（遗传学专业论文）一种耐热耐酸淀粉酶基因的定点饱和突变及酶学性质研究.pdf

摘要 淀粉酶在工业用酶领域的地位举足轻重，占据全世界约3 0 的酶产量。淀粉酶在 诸如食品、发酵、纺织、造纸、去垢剂、制药和制糖等众多工业领域有着广泛的用途。 耐热耐酸的a 淀粉酶因其在工业生产中的重要作用而引起了研究者的关注。 2 0 0 2 年，r i c h a r d s o n 等人从一类嗜热球菌属( t h e r m o c o c c u ss p ) 的古细菌中克隆 并重组得到了一个a 一淀粉酶基因b d 5 0 8 8 。这个人工重组酶的最适p h 为4 5 ，最适温度 为9 5 ，是一种耐热耐酸a 淀粉酶，具有潜在的工业应用价值。 b d 5 0 8 8 基因全长1 3 0 8 b p ，编码的蛋白质含4 3 6 个氨基酸。该基因已由本实验室合成， 并连接上表达载体p e t 3 0 a ，构建成重组质粒p e t 3 0 a b d 5 0 8 8 。 本实验的目的是构建a 淀粉酶b d 5 0 8 8 的随机点突变文库以进行体外分子进化及结 构和功能的研究。以p e t 3 0 a b d 5 0 8 8 为模板，设计含随机核苷酸序列的互补引物，分 别对b d 5 0 8 8 的3 1 ，9 8 ，1 2 4 ，1 2 5 ，1 5 0 和2 4 0 位氨基酸进行定点饱和突变，获得各单点随 机突变体库。将该突变体库转化入大肠杆菌b l 2 1 进行表达。筛选突变体测定其a 淀粉 酶活性。 经过对初步筛选出的1 5 个转化子的d n a 测序，在目标位点有1 3 个氨基酸序列发 生了突变。对其中7 个突变子进行了a 淀粉酶活性检测，2 个突变体的酶活低于亲本 b d 5 0 8 8 ，5 个突变体的酶活高于b d 5 0 8 8 。 本实验成功构建了b d 5 0 8 8 的6 个位点的随机点突变文库，该库不仅在一级结构上 具有良好的随机性和多样性，而且具有生物学活性的多样性，为a 淀粉酶b d 5 0 8 8 的定 向分子进化和结构与功能的深入研究打下了基础。 关键词：a 淀粉酶：定点饱和诱变；分子进化 a b s t r a c t a m y l a s e sc o n s t i t u t ea c l a s so fi n d u s t r i a le n z y m e sr e p r e s e n t i n ga p p r o x i m a t e l y3 0 o ft h e w o r l de n z y m ep r o d u c t i o n t h e yh a v ed i v e r s ea p p l i c a t i o n si naw i d ev a r i e t yo fi n d u s t r i e ss u c h a s f o o d ，f e r m e n t a t i o n ，t e x t i l e ，p a p e r , d e t e r g e n t ，p h a r m a c e u t i c a la n ds u g a r i n d u s t r i e s t h e r m o s t a b l ea - a m y l a s e sa r ev e r yi m p o r t a n tf o ri n d u s t r i a lu s e s i n2 0 0 2 ，r i c h a r d s o nc l o n e dt h eg e n e e n c o d i n ga a m y l a s e sf r o mt h e r m o c o c c u ss p t h e r e c o m b i n a n te n z y m eb d 5 0 8 8w a sa c t i v ea tap ho f4 5a n di t so p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s 9 5 。c ，w i t hp o t e n t i a li n d u s t r i a la p p l i c a t i o n s t h eg e n eo fb d 5 0 8 8 ，w h i c hi s1 3 0 8b p sa n de n c o d e sap r o t e i no f4 3 6a m i n oa c i d s ，h a s b e e ns y n t h e s i z e db yt h i sl a b a n dt h e ni tw a sc l o n e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 0 a c o n s t i t u t i n gr e c o m b i n a t i o nv e c t o rp e t 3 0 a b d 5 0 8 8 t h ep u r p o s eo fp r e s e n ts t u d yi st oc o n s t r u c tt h es i t e d i r e c t e dr a n d o mm u t a t i o nl i b r a r yo f b d 5 0 8 8f o ri nv i t r om o l e c u l a re v o l u t i o ns t u d y , a n dt os t u d yt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o n r e l a t i o n s h i p t h er a n d o mp o i n tm u t a t i o n sa tt h es i t e so f3 1 ，9 8 ，1 2 4 ，1 2 5 ，1 5 0 ，a n d2 4 0 w e r e i n d i v i d u a l l yg e n e r a t e db yp c ra m p l i f i c a t i o nw i t h t h er a n d o mn u c l e o t i d e p r i m e r s ，w i t h p e t 3 0 a - b d 5 0 8 8a st h et e m p l e t t h em u t a t i o nl i b r a r yw a st r a n s f o r m e da n de x p r e s s e di n e s c h e r i c h i ac o l is t r a i nb l 2 1 t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo fs o m eo ft h em u t a n t sw a st e s t e d s e q u e n c i n g1 5c l o n e s r e v e a l e d1 3a m i n oa c i dm u t a t i o n sa tt h es i t e s a m o n gt h e7 e x p r e s s e ds a m p l e su n d e r w e n tf o rt h eb i o a s s a y , 2s a m p l e sh a dl o w e ra c t i v i t yt h a nb d 5 0 8 8 ，5 s a m p l e sh a dh i g h e ra c t i v i t yt h a nb d 5 0 8 8 t h es i t e d i r e c t e dr a n d o mm u t a t i o nl i b r a r yo f b d 5 0 8 8h a sb e e nc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l ya n di sr e a d yf o r i nv i t r om o l e c u l a re v o l u t i o ns t u d y k e y w o r d ：a a m y l a s e ，s i t e s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s ，m o l e c u l a re v o l u t i o n n 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：储、删 日期：e 舶g 年5 月0 易e l 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允 许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：。磷、诗撕 日期：扣乃j 指导教师签名：动味 日期：4 伊。扩厶，d 第一部分文献综述 1 1q 一淀粉酶 1 1 1 淀粉酶概述 第一部分文献综述 淀粉是葡萄糖苷通过( i t 1 ，4 和( i t 1 ，6 葡萄糖苷键连接而成的高分子量聚合物质。它 包含直链淀粉和支链淀粉两种组分。淀粉在生物体内是作为能源和碳链骨架的来源，植 物和光合微生物如蓝藻等可直接利用光合作用合成糖并以淀粉的形式储存在体内，动物 和非光合微生物，如细菌，只能利用现成的淀粉【1 2 】。由于淀粉的复杂结构，细胞需要 用一系列的淀粉水解酶将其降解为小分子糖。 淀粉酶是水解淀粉和糖原的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。它 是最早用于工业生产并迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂之一【3 】。早在1 9 1 5 年法国 b o i d e n 等开始由枯草杆菌生产细菌淀粉酶，并在工业上用于纺织品退浆。1 9 5 9 年，日 本采用淀粉酶和糖化酶进行淀粉的液化和糖化，确定了酶法制造葡萄糖糖浆的工艺。 1 9 7 3 年高温淀粉酶投入生产【4 1 。 按照对淀粉水解方式的不同，可将淀粉酶分为四类：a 一淀粉酶、p 淀粉酶、葡萄糖淀 粉酶和异淀粉酶。 第一类0 【淀粉酶( e c 3 2 1 1 ) 以糖原或淀粉为底物从分子内部切开a 1 ，4 糖苷键而 使底物水解，其终产物为葡萄糖、还原糖、极限糊精和含四个以上葡萄糖残基的低聚糖。 第二类d 淀粉酶( e c 3 2 1 2 ) 从底物非还原性末端顺次水解每隔个a 1 ，4 糖苷键， 切下的是麦芽糖单位。 第三类葡萄糖淀粉酶( e c 3 2 1 - 3 ) 习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次 水解a 1 ，4 糖苷键和分支的a 1 ，6 键生成葡萄糖。 第四类解枝酶或异淀粉酶( e c 3 2 1 9 ) 只水解糖原或支链淀粉分支点a 1 ，6 糖苷键， 切下整个侧枝。 粮食中存在的淀粉酶主要是a 淀粉酶和p 淀粉酶，在焙烤食品中添加的淀粉酶主要 是a 一淀粉酶，在饲料中起作用的淀粉酶主要也是a 淀粉酶。 湖北大学硕士学位论文 1 1 2q 一淀粉酶简介 a 一淀粉酶，系统名称为o 【一1 ，4 一葡聚糖- 4 - 葡聚糖水解酶m 一1 ，4 g l u c a n - 4 g l u c a n o h y d d r o l a s ee c 3 2 1 1 ) 。它广泛分布于动物( 唾液、胰脏等) 、植物( 麦芽、山箭菜) 及微生物， 但大多数由微生物发酵产生。产a 一淀粉酶的微生物，原核微生物中有枯草杆菌、地衣芽 孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、黄单胞菌等；真核微生物中有米曲霉菌、黑曲霉、拟内孢 霉等1 5 1 。q 淀粉酶也可以从植物和动物中提取1 6 】。 a 淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，作用于淀粉时，随机地从淀粉分 子内部切开a 1 ，4 糖苷键，使淀粉水解而生成糊精和一些还原糖，所生成的产物末端葡 萄糖残基c 1 碳原子均为c t 构型，故称为q 淀粉酶。 依o 【淀粉酶水解产物的不同可将它们分为液化型和糖化型两种。液化型a 淀粉酶能 将淀粉快速液化，其终产物为寡聚糖和糊精。糖化型a 淀粉酶有较强的酶切活性，在水 解可溶性淀粉时，随水解时间的延长而产生寡聚糖、麦芽糖直至葡萄糖。按照a 淀粉酶 的适用条件可以分为中温型，高温型，耐酸耐碱型。按产生菌不同又可分为细菌、真菌、 植物和动物淀粉酶f 2 】。 a 淀粉酶通常在p h 5 5 8 0 稳定，大多数a 淀粉酶的最适温度是5 0 一6 0 ，分子量 范围是1 5 6 0 0 1 3 9 3 0 0 d a ，通常为4 5 0 0 0 6 0 0 0 0 d a l 2 1 。不同菌株产生的酶在耐热性，作用 的最适p h ，对淀粉的水解程度以及产物的性质均有差异。 反应温度和p h 对酶活力影响较大，不同来源的a 淀粉酶有各自的最适作用p h 和 最适作用温度，通常在最适作用p h 和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件 下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。因此，在工业应用中应了解不同 的酶最适p h 和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重 要的。 真菌和细菌类a 淀粉酶的最适p h 在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌a 一淀粉酶的最 适p h 为3 ，碱性a 淀粉酶的最适p h 在9 1 2 。另外，温度和钙离子对一些a 淀粉酶的最 适p h 有一定的影响，会改变其最适作用范围。不同微生物来源的仅淀粉酶的最适作用 温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有2 5 3 0 ，而最高的能达到1 0 0 c 1 3 0 c 。另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响【7 1 0 l 。 a 淀粉酶是一种金属酶，每个酶分子中含有至少一个钙离子( c a 2 + ) 。钙离子可使酶 分子保持适宜的空间构象，从而维持酶的活性并提高其稳定性【1 1 l 。钙离子与酶分子结合 2 第一部分文献综述 的牢固程度，依据酶的来源不同而有所差别，其顺序为霉菌 细菌 动物 植物。嗜热脂 肪芽抱杆菌与枯草杆菌a 淀粉酶在热稳定性上之所以不同，就是由于高温对钙离子的亲 合力不同【1 l 】。通常情况下，有c a 2 + 存在淀粉酶的稳定性比没有时要好，但也有报道伍淀粉 酶在c a 2 + 存在时会失活，而经e d t a 处理后却保留活性，另外，有报道称c a 2 + 对n 淀粉 酶没有影响【1 2 1 4 1 。 1 1 3q 一淀粉酶基因的结构特点 随着d n a 重组技术的发展，许多a 淀粉酶的基因陆续被克隆，通过对核苷酸序列 的测定和由此推定的氨基酸序列，结合x 线衍射分析，对于a 淀粉酶的蛋白质三级结 构已基本研究清楚。 t o n o z a k a ( 1 9 9 3 ) 对不同来源的3 7 个a 淀粉酶基因、分支酶基因、异淀粉酶基因 等进行了同源序列的比较，结果发现微生物与动物和植物产生的口淀粉酶的氨基酸序列 之间的同源性不超过1 0 ，但这些淀粉酶有a b c d 四个区域有高度的保守性，推测这 些保守区域与其底物的结合或催化中心有关。 m a t s u u r a ”】研究发现不同来源的a 淀粉酶拥有相同的基本次级结构，如( 1 3 a ) 结 构( 亦称之为t i m 桶) 是由八个q 螺旋包围8 个p 折叠组成的筒状结构，该结构被认 为具有催化能力。 j a n e ck s 【1 6 】通过对a 淀粉酶家族研究发现大部分a 淀粉酶除了含有八个( d 旭) 筒 状结构的催化中心( d o m a i n a ) 外，还包括d o m a i n b 、c 和d 。其中d o m a i n b 具有三个 d 折叠和三个a 螺旋，长度和结构随来源的不同而变化。d o m a i n c 区是催化区域后面的 区域，主要由p 折叠组成，该区被认为有保护催化中心疏水氨基酸的稳定性的作用【1 刀。 随着a 淀粉酶基因结构与功能关系的研究逐步深入，将为进一步提高a 淀粉酶活性 提供理论基础，为a 淀粉酶的应用提供更广阔的前景 1 1 4q 一淀粉酶在工业生产中的实际应用及存在的的问题 1 1 4 1q 一淀粉酶的工业用途 a 淀粉酶广泛应用于食品、酿造、制药、纺织以及石油开采等诸多方面，在工业生 产中占有极其重要的地位，是目前用途最广的一种酶制剂。如其在食品中可用于淀粉液 化，制造糊精、葡萄糖、怡糖、果葡糖浆、啤酒酿造等。在纺织工业中，为了增强纤维 的强度和光滑性，便于纺织，需要先行上浆。将淀粉用a 淀粉酶处理一段时间，使黏度 3 湖北大学硕士学位论文 达到一定程度就可用作上浆的浆料。纺织品在漂白、印染之前，还需要将附着在其上的 淀粉浆料等除去，利用伐淀粉酶使淀粉浆料水解，就可使浆料退尽。在疾病治疗方面， a 淀粉酶可以治疗消化不良，食欲不振【1 8 1 。表1 1 【1 9 】列举了a 淀粉酶在工业生产中的一 些用途。 表1 1q 一淀粉酶在工业生产中的应用n 们 用途说明 淀粉加工 酿造发酵工业 纺织品工业 面包工业 医药工业 饲料工业 其他 制造葡萄糖浆 制造饴糖 制造葡萄糖 制造各种粉末糊精 制造各种浆糊、粘着剂 啤酒原料的液化 酒精原料的液化及糖化 酱油、醋原料处理 各种织物退浆 改善质量品味、缩短时间、节约用糖 消化药 与其他酶一起添加促进消化 香料加工、造纸、石油压裂、果汁制造 1 1 4 2q 一淀粉酶在淀粉工业生产应用中的问题 淀粉工业常常包括以下两个步骤：液化和糖化，这两个过程都是在高温条件下进行 的。在液化过程中，淀粉大颗粒要经过个一个高温喷射装置，在1 0 5 1 1 0 的高温下液 化，p h 值为5 2 6 5 。然后用热稳定的淀粉酶在9 5 下对其进行部分水解2 3 个小时。 在此过程中，温度和p h 值的控制是非常苛刻的。如果液化的温度低于1 0 5 ，就会导 致未液化的淀粉颗粒对下游的过滤装置产生堵塞；如果液化的温度高于1 0 5 ，常用的淀 粉酶便会失活。这些酶在p h 低于5 5 时也会失活，而如果p h 值高于5 5 时则会有副产 物的产生。液化之后，将p h 值调至4 2 - 5 0 温度降为5 5 0 6 0 ，接着进行糖化过程。 在糖化过程中，液化的淀粉将被转化为低分子量的多糖、葡萄糖或者麦芽糖。淀粉糊的 自然p h 值为4 5 ，目前淀粉加工过程需要将p h 值调到5 8 6 5 来进行液化，然后将它降 为4 2 4 5 进行糖化。这两步p h 值的调节增大了化学试剂消耗，不仅会增加生产成本，而 且调节不当会产生大量的副产物。如果能够有一种能在高温低p h 值下作用的淀粉酶将 降低这些消耗，简化过程，减少副产物的产生，将大大改进淀粉工业的状况【捌。 4 第一部分文献综述 超耐热酸性a 一淀粉酶在我国具有非常广泛的应用前景。我国是一个发酵大国，以 粮食为原料的发酵行业如酒精发酵，氨基酸发酵、抗生素发酵、淀粉糖生产、有机酸发 酵、维生素发酵等生产厂很多。据中国发酵工业协会于2 0 0 1 年对国内大中型企业的统 计，全国年产酒精3 0 0 万吨左右，国务院批准燃料酒精2 0 0 万吨，氨基酸中仅味精发酵 年产就达6 5 万吨左右，淀粉糖年产8 0 万吨左右，有机酸中仅柠檬酸年产就达2 7 万吨 左右，维生素、抗生素年产量也十分可观【2 1 2 2 】。但我国淀粉的转化率与发达国家之间仍 存在很大的差距。用中温a 淀粉酶和普通高温仅一淀粉酶进行生产，首先将湿淀粉浆由 p h 4 0 4 5 调整到p h 5 2 6 5 进行液化，进行下步的糖化还需将p h 调回到4 2 - 5 o ，年产 5 0 0 万吨酒精，所用的酸碱费用则高达8 5 6 0 万元。此外还需大量的氯化钙。如调整淀粉 浆p h 不恰当，会使淀粉液化不彻底，影响产品质量，降低回收率。同时，在后处理工 序中还需要用离子交换树脂去除所加进的大量无机离子。不仅在酒精行业，对于氨基酸 发酵、抗生素发酵、淀粉糖生产、有机酸发酵、维生素发酵等以淀粉为原料的生产厂， 也会产生大量不可再利用的废水，造成水资源的浪费和环境污染，同时，废水处理需用 化学药品，工序复杂，电耗高，从而产生了废水处理成本的增加【2 1 2 2 1 。 1 1 5 国内外耐热耐酸q 一淀粉酶的研究进展 超耐热酸性a 淀粉酶克服了如上弊病，其最大特点是：淀粉液化彻底，转化率高， 降低生产成本；在淀粉液化过程中无需加入钙离子作为酶的保护剂；无需将湿淀粉浆由 p h 4 调到p h 6 再进行液化；无需将液化后的产品再调整p h ，这就节省了大量的酸、碱；可 使三分之二的废水回收利用，用于浸泡玉米、磨浆、发酵；无需用离子交换树脂去除所加 进的离子；简化生产工序和设备，降低劳动强度；减少环境污染，改善劳动环境。为实现 上述目标，研究开发具有超耐热性的酸性征一淀粉酶制剂，是一条经济合理、具有巨大的 经济效益和社会效益的高新技术生产途径。 对耐热耐酸性a 淀粉酶的研究主要采用了天然菌株筛选，诱变以及基因重组等方 法。近年来，由于基因工程技术的发展，人们可以按照需要来定向改造酶，目前，研究 人员正在采用基因技术克隆和和改造耐热耐酸性a 一淀粉酶基因来开发高产菌株，以应用 于工业生产。 国外对耐高温的a 淀粉酶研究主要集中在极端耐热淀粉酶的开发上。极端耐热淀粉 酶主要是从p y r o c o c c u sw o e s e i , p y r o c o c c u sf u r i o s u s , t h e r m o c o c c u sp r o f u n d u s 等古菌中分 离出来的，他们的最适温度分别为1 0 0 、1 0 0 、8 0 0 。例如a r c h a e b a c t e r i u mp y r o c o c c u s 5 湖北大学硕士学位论文 f u r i o s u s ( 激烈热球菌) 是一种生活在海底温泉附近的极端嗜热厌氧古菌，其最适生长温 度达到1 0 0 * c i z 3 。来源于e y r o c o c c u s f u r i o s u s 的a 淀粉酶不同于中温或普通高温a 淀糊 酶，由于其具有的耐热及耐酸的性质降捌以及其活力不需c a 2 + 的保护湖等特点受到了 人们的关注。1 9 9 7 年丹麦s t e e n 等首先报道了该基因的序列并将该基因分别在大肠杆 菌和枯草杆菌中表达。同年，美国d o n gg q 等也报道了该基因的序列并将其推测的氢 基酸序列与其它淀粉酶氨基酸序列进行了比较【2 7 1 。 日本的研究者经基因重组技术得到的一种b a c i l l u sl i c h e n i耐酸性a 淀粉酶可 以在 条件下，耐受温度 一 ，保持活性不变l 硐f o r 。m i s p h 5 0 - 551 0 0l1 0 c 欧洲的研究者采用基因技术改造b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 来生产耐热耐酸性a 淀粉酶。 在原有天然菌株的d n a 序列中将n 1 8 8 位的天冬氨酸残基用其它任何一种氨基酸替代， 使在m 1 5 或m 1 9 7 位的蛋氨酸残基缺失。得到的高产菌株所生产的0 【一淀粉酶适用的液 化p h 值可以降低到5 0 ，且在1 0 0 1 l o c 时活性不变 2 9 1 。 在国内，李金霞等人p o 】，通过基因扩增和分子克隆等方法，将耐高温a 淀粉酶基医 克隆在大肠杆菌j m l 0 9 中，得到了一株阳性克隆菌株j m l 0 9 ( p u a m ) ，并对该菌株的分 泌现象及机制作了初步分析，为耐高温a 淀粉酶基因的耐酸性改造及产物的表达和分泷 奠定了基础。 潘风光等人【3 l t3 2 】成功地克隆了地衣芽抱杆菌耐高温a 淀粉酶基因，并进行了诱导 表达，为人工表达耐高温a 淀粉酶基因及进一步提高其活性打下基础。 中山大学的李文清，罗进贤等人【3 3 j 则将地衣芽抱杆菌中的a 淀粉酶基因在枯草杆 菌中进行了表达和分泌，结果使其表达水平提高了1 2 倍。 熊鹏钧，文建军等【3 4 】从西藏羊八井常年温度在9 0 c 左右的热泉样品中分离出嗜熟 菌t h e r m u s s py b j l ，并对其淀粉酶基因进行了克隆研究。 1 9 9 0 年代，中科院微生物研究所的科研人员研究了嗜热真菌t h e r m o m y c e sl a n u g i n o ， s u s 对q 淀粉酶的生产【3 5 1 ，该酶的最适温度和p h 分别为6 5 ( 3 和5 0 ，但其耐热性较差。 蔡恒【蚓等人将地衣芽孢杆菌耐高温a 淀粉酶基因进行体外耐酸性改造后，以s a c b 基因的启动子和信号肽序列为基础，构建了诱导型表达载体，并将其转入枯草芽孢杆菌 d b l 0 4 中，实现了耐高温仅淀粉酶突变基因的分泌表达。 6 第一部分文献综述 1 2 酶的体外定向进化 自从上纪7 0 年代初d n a 重组技术问世以来，酶学被推进到一个十分重要的发展时 期，它的基础研究和应用研究领域发生着巨大的革命性变化，产生了生物酶工程。 生物酶工程主要包括三个方面：( 1 ) 用d n a 重组技术( 即基因工程技术) 大量地生产 酶( 克隆酶) ；c ) 对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶( 突变酶) ：( 3 ) 设计新的酶基因，合 成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。 酶基因的克隆和表达技术的应用使我们有可能克隆各种天然的蛋白基因或酶基因。 先在特定的酶的结构基因前加上高效的启动基因序列和必要的调控序列，再将此片段克 隆到一定的载体中，然后将带有特定酶基因的上述杂交表达载体转化到适当的受体细菌 中，经培养繁殖，再从收集的菌体中分离得到大量的表达产物我们所需要的酶。一 些来自于人体的酶制剂，如治疗血栓栓塞病的尿激酶原，就可以用此法取代从大量的人 尿中的提取。此外还有组织纤溶酶原激活剂m a ) 与凝乳酶等一百多种酶的基因已经克 隆成功，其中一些还已进行了高效的表达。此法产生出大量的酶，并易于提取分离纯化 p 7 l 。 o 然而天然的酶其活性往往不能满足人们的要求，需要改变其某些性质、提高其活性， 以便更好地发挥其催化功能。需要改善的酶学性质包括：对热、氧化剂、非水溶剂的稳 定性；对蛋白水解作用的敏感性；免疫原性：最适p h 、离子强度及温度；催化效率； 对底物和辅助因子的专一性与亲合力；反应的主体化学选择性；催化效率；别构效应； 反馈抑制：多功能性：在纯化或固定化过程中酶的功能和理化性质等。 采用分子生物学技术对酶分子进行改造以适应不同的应用要求，越来越受到人们的 重视。 1 2 1 概述 酶蛋白的分子生物学改造，最常用的方法可以概括为两种：理性设计( r a t i o n a ld e s i g n ) 和非理性设计( i r r a t i o n a ld e s i g n ) 3 8 1 。 对蛋白质进行理性设计( r a t i o n a ld e s i g n ) ，即研究者们在分析氨基酸序列弄清酶的一 级结构及x 线衍射分析弄清酶的空间结构的基础上，再在由功能推知结构或由结构推知 功能的反复推敲下，设计出酶基因的改造方案，指出选择性遗传修饰的修饰位点，利用 7 湖北大学硕士学位论文 定点突变等基因改造技术，改变蛋白序列中的个别氨基酸残基，从而对酶的性质和其催 化特性进行改造，产生符合特定需要的酶。 要进行理性设计必须要了解蛋白质的结构和功能的相互关系，但是人们的理解仍然 非常有限。蛋白质结构的复杂性极大地增加了理性设计的难度。更何况对于大多数要改 造的蛋白质来说，我们并不清楚其三维结构信息，不能进行合理设计。近些年发展起来的 定向进化技术可在一定程度上弥补上述的不足。定向进化( d i r e c t e de v o l u t i o n ) ，又被称作 实验分子进化( e x p e r i m e n t a l l ym o l e c u l a re v o l u t i o n ) ，通过在实验室中模拟达尔文自然进化 过程，针对某一蛋白质酶的基因，采用随机突变或基因重组技术改造酶的基因，然后根 据特定的改造目的，筛选有价值的非天然的酶p 9 1 。相对于传统的蛋白质的“理性设计 ( r a t i o n a ld e s i g n ) ”，该方法属于蛋白质的“非理性设计( i r r a t i o n a ld e s i g n ) ”。 定向进化技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这一难题，成为使用最广泛的改 造酶蛋白的强大工具，也是探索和研究酶蛋白构效关系的良好工具。但这一技术需要大 量筛选突变体以获得有益正向突变，突变体的筛选技术成为主要技术瓶颈。 酶工程的最新进展就是在现有的结构功能基础上，结合理性和非理性的因素将 随机突变集中在少数特定的位点上，进行“蛋白质半理性设计”( s e m i r a t i o n a ld e s i g n ) 4 0 l ， 可以大大降低突变库的容量。这种新策略使现有的筛选方法也可以快速的覆盖整个突变 库，在没有合适的强力筛选方法时，可以有效的增加获得阳性突变体的可能性。表1 2 是对这几种方法的比较。 表1 2 酶分子改造方法比较 高通量筛选方法不必要必要有利，非必需 了解结构和功能信息两者都需要 获得协同突变的可能性低 都不需要获其一即可 中等高 1 2 2 定向进化的建库策略 定向进化包括两个基本步骤：( 1 ) 建立目的酶基因的突变体库；( 2 ) 对不同突变基因表 达的蛋白进行筛选，找到有益突变体。 8 第一部分文献综述 目前，建立突变库的策略主要有随机突变，基因重组和定点饱和突变。其中随机突变 与基因重组属于非理性设计，而定点饱和突变属于半理性设计。 1 2 2 1 随机突变 建立突变体库最直接的方式就是随机突变，这种方法不需要知道蛋白质的结构信息， 能够得到无法预知突变位置的有益突变体。易错p c r ( e r r o rp r o n ep c r ) 【4 1 4 2 】是其典型代 表。 易错p c r 是一种简便快速地在d n a 序列中随机制造突变的方法其基本原理是通 过改变传统p c r 反应体系中某些组分如m g + 和d n t p 的浓度，或使用低保真度的d n a 聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错误引入而创造序列多样性文库。本法的关键在于选 择适当的突变频率，一般有益突变的频率很低，绝大多数突变是有害的。当突变频率太高 时，几乎无法筛选到有益突变，甚至出现很多完全失去酶活性的个体；但突变频率也不 能太低，否则野生型将占据绝对优势，很难筛选到理想的突变体。一般每个目标基因发 生2 - 5 个碱基替换时诱变结果是最理想的。 该技术可以应用在结构未知的对映体选择性催化酶类的改造中，例如仅经过一轮易 错p c r 就可以产生几十个r 型或s 型的环己烷单加氧酶突变体【4 3 j 。 易错p c r 虽己广泛应用在酶的定向进化中，但它也有一定的局限性，如：突变率 难以控制，有时需要反复进行p c r ，较为费力耗时，且一般适用于较小的基因片断( 8 0 0 b p ) 。 1 ，2 2 2 基因重组 与随机突变相比。基因重组技术可以获得更大程度的序列改变根据不同的改组思想 和不同的实验条件，主要有以下几种策略可以选择。 1 2 2 2 1 d n a 改组( d n as h u f f ii n g ) d n a s h u f f l i n g 由美国s t e m m e r 亍= 1 9 9 4 年首次提出【4 5 1 。该法是对一组基因群体( 进 化上相关的d n a 序列或曾筛选出的性能改进序列) 进行重组创造新基因的方法。因为该 法在d n a 片段组装过程中也可能引入点突变，所以它对从单一序列指导进化蛋白质也是 有效的。其基本原理，首先对一组序列相关的d n a 序列( 经随机诱变得到的一组有益 突变体，或天然存在的基因家族) ，经过超声波处理或用d n a 酶i ( d n a s ei ) 消化产生 系列随机切割的d n a 片段，然后，在没有引物的情况下，采用有性p c r 方法进行合 成。d n a 酶i 切割的d n a 片断通过相互间的同源性进行随机互补并以此为引物，经p c r 9 湖北大学硕士学位论文 扩增，获得d n a 分子的复制，由此获得大量d n a 不同区域间的随机重新组合的新d n a 突变体。完成这一p c r 随机扩增后，再加入特定引物进行最后的p c r 扩增，便可获得 全长基因的p c r 产物。随着循环数的增加，p c r 产物将越来越接近切割前的目的基因 的长度。最后，用基因两侧的引物合成全长的基因。该基因已经包含了不同突变体发生 的突变。 美国的s t e m m e r 采用单个基因的d n as h u f f l i n g 和回交技术，在大肠杆菌中使编码 p - 内酞胺酶的t e m 一1 基因的抗生素抑制活性( m i c ) 从0 0 2 1 x g m l 提高到6 4 0 1 x g m l ，即提高 了3 2 0 0 0 倍。此后，他们又相继选取了绿荧光蛋白基因( 咖) 和b 一半乳糖苷酶基因他c ) 用 d n a s h u f f l i n g 技术模拟并加速了分子进化过程，筛选获得了酶活性大幅度提高的突变 株。 其优点是操作较简单，不必了解蛋白结构信息，容易获得有益突变，但缺点是只能对 同源性较高的一组序列进行改组( 7 0 以上) ，且需要多次进行p c r 扩增和检测，而且在 d n a 片断重新组装成全长序列之前必须去除干净d n a s ei 。 在d n a s h u f f l i n g 的基本原理基础上，又发展出了交错延伸法( s t a g g e re x t e n s i o n p r o c e s s ，s t e p ) 和随机引物体外重组( r a n d o m - p r i m i n g i nv i t r or e c o m b i n a t i o n ，r p r ) 等突变技 术，其共同特点是都基于同源重组。 1 2 2 2 2 交错延伸法( s t a g g e re x t e n s io np r o c e s s ，s t e p ) s t e p 重组由z h a o 等】提出，是一种简化的d n a s h u f f l i n g 技术它不是由短片段组装 全长基因，而是在一个反应体系中以两个以上相关的d n a 片断为模板，进行p c r 反应。 引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性和短暂复性延伸反应，从而只能合成出 非常短的新生链。在每一轮p c r 循环中，那些部分新生链可以随机地杂交到不同的模板 上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段， 结果产生间隔的含不同模板序列的新生d n a 分子。 s t e p 法重组发生在单一试管中，不需分离亲本d n a 和产生的重组d n a 。该法简 便且有效，为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具 1 2 2 2 3 随机引物体外重组( r a n d o m - p r i m i n gi nv i t r or e c o m b i n a t i o n r p r ) r p r 是以单链d n a 为模板，用一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位 点的短d n a 片段( 由于碱基的错配和错误引发这些短d n a 片段中也会有少量的点突 变) ，在随后的p c r 反应中，它们互为引物进行类似于d n a s h u f f l i n g 的全长基因装配反 应，获得多样性文库。 如果需要，可反复进行上述过程，直到获得满意的进化酶性质。 1 0 第一部分文献综述 与d n as h u f f l i n g 相比，r p r 具有以下优点：( 1 ) 可用单链d n a 或m r n a 为模板， 且对模板量要求少，大大降低了亲本组分，便利筛选；( 2 ) 片段组装体系与片段合成体系 缓冲系统可兼容组装前无需纯化操作；( 3 ) 合成的随机引物具有同样长度，无顺序倾向 性，在理论上保证了每个碱基都被复制或以相似的频率发生突变；( 4 ) 随机引发的d n a 合成不受模板d n a 长度的限制，便利了小肽的改造。 1 2 2 2 4 其它技术 渐进切割杂和酶技术( i n c r e m e n t a lt r u n c a t i o n f o r t h ec r e a t i o no fh y b 耐e n z y m e s ， r r c h v ) 4 8 1 是通过用核酸外切酶对两个亲本基因分别进行消化，通过控制切割速度和时 间，或者通过切割前随机插入a p h o s p h o t h i o a t e 修饰的核苷酸的方法，产生一系列依次相 差一个碱基的d n a 片段，再将两组片断化基因互相连接，产生杂和基因文库。该技术的 优点是可以在无同源性或低同源性的两个基因间产生重组，突破了d n as h u f f l i n g 仅能 在高同源基因间重组的限制。缺点是重组一定是在两个不同的父本之间产生，并且子代中 功能杂合子的比率很低。 。 外显子改组( e x o ns h u f f l i n g ) 是由k o l k m a n 等 4 9 1 于2 0 0 1 年建立的以外显子为单元 进行自由重组的技术。在许多真核生物基因中，一个外显子编码一个折叠结构域，因此可 以利用内含子之间的重组使独立的外显子组装成编码新蛋白的基因。首先用嵌合寡核营 酸引物分别扩增需要参与改组的外显子或外显子组，混合预扩增产物，经过无引物p c r 反应连接成不同组装形式的完整长度的d n a 分子，形成外显子洗牌文库。通过控制参与 改组的外显子范围，可产生不同特性的突变库。它可以加入更多的理性设计，甚至可以完 全避免点突变，因此可应用于医药等某些特殊领域。 1 2 2 3 定点饱和突变( s j t e - s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s ) 如果某些蛋白质工程的目的是对酶的选择性或作用区域作较大的改变，那么可能需 要在酶的活性区域做多位点的突变，这种多突变位点的组合很难通过全基因随机突变的 方法来达到，因为包含较少突变位点的突变体可能有一些相应性质会发生提高，而包含大 量突变的突变体库中，绝大多数都是无活性的蛋白。此外，由于氨基酸的简并性，单核苷酸 的改变并不都能导致氨基酸的替换。 对于这个问题可以通过定点饱和突变( s i t e s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s ) 来解决。所谓定点 饱和突变技术( s i t e s a t u r a t i o nm u t a g e n e s i s ) 是通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时 间内获取靶位点氨基酸分别被其它1 9 然氨基酸所替代的突变子。它不是定点突变技术 湖北大学硕士学位论文 的简单延伸，而是蛋白质设计理念的全面升华，是结合了蛋白质理性设计和非理性设计 优点的一种半理性设计，广泛地应用于蛋白质改造及结构功能关系研究中。 1 2 2 3 1 盒式诱变( c a s s e t t em u t a g e n e sis ) 该法利用一种含有突变靶位点和特殊酶切位点序列的密码子盒( c o d o nc a s s e t t e ) 来引入突变序列1 5 0 1 。由于密码子盒可从正反两方向插入目的基因，因此只须1 1 种密码 子盒就可替换产生全部2 0 种氨基酸以达到定点饱和突变的效果，如两侧为c a g g t c 的密码子盒可通过正反插入方式分别引入g i n ( c a g ) 和l e u ( c u g ) 密码子【5 l 】。 该法突出优点是：一个靶位点两侧的酶切位点经过改造可替换成其它氨基酸，相对 于寡核苷酸定向诱变而言节省了引物合成的费用，而且可对多个非邻近位点同时进行点 饱和突变。不足之处是：( 1 ) 每个靶位点两侧需分别设计酶切位点；( 2 ) 密码子盒两端存 在重复序列，因自连而增加突变子筛选难度。 1 2 2 3 2 基于p c r 的定点饱和突变 基于p c r 的定点饱和突变方法相对简便，其基本原理是在靶位点处设计兼并引物 对目的基因进行扩增以获取突变子。兼并引物一般设计成n n n 或n n x ，n 代表4 种核 苷酸等比例混合物；x 代表2 种核苷酸等比例混合物( 如g c 或叩) ，4 种或2 种核 苷酸在同一位点的替换不存在偏好性【5 2 1 。 根据扩增位点的不同，基于p c r 的定点饱和突变方法分为以下几种。 突变引物诱变：当靶位点位于基因两端时，可设计这样一对引物扩增目的基因，正向 引物为靶位点突变的兼并引物，反向引物为目的基因序列引物。突变引物诱变是基于 p c r 的点饱和突变中最简单、最快速的方法，但难以对基因中间的靶位点进行点饱和突 变。 重叠延伸p c r ：设计一对兼并引物，使其在靶位点附近有一定程度的重叠，分别与 基因5 和3 端引物组合，扩增含突变靶位点的上游片段和下游片段，然后将上下游片段 在靶位点处交错，互为模板重叠延伸成全长基因。重叠延伸p c r 是最经典的点饱和突 变的方法，该法主要优点是：( 1 ) 能方便地对基因中间的靶位点进行点饱和突变，解决中 间靶位点不易突变的难题：( 2 ) 突变与重组同时完成，大大缩短实验周期；( 3 ) 不存在突 变修复问题，容易筛