，m i p 一1 da n dr a n t e sc o u l d i n h i b i ti n f e c t i o nb ys e v e r a lp r i m a r ys t r a i n so fh i v - 1t h a tt a r g e tm a c r o p h a g e sa n d c d 矿t - h e l p e rc e l l s 【1 0 ，1 1 t h ed i c h o t o m yi nt r o p i s mt h a td i s t i n g u i s h e dv i r a ls t r a i n s a d a p t e df o rg r o w t hi nt r a n s f o r m e dt c e l l sf r o mt h o s em a i n t a i n e di np e r i p h e r a lb l o o d m o n o n u c l e a rc e l l sf t l r t h e ri n d i c a t e dt h ec h e m o k i n er e c e p t o r sp l a y e di m p o r t a n tr o l e si n c e l l - t y p es p e c i f i ct r o p i s m m a c r o p h a g et r o p i c ( r 5 ) s t r a i n s ，w h i c ha r ep r e d o m i n a n ti n t h ee a r l ys t a g e so fi n f e c t i o no fh i v - 1 u s ec c r 5a sa ne s s e n t i a l c o - r e c e p t o rf o r c e l l u l a re n t r y ，d u r i n ga i d sp r o g r e s s i o n ，t - c e l l - f i n et r o p i cv i r u so ( 4 ) s t r a i n se m e r g e a n du s ec h e m o k i n er e c e p t o r4 ( c x c r 4 ) a sac o - r e c e p t o r 【1 2 ，1 3 ，1 4 a l t h o u g ho t h e r m e m b e r so fg p c r f a m i l yh a v ea l s ob e e ns h o w nt os h e p h e r di nv a r i o u ss t r a i n so f v i r u s ，t h e s et w oc h e m o k i n er e c e p t o r sa r eg e n e r a l l yr e c o g n i z e da st h em o s ti m p o r t a n t f a c t o r si na i d s p r o g r e s s i o n t h ei n t e r a c t i o no f h i v sw i t hc c r 5r e q u i r e sp r i o rb i n d i n go f g p l 2 0t oc d 4 ( f i g 3 ) t h i sb i n d i n gi n d u c e sac o n f o r m a t i o n _ a ic h a n g et h a ti n c r e a s e st h ea f f i n i t yo f g p l 2 0 f o rc c r 5 i n t e r a c t i o no fg p l 2 0w i t hc c r 5e x t m c c l l u l a rd o m a i nf a c i l i t a t e st h e i n s e r t i o no fg p 4 1i nh o s tc e l lm e m b r a n e a sa c o n s e q u e n c e ，f u s i o no fv i r u sa n dh o s t c e l l so c c u r s ，a n dr e v e r s et r a n s c r i p t i o no fv i r u sm r n aa n di n t e g r a t i o na sa p r o v i m s 6 i n t ot h eh o s tg e n o m ef o l l o w 【1 5 ，1 6 f i g 3 h i vi n f e c t i o no f t a r g e tc e l l si sd e p e n d e n to nc d 4a n dc h o k i n er e c e p t o r s m a c r o p h a g e t r o p i cv i r u s e sb i n dt oc d 40 1 1t h es u r f a c eo ft a r g e tc e l l sv i at h e i re n v e l o p eg l y c o p r o t e i ng p l 2 0 e n t r yo f t h ev i i u si n t ot h ec e l l si st h e nd e p e n d e n to nt h ec c r 5 s i m i l a r l y , t - c e l l - l i n et r o p i cv i r u s e s b i n d t o c d 4a n d t h e n i n t e r a c t w i t h c x c r 4 n u m e r o u ss t u d i e sh a v em a p p e dr e g i o n so f c h e m o k i n er e c e p t o r sr e q u i r e df o rt h e i r f u n c t i o na s 卸【vc o r e c e p t o r s 1 7 t h eg e n e r a lc o n s e n s u si st h a ts e q u e n c ei nm u l t i p l e r e g i o n so ft h er e c e p t o r s ，i n c l u d i n gt h ent e r m i n u sa n dt h ee x t r a c e l l u l a rl o o p s ， c o n t r i b u t et ot h ei n t e r a c t i o nw i t he n v e l o p eg l y c o p r o t e i n s a s i g n i f i c a n tp r o p o r t i o no f h i v i n f e c t e dp a t i e n t sd e v e l o pn e u r o l o g i c a ld i s e a s e t h o u g ht h ep a t h o g e n i cm e c h a n i s mr e m a i n so b s c u r e ，c c r 5a n do t h e rr e c e p t o r sh a v e b e e np r o p o s e dt ob ei m p o r t a n tf o ri n f e c t i o no fm o n o e y t e - d e r i v e dm i c r o g l i a lc e l l s ， w h i c ht h o u g ht ot r a n s p o r tt h ev i n l si n t ot h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ( c n s ) a n de x p r e s s c d 4a sw e l la sc c r 5 t h e r ei sa l s os l r o n ge v i d e n c et h a ts o m ei - h v - 1c 眦i n f e c tb r a i n c a p i l l a r ye n d o t h e l i a lc e l l st h r o u g hac d 4 - i n d e p e n d e n tm e c h a n i s mw h i c hi n v o l v e s c c r 5 【1 8 t h e s es u g g e s ta na l t e r n a t er o u t ef o rd i s s e m i n a t i o no fn e u r o p a t h o g e n i c s t r a i n st ot h ec n sa n da l s or a i s et h e p o s s i b i l i t yt h a th i ve n v e l o p eg l y c o p r o t e i n sm a y i n t e r a c td i r e c t l yw i t hc h e m o k i n e r e c e p t o ri nt h eb r a i n c o u p l i n g o ft h er e c e p t o r st ot h eh e t e r o t r i m e f i cg p r o t e i n sa p p e a r st ob e d i s p e n s a b l ef o rt h ep r o c e s so fv i r a le n t r y , a ss h o w nb o t ht h r o u g ht h em eo fp e r t u s s i s t o x i nb l o c k a d ea n dt h r o u g hm u t a g e n e s i so ft h er e l e v a n t c y t o p l a s m i cd o m a i n s e q u e n c e si nc c r 5 h o w e v e r , b i n d i n go fe n v e l o p eg l y c o p r o t e i nt ot h er e c e p t o r sc a n m i m i cb i n d i n go f c h e m o k i n e s ，r e s u l t i n gi na c t i v a t i o no f t h eh e t e r o t r i m e r i cg p r o t e i n s ， 7 c a 2 + f l u x i n g ，a n dt y r o s i n ep h o s p h o r y l a t i o n 1 9 ，2 0 】 g e n e t i cv a r i a b i l i t yo f c c r 5a sc o r e c