（遗传学专业论文）rna聚合酶Ⅲ和Ⅰ在cho细胞核中转录位点及其相互关系的研究.pdf

r n a 聚合酶i i l 和i 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究摘要真核生物细胞核中具有三种不同的r n a 聚合酶，分别是r n a 聚合酶i 、r n a聚合酶i i 和r n a 聚合酶i i i 。r n a 聚合酶i 负责催化生成5 8 s 、1 8 s 和2 8 s r r n a ，r n a 聚合酶u 负责m r n a 的转录合成，而r n a 聚合酶i i i 则负责催化5 s r r n a 、t r n a 、多数的s n r n a 以及某些病毒基因( 如v a 基因) 的转录。从上个世纪六十年代开始人们就通过放射自显影、免疫标记结合细胞化学染色的方法对这三种r n a 聚合酶在细胞核中的转录位点进行了研究。研究结果显示：r n a 聚合酶i 的转录发生在核仁内，r n a 聚合酶u 和r n a 聚合酶i i i 的转录发生在核质中。由于r n a 聚合酶i 转录位点的研究存在特殊性，而传统的研究方法又存在一定的局限性，因此近几年人们对r n a 聚合酶i 的转录发生在核质中这一结论提出了质疑，但至今尚缺乏直接的实验证据。本研究以中国仓鼠卵巢细胞株( c l i o ) 为材料，利用基因转染、荧光原位杂交结合激光共聚焦显微镜观察，对r n a 聚合酶i i i 的转录位点和转录子分布进行了研究。结果表明r n a 聚合酶i h 的转录位点发生在核仁及其周边区域。同时，应用这一研究方法对r n a 聚合酶i 的转录发生在核仁中的结论进行了确证，并进而应用双探针标记荧光原位杂交的方法对r n a 聚合酶i i i 和r n a 聚合酶i 转录位点的关系进行了初步探讨，结果显示两者的转录位点之间非常接近，并且有伴随发生的趋势。本实验突破了r n a 聚合酶i 转录发生在核质中这一传统观点，同时得出了r n a 聚合酶i 和r n a 聚合酶i 的转录位点非常接近、可能相伴发生这一结论。研究结果对于人们进一步了解r n a 聚合酶n i 的转录机制、加工和运输过程及r n a 聚合酶之间的结构与功能关系等均具有重要的意义。关键词：r n a 聚合酶l l ir n a 聚合酶i 转录位点荧光原位杂交c h o 细胞核仁r n a 聚台酶i i i 和1 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究a b s t r a c tt h e r ea r et h r e et y p e so f r n a p o l y m e r a s e si ne u k a r y o t e ：p o l y m e r a s ei ，i ia n di i i r n a p o l y m e r a s eis y n t h e s i z e s t h e t h r e e l a r g e s tr r n a s ，5 8 s ，18 sa n d 2 8 sr r n a r n ap o l y m e r a s ei ip r o d u c e sm r n ae n c o d i n gp r o t e i n s ，a n dr n ap o l y m e r a s ei i im a k e s5 sr r n aa n dt r n a s a sw e l la saf e ws m a l ln u c l e a rr n a s s i n c et h ee a r l y1 9 6 0 s ，t h et r a n s c r i p t i o ns i t e so ft h e s ep o l y m e r a s e sh a v eb e e ns t u d i e db yv a r i o u sa p p r o a c h e s ：a u t o r a d i o g r a p h y , i m m u n o - e l e c t r o nm i c r o s c o p ya n dc y t o c h e m i s t r ys t a i n i n g t h er e s u l t so ft h e s ee a r l yr e s e a r c hw o r k ss h o w e dt h a tt h el o c a l i z a t i o no fr n ap o l y m e r a s eit r a n s c r i p t i o nw a si nt h en u c l e o l ia n dt h a to fr n ap o l y m e r a s ei ia n di i ii nt h en u c l e o p l a s m i nr e c e n ty e a r s ，m o r ea n dm o r ee x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tr n ap o l y m e r a s ei i it r a n s c r i p t i o nm i g h tn o to c c u ri nt h en u c l e o p l a s mb u ti nt h en u c l e o l u s n e v e r t h e l e s s ，t h e r ei sn od i r e c te x p e r i m e n t a lp r o o f i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h ep l a s m i d sb e a r i n gp o lh ir e c o g n i z e dp r o m o t e r sw e r et r a n s f e c t e di n t ot h ec h oc e l l sb ye l e c t r o p o r a t i o n a r e ri q u o r e s e e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，i tw a ss h o w e du n d e rt h ef l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ya n dl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p yt h a tr n ap o l y m e r a s ei i it r a n s c r i p t i o l lo c e u r e di nt h ei n t e r i o ra n dp e r i p h e r yo fn u c l e o l i i tw a sa l s op r o o f e db yt h es f l n l em e t h o d st h a tr n ap o l y m e r a s eit r a n s c r i p t i o nw a sl o c a l i z e di nt h en u c l e o l ia ss t a t e db e f o r e f u r t h e r m o r e ，b yu s i n gt w o - c o l o r e dp r o b e st os t u d yt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nr n ap o l y m e r a s ei i ia n dr n ap o l y m e r a s ei w eo b s e r v e dt h a tt h es i g n a l so ft h et w or n ap o l y m e r a s ew e r ev e r yc l o s e i ti si n f e r r e dt h a tt h e i rt r a n s c r i p t i o n sm a yo c c u ra tt h es a m et i m e t h er e s u k sw i l lh e l pu st of u r t h e rc o m p r e h e n dt h em e c h a n i s mo fr n ap o l y m e r a s et r a n s c r i p t i o n ，t h ew a yo ft r a n s c r i p t i o np r o c e s s i n ga n dt r a n s p o r t a t i o n ，a n dt h es t r u c t u r a la n df u n c t i o n a lr e l a t i o n s h i pa m o n gt h et h r e er n a p o l y m e r a s e s k e yw o r d s ：r n ap o l y m e r a s e r n ap o l y m e r a s eit r a m r i p t i o ns i t e sf l u o r 8 c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f m n )c l l oc e l l sn u c l e o l u sr n a 聚合酶l i i 和i 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究第一章前言一、r n a 聚合酶i i i 和r n a 聚合酶i 的转录研究1 、r n a 聚合酶概述r n a 聚合酶是执行基因转录的一类重要的酶类复合物。它们都需要以4 种核糖核苷三磷酸( d a t p 、d g t p 、d c t p 、d t t p ) 作为底物，并需要适当的d n a作为模板，m f + 则作为辅酶参与其功能。真核生物的细胞核中具有三种不同类型的r n a 聚合酶，其相对分子量都在5 0 0 。0 0 0 道尔顿左右。三种r n a 聚合酶对a 一鹅膏蕈碱的敏感性不同，可以据此进行区分。r n a 聚合酶i 对a 一鹅膏蕈碱不敏感；r n a 聚合酶i i 可被低浓度的q 一鹅膏蕈碱( 1 0 9 1 0 。8m o l l ) 所抑制：r n a 聚合酶i 则对高浓度的a 一鹅膏蕈碱( 1 0 - 51 0 4m o l l ) 敏感，生物活性会被抑制。n 鹅膏蕈碱是一种毒蕈( 鬼笔鹅膏a n m n i t a p h a l l o i d e s ) 产生的八肽化合物。r n a 聚合酶i 参与转录形成1 8 s 、5 8 s 和2 8 sr r n a 的基因，r n a 聚合酶i i 转录所有的蛋白质编码基因及一部分ur n a 基因，r n a 聚合酶i i i 转录几乎所有的小分子量的细胞r n a 基因，包括5 sr r n a 、t r n a 、s n r n a 、r n a s epr n a s 、i v l r p 核仁小r n a ( s m a l ln u c l e o l a r r n a ，s n o r n a ) 、s r p 和y 族胞质小r n a ( s m a l lc y t o p l a s m i cr n a 。s c r n a ) 的基因等，扪。三种r n a 聚合酶都是多亚基蛋白质复合体! ，具有的亚基数都在1 4 个以上，一般由2 个大亚基和1 2 1 5 个较小的亚基组成1 4 , 5 。以酵母细胞中的r n a 聚合酶为例，其r n a 聚合酶i 由1 5 个亚基构成，r n a 聚合酶包含1 4 个亚基，r n a聚合酶i i i 的亚基数是1 7 个。尽管它们彼此间的亚基数目各不相同，但是这三种不同的r n a 聚合酶都包含有5 种共同的亚基( a b c i o 、a b c l 01 3 、a b c l 4 5 、a b c 2 3 和a b c 2 7 ) 。r n a 聚合酶i 和r n a 聚合酶i 之间还具有另外两种相同的亚基成分( a c l 9 和a c 4 0 ) 6 , 7 1 。真核细胞r n a 聚合酶分子各亚基的功能目前还不清楚，但每个亚基对于真核细胞r n a 聚合酶的正常功能来说都是必不可少的。2 、r n a 聚合酶i i l 的转录4r n a 聚合酶i l i 和l 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究r n a 聚合酶l i i 在细胞内负责转录绝大多数小分子量的r n a 基因，包括5 sr r n a 、t r n a 、s n r n a 及某些d n a 病毒( 例如腺病毒) 等基因【3 1 。r n a 聚合酶i i i 的启动子分为两类：一类位于结构基因的内部，称为内部启动子，分为i 型和i i 型内部启动子：一类与r n a 聚合酶i i 的启动子相似，位于结构基因的上游，称为外部启动子 8 , 9 , 1 0 l 。内部启动子基因内部包含两个不连续的d n a 片段。这两个d n a 片段包括一些不同的连续d n a 序列a 、b 或c 区，两个区之间被隔开，a 、b 或a 、c内部的d n a 序列是转录因子t f i i i a 和t f i i ic 转录启动的结合部位。i 型内部启动子包括a 和c 区，存在于5 sr r n a 的基因中( 如图1 ) ；i i 型内部启动子包括a 和b 区，存在于t r n a 基因、腺病毒v a 基因中( 如图2 ) 。外部启动子缺乏相应的内部序列，仅在5 端有顺式作用元件，在基因的末端有一组由四个或更多胸腺嘧啶组成的终止信号，如脊椎动物的u 6s n r n a 和7 sr n a 的启动子【】。其5 端顺式作用元件包括以下几个控制元件：上游约3 0处存在一个t a t a 框序列，近- 6 0 处有一个近端序列元件( p r o x i m a ls e q u e n c ee l e m e n t ，p s e ) 和一个或多个远端序列元件( d i s t a ls e q u e n c ee l e m e n t ，d s e ) ( 如图3 ) 。+ l图1i 塑内部启动子 ，o _ o o o -_+ l圈2i i 型内椰启动子r 卜_ 卜l图3 外辩窟动子腺病毒及s v 4 0 等多种病毒的基因组中也包括有由r n a 聚合酶i i i 转录的基因。腺病毒v ar n a ( v i r u s - a s s o c i a t e dr s a ) 是富含g c 的小分子( 1 2 0 - -1 7 0 b p ) ，有v ar n ai 和v ar n a i i p i 删1 1 2 1 , 人类腺病毒v ar n a 基因大r n a 聚合酶i i i 和l 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究约位于病毒基因组的3 0 m u 处，在病毒末端蛋白前体的主体外显子和5 2 5 5 k d 蛋白外显子之间，是由宿主细胞r n a 聚合酶i i i 转录的双链r n a ( d s r n a ) 。在v a r n a i 和v a r n a i i 的编码基因中，普遍存在着与t r n a 基因a 区及b 区相关的i c r 序列区，在细胞质的r n p 颗粒中也发现有v a l 和v a 2r n a 分子。这两种v a r n a 分子是形成稳定的4 8 s 转译前起始复合物的必要条件口孔。与r n a 聚合酶i i i 转录相关的转录因子主要有t f i i ia 、t f i i ib 和t f i i ic等几种 1 4 , 1 5 l 。t f i i ic 能够与t r n a 启动子的a 区和b 区结合。t f i i ib 结合于a区上游约5 0 b p 的位置，其结合部位由t f i i ic 所决定，与其结合的序列并无特异性。结构分析表明，t f i i ib 由3 个亚基组成，分别是t b p 、b r f ( t f i i ib r e l a t e df a c t o r ，t f h i b 相关因子) 和t f b 。r n a 聚合酶i i i 的转录开始于转录起始复合物的形成 1 6 , 1 7 , 1 8 。由于r n a 聚合酶i 启动子类型的不同，转录起始复合物的形成过程也不尽相同。t r n a 基因转录起始复合物的装配过程大致如下：首先，t f i hc 结合于启动子的a 区和b 区，其中对b 区的亲和力最高；其后，t f h i b 与t f i h c 相互作用后结合到a区上游5 0 b p 处，其结合与d n a 序列本身无关：然后，r n a 聚合酶i i i 结合到t f i hb _ t f i c - d n a 的复合物上；最后t f i i ic 从复合物上脱离下来，r n a的转录开始。在这一过程中，t f u ic 所起到的仅是一种辅助因子的作用。在转录起始复合物的形成过程中，5 srr n a 基因与t r n a 基因的有所不同，前者由t f i i ia 来其识读内部启动子元件而后者不是。对于外部启动子而言，它的转录起始和r n a 聚合酶i i 启动子的起始有些相像。其上游的各种元件由其对应的反式作用因子来识别并结合。t b p 识别t a t a 框，可引导t f i i i b 结合到d n a 序列上来。p s e 元件可被一种抑制蛋白因子所识别并结合。其对d n a 结合区的屏蔽作用需要在八聚体蛋白因子( o c t ) 结合到启动子上游的d s e 元件以后才解除掉。起始复合物形成后，转录开始。r n a 聚合酶i i i 的转录是在无延伸因予的参与下完成的。这可能与其转录产物的长度较短有关。r n a 聚合酶i i i 的转录终止与模板链上所携带的终止信号有关，不需要上游的茎环结构。该终止信号通常是d n a 模板链上的一段简单的富含a 的终止子序列【1 9 1 。例如，爪蟾5 sr r n a 基因的终止予序列为5 g c a a a a g c 3 。3 、r n a 聚合酶i 的转录r n a 聚合酶i i l 和i 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究r n a 聚合酶i 参与转录形成1 8 s 、5 8 s 和2 8 sr r n a 的基因，这些基因组成一个共转录单位，成簇分布( 如图4 ) 4 1 。在基因簇中，1 8 s 5 8 s 2 8 sr r n a 转录单位按串联重复形式排列，中间被不转录的间隔区分隔开，此段不转录的间隔区称为基因间隔区( i n t e r g e n i cs p a c e r , i g s ) 。1 8 s5 8 s2 8 s5 二【 口瓢。，按耱体黜 a 单转录单元r r、5 匕c 脚日- 1 日- 卜c 硝黼e 嬲霸唧3 剐蹦冽kj n图4 核穗体r n a 特录颦元r n a 聚合酶i 所负责转录的基因的启动子由两部分组成：一个是核心启动子( c o r ep r o m o t e r ) ，位于- 4 5 - - - + 2 0 之间，单这段序列就足以使转录起始：另部分是上游控制元件( u p s t r e a mc o n t r o le l e m e n t ，u c e ) ，位于- 1 8 0 - - 1 0 7 之间，它们对基因的有效转录是必需的，可以大大提高核心启动子的转录效率2 们。+ 1圈5 哺乳动物钓檬n a 启动子的结构上游结合因子( u p s t r e a mb i n d i n ge l e m e n tu b f ) 是一种特异的d n a 结合蛋白，可以与u c e 核心启动子上游的一段序列结合【2 1 1 。选择因子s l l ( s e l e c t i v i t yf a c t o r ) 为r n a 聚合酶i 转录所必需，可以结合并稳定u b f d n a 复合物，且与核心元件游离的下游部分相互作用。s l l 包含4 种蛋白组分，分别是t a t a 框结合蛋白t b p ( t a t a - b o xb i n d i n gp r o t e i n ) 以及3 种t b p 结合蛋白t a f ( t b pa s s o c i a t e df a c t o r s ) 。u b f 在不同的种属问相当保守，而s l l 的种属差异性则较为明显1 2 2 1 。r n a 聚合酶i 转录起始复合物的形成过程已研究得比较清楚。首先上游结7r n a 聚合酶l i i 和i 在c l i o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究合因子u b f 特异地结合到u p e 和核心启动子上面。由于s l l 本身对启动子没有特异性，因此它需要在u b f 与启动子结合以后，才会识别并结合u b f d n a 的复合物。然后，r n a 聚合酶i 再结合到上面形成完整的转录起始复合物，起始r r n a 基因的转录【钔。关于r n a 聚合酶i 催化基因转录的终止机制目前尚不清楚，只知道需要一种聚合酶特异性的终止子和r d n a 转录末端的一段终止子序列【2 3 】。4 、r n a 聚合酶i i i 和r n a 聚合酶i 之间的关系真核生物r n a 聚合酶i 与r n a 聚合酶i 是两种不同的转录系统，从表面上看二者功能各不相同，但事实上它们之间存在着千丝万缕的联系【2 4 1 。首先，r n a 聚合酶i i i 与r n a 聚合酶i 在转录机制方面有很多相似之处。r n a 聚合酶i 和i i i 具有七种相同的亚基成分：a b c l o a 、a b c l 0 b 、a b c l 4 5 、a b c 2 3 、a b c 2 7 、a c l 9 和a c 4 0 。转录过程都是在形成转录起始复合物后开始，转录都发生在大量的转录位点中，等等。其次，r n a 聚合酶与r n a 聚合酶i 两者的转录产物在功能上有很大的相关性。研究发现，r n a 聚合酶i i i 可以影响r r n a 前体的加工过程，机制目前还不清楚，推测有可能是r n a 聚合酶的转录子直接参与r r n a 前体的加工，证据是作为r n a 聚合酶m 转录子的u 3s n r n a 、r n a s em r pr n a 、r n a s epr n a 可以影响5 8 sr r n a 的成熟。进一步研究发现，t r n a 前体的加工和r r n a的合成是相伴随的。还有研究者以温度敏感的r n a 聚合酶i i i 突变体进行研究，发现这种突变体可以破坏r n a 聚合酶转录子的合成，抑制r n a 聚合酶i 转录子的成熟，但是对r n a 聚合酶的转录无影响【2 5 , 2 6 , 2 7 l 。二、r n a 聚合酶i i i 转录位点的研究自2 0 世纪中后期以来人们相继利用电子显微镜放射自显影、免疫标记结合细胞化学染色等方法对r n a 聚合酶i 转录位点进行了研究和探讨，大都认为r n a 聚合酶的转录发生在核质中【3 l 。i 、l i m a 聚合酶i i i 转录位点研究的特殊性首先，传统研究方法主要是根据r n a 聚合酶对高浓度的岱鹅膏蕈碱敏感的特点，采用适宜浓度的岱鹅膏蕈碱和放线菌素d 对r n a 聚合酶i 和进r n a 聚合酶i i l 和i 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究行抑制，以达到对r n a 聚合酶i i i 进行单独研究的目的 2 8 , 2 9 1 。理论上虽然如此，事实上通过药物不可能完全抑制r n a 聚合酶i 和i i 的活性，而且r n a 聚合酶的作用活性也不可避免地受到药物的影响。另外，r n a 聚合酶i i i 的转录产物主要包括5 sr r n a 、t r n a 、u 6s nr n a等3 0 】。这类r n a 具有核苷酸链长度短、合成快、输出迅速等特点。例如，5 sr r n a的核苷酸链长度在1 2 0 b p 左右，t r n a 的核苷酸链长度在7 5 9 5 b p 之间。因此利用传统的标记定位方法所观察到的标记位点往往远离了r n a 聚合酶i i i 真正的转录位点，得到的信号更可能来自于下游加工运输过程中或之后的信息。这也就是前人为什么得出r n a 聚合酶的转录发生在核质中的原因。2 、传统研究方法的局限性传统的用于r n a 聚合酶定位研究的方法主要有电子显微镜放射自显影和免疫标记定位等，都在不同程度上存在着一定的缺陷。首先，电子显微镜放射自显影以银粒作为标记信号，b r - u t p 以胶体金来标记定位信号。然而在用于标记定位时，由于银粒和胶体金自身带来的缺陷却是无法回避的 3 1 , 3 2 , 3 3 】。在超微水平上，银粒和胶体金的体积都比较大，结果就造成其所标记的转录信号往往会偏离实际的标记核苷酸渗入位点。银粒标记的信号误差有几百个纳米，而胶体金的标记误差也在2 0 纳米左右。其次，在标记方式上存在着不足。用于r n a 合成位点的标记物主要是放射性标记( 3 h 、3 2 p 等) 和b r 标记的d u t p 。它们渗入活体细胞的方式都需要对细胞进行渗透化处理，然后再给予短暂的温育时间( 少则5 m i n ) ，以利于标记核苷酸能够渗入到新合成的r n a 链中。然而r n a 的合成非常迅速，其合成的速度大致为1 4 ，0 0 0n t m i n 。因此，在温育后追踪定位的方法中所获得的转录信号可能已经远离了r n a 最初合成的位点，标记的r n a 已经开始了剪接运输等过程 3 4 , 3 5 。同时，渗透化处理的过程经常导致细胞核结构的改变，造成合成的r n a的沉积，严重影响结果的可信程度【3 6 】。最后，在免疫标记方法上也存在着一定的障碍。对于不同形式的r n a 聚合酶的转录，前人曾利用抗聚合酶转录因予的抗体进行定位工作阅。但是在细胞核内。转录因子并非全部处于工作时期的活性状态，而更多的可能是储存在细胞核之中。因而这种方法获得的转录位点的结果更不能令人信服。9r n a 聚合酶l l l 和i 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究3 、对r n a 聚合酶i i i 转录定位的预测及依据随着新技术和新方法的不断涌现。与r n a 聚合酶i i i 转录相关的研究相继取得了一系列的结论，这些结论为r n a 聚合酶i 转录定位的预测提供了理论依据。根据前人对r i g a 聚合酶h i 转录产物以及与转录产物发生相互作用的蛋白质因子的研究，我们推测，r n a 聚合酶i i i 的转录具有发生在核仁内的可能性。依据之一，t r n a 前体和r n a s gp 在细胞核中的定位。t r n a 是r n a 聚合酶i i i 的主要转录产物之一，其最初的转录产物( p r e - t r n a ) 也需要经过加工剪接和核苷酸修饰的过程，而r n a s cp 则是负责这一过程的主要酶类。b e r t r a n d 等人利用荧光标记技术对t r n a 前体的加工途径进行了研究和探讨 3 8 1 。他们利用与t r n a 基因( 含内含子) 同源的荧光标记探针对t r n a 和t r n a n p 的转录前体进行原位检测，结果发现荧光信号绝大部分来自于酵母细胞核的核仁区域。作为对照，他们还利用与成熟t r n a 基因( 不含内含子) 同源的探针检测，结果如预期所料，荧光信号主要在胞质和核质中出现。利用同样的方法，他们还对r n a s ep 中的r n a 成分进行了检测，结果也证实该成分存在于核仁中。综合以上结果，b e r t r a n d 等人得出结论，t r n a 前体的加工过程是在核仁内完成的。在b e r t r a n d等人利用核酸杂交方法证明r n a s ep 的r n a 成分在核仁区域以后，j a r r o u s 等人利用g f p 与r n a s ep 的蛋白亚基形成的融合蛋白对其中的3 种亚基成分r p p l 4 、2 9 、3 8 进行了追踪定位，结果这3 种亚基成分都在核仁内被发现【3 9 1 。同时，生化分析还表明核仁内的r n a s e p 复合物具有着很强的催化活性。综合以上结果来看，t r n a 前体的加工过程无疑是在核仁内依靠r n a s ep 指导完成。依据之二，u 6sn r n a 和s r pr n a 的体内观察。u 6s n r n a 和s r pr n a都是r n a 聚合酶i 的转录产物。u 6s n r n a 是m r n a 剪接体的重要成分，s r pr n a 则是信号识别颗粒的重要组分。u 6s n r n a 在转录后还需要进行2 - o 一甲基化和假尿营化的核苷酸修饰。已经有实验证实，u 6s n r n a 转录后的加工修饰过程是在核仁内完成的【4 0 4 1 4 2 1 。同时，l a n g e 和g e r b i 利用显微注射的方式将外源标记好的u 6s n r n a 注入非洲爪蟾的卵母细胞中，在核仁内立刻发现了荧光信号的存在，随后荧光信号逐步减弱并向核质方向扩散【4 3 1 。该实验结果直观地向人们揭示u 6s n r _ n a 韵成熟或发挥正常的生物学功能必须要经过核仁区域的加0r n a 聚台酶i i i 和i 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究工程序，然后才被分派出去。与此同时，有人对s r p r n a 作了同样的研究【”1 。标记好的s r pr n a 经显微注射注入鼠肾上皮细胞以后，也表现出同样的运动行为先是在核仁内短暂聚集然后逐步向外消散。结合信号识别颗粒中的蛋白亚基成分也在核仁内出现的实验现象，因此人们推测信号识别颗粒的组装成熟很有可能就是在核仁内完成的 4 4 , 4 5 1 。依据之三，l a 蛋白的研究。l a 蛋白是与r n a 聚合酶i i i 转录产物发生相互作用的一类重要的蛋白质因子。它在转录产物产生以后会很快与之结合，并作为分子伴侣陪伴其走完加工、折叠和运输的过程【4 ”。l a 蛋白对r n a 聚合酶i i i 转录产物3 端形成的o l i g o ( u ) 舯- 着高度的亲和力【4 7 】，这样l a 蛋白也就成为了其转录产物产生后所结合的第一个蛋白质因子，因此l a 蛋白在细胞核中的存在位置也可以间接地反应出r n a 聚合酶的转录位点。已经证实l a 蛋白与多种r n a 聚合酶i i i 的转录产物存在着联系，如p r e t r n a 、u 6s n r n a 、r n a s epr n a等。同时有证据显示，l a 蛋白也存在于核仁区域内4 8 , 4 9 1 。这一实验结果正好与前面所提到的p r e t r n a 、r n a s epr n a 、u 6s n r n a 和s r pr n a 等在核仁出现的实验结果形成了统一。核仁内的l a 蛋白很有可能是在r n a 聚合酶i i i 的转录产物产生后与之结合，并介导其向外运输的过程。4 、本课题组的初步结论本课题组从2 0 0 0 年开始对r n a 聚合酶i i i 的转录位点开展研究 5 0 , 5 ”。实验以c h o 和h e l e 细胞为实验材料，使用己构建好的可以为r n a 聚合酶i i i 所识别并启动转录的5 sbg 3 质粒，利用基因转染、荧光原位杂交并结合激光共聚焦显微镜观察的方法，对r n a 聚合酶i 的转录位点迸行了研究探讨。现已初步得出r n a 聚合酶i 转录发生在核仁及其周边区域这一结论，但尚有待于进步论证。因为r n a 聚合酶i 所负责转录的基因很多，以前研究中所涉及的仅仅是其中的一种基因类型。因此要全面正确地说清楚r n a 聚合酶i 在真核细胞中的活性位点，还要对其它的基因类型展开研究和探讨，如v ar n a 基因的转录等。r n a 聚合酶i 转录位点研究真核生物r n a 聚合酶i 的转录发生在核仁中这一观点目前已为大多研究工r n a 聚合酶l n 和l 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究作者所公认【】。对r n a 聚合酶i 转录位点的研究始于上个世纪六、七十年代【5 2 l ，研究方法主要也是以电子显微镜放射自显影和免疫标记定位为主，但都存在着一定的局限性。最初人们应用3 h 脉冲标记4 5 sr r n a 前体，利用电镜放射自显影进行观察并得出转录发生在核仁内的结论1 5 2 , 5 3 l 。但由于当时并不清楚r d n a 的转录速度如何。因此不能确定这个结果代表的是真正的转录位点还是转录产物的功能位点。8 0 年代以来。人们采取直接定位r n a 聚合酶i 、r d n a 或r d n a 的转录因子( 如u b f ) 的方法对r n a 聚合酶i 的转录位点进行研究 5 4 , 5 5 j 引。但由于在通常状况下细胞内约有5 0 以上的r n a 聚合酶i 不参与转录的过程，而且r d n a 上通常存在大量非转录的间隔区域，因此这种研究方法得出的结论并不定是r n a 聚合酶i 的活跃转录位点。9 0 年代后，人们又采用b r u t p 脉冲标记经渗透处理的细胞中的转录子，这个方法可以检测到原初转录产物的位置，但实验中涉及渗透化处理等方法会引起细胞中核仁的解聚，同时对聚合酶的转录起始和r n a 链的延伸也有影响【5 7 堋。因此仍有必要探索新的研究手段以对完整的、有活性的的细胞中r n a 聚合酶i 的确切转录位点进行研究探讨。四、本实验的研究内容及意义本实验的主要任务是继续对r n a 聚合酶l 的转录位点进行深入研究。分别选取具有5 s 启动子和v a 启动子的外源质粒为实验材料，质粒经电击转染入c h o 后，将会在启动子的引导下到达r n a 聚合酶i 的转录活性区并为其所识别，从两启动质粒上真核基因的转录。因此细胞固定以后，利用与质粒和真核基因同源的荧光探针分别进行d n a 水平和r n a 水平上的原位杂交检测，获取杂交后的荧光信号结果。与质粒同源的探针杂交信号可表明该质粒在细胞中所处的位点，进而可以推断r n a 聚合酶m 转录活性位点的位置。丽与真核基因同源的探针杂交结果则可以表明其转录子所在的位置，为判断r n a 聚合酶i i i 的转录活性位点提供佐证。本课题组以前仅使用了5 s0g 3 质粒( 包含完整5 s 启动子)作为实验材料，本次实验中我们使用了5 s m a x i 和v a t k 两种质粒。5 s m a x i 质粒中包含5 s 启动予( i 型内部启动予) 的关键序列和元件，而v a t k 质粒中包2r n a 聚合酶l i i 和【在c h o 细胞棱中转录位点及其相互关系的研究含v ar n a 基因的启动子( i i 型内部启动子) ，这样我们的实验就涉及了r n a聚合酶m 中的两种启动子类型，从而进一步增强了实验的可靠性。鉴于我们己得出r n a 聚合酶i i i 转录发生于核仁内的初步结论，我们使用这一方法对r n a 聚合酶i 的转录位点做进一步的研究论证，同时在此基础上尝试使用双探针杂交的方法探讨r n a 聚合酶i i i 和i 的转录位点之间是否存在某种关系。本课题着重探讨和解决r n a 聚合酶i 和r n a 聚合酶i 在真核细胞内的转录定位问题。真核细胞当中存在这三种不同形式的r n a 聚合酶之间决非是孤立的、没有任何联系的【5 9 , 6 0 l 。真核细胞有规律性的和协调性的生长肯定受至4 细胞内遗传信息的严格调控。r n a 聚合酶的作用活性以及彼此间的协调运作即是基因调控和表达的重要环节。通过对r n a 聚合酶m 和r n a 聚合酶i 转录定位的研究，发现和寻找它们彼此间的差异以及彼此问的联系，是我们继续研究的目的。整个实验的过程就是利用荧光原位杂交的方法获取r n a 聚合酶i i i 和r n a聚合酶i 在细胞核中的转录位点，并通过激光共聚焦显微镜获得直观可靠的实验结果。实验结果不仅可以帮助人们迸步明确认识r n a 聚合酶i i i 和r n a 聚合酶i 在动物细胞中转录位点的确切位置，而且还将有助于人们进一步认识和理解r n a 聚合酶i i i 的转录机制、其转录产物的加工运输途径、以及真核细胞当中不同的r n a 聚合酶间的组织和调控关系，使人们对于细胞核的组织和功能有个全面而又正确的了解和认识。r n a 聚合酶l 儿和i 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究一、实验材料第二章材料与方法i 、质粒实验中涉及五种质粒：p b r 3 2 2 、p g e m - 0g 3 、5 s m a x i 、一2 1 5 0 + 2 9 2 bg 3和v a t k 。( 1 ) p g e m - 1 3g 3 质粒：在p g e m 质粒的基础上构建而来，内含真核基因bg 3片段。酶切位点图示如下：s i n a is m a lfg 3 片断( 1 8 8 1 b p )( 2 ) 5 s m a ) 【i 质粒：在p b r 3 2 2 质粒的基础上构建而来，n 台- 5 sr r n a 基因的5 s 启动子。酶切位点图示如下：t t i n d b m p v n i t一4 8i+ 1 1 5ii5 s 启动子与p b r 3 2 2 n 源的片断( 1 s 9 2 b p )( 3 ) v a t k 质粒：在p b r 3 2 2 质粒的基础上构建而来，内含v a r n a 基因的v a 启动子和胸腺激酶基因片断( t k ) 。酶切位点图示如下：1 3 a lig a m ml - - l i n di l l原核启动子( 2 5 6 7 b p ) 【基因( 1 7 0 0 b p )( 4 ) 2 1 5 0 + 2 9 2 t 3g 3 质粒：在p b r 3 2 2 质粒的基础上构建而来，内含r d n a 基因的启动子和增强子及真核基因bg 3 片段。酶切位点图示如下：e c o r lp 张i ir d n a 基因的息鞠子秘增强子口g ，片断( 1 8 8 1 卸)1 4r n a 聚合酶i i i 和l 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究质粒一2 1 5 0 ，+ 2 9 2 ，p g 3 、5 s m a x i 、v a t k 、p g e m 1 3g 3 由美国j o l l i l s h o p k i n su n i v e r s i t y 的b a r b a r as o l l n e r - w e b b 教授赠送。质粒p b r 3 2 2 购自华美公司。使用q i a g e n 公司质粒大量提取纯化试剂盒制备。2 、细胞株中国仓鼠卵巢细胞株( c h o ) 由军事医学科学院赠送3 、试剂盒质粒大量提取纯化试剂盒( 购自q i a g e n 公司)地高辛标记缺口翻译系统d i g - n i c k t r a n s l a t i o n ( 购自r o c h e 公司)生物素标记缺口翻译系统b i o t i n - n i c kt r a n s l a t i o n ( 购自r o c h e 公司)t a k a r ad n a 回收纯化试剂盒( 购自t a k a r a 公司)4 、d n a 工具酶p s t i 、p v u i i 、s m a i 、b a m h i 、e c o r i 和h i n d 等( 购自t a k a r a 公司)5 、细胞培养用品d m e m 、胰蛋白酶( 购自华美公司)胎牛血清( 购自北京元亨圣马生物技术研究所)6 、染料及抗体p i 、d a p i ( 购自s i g m a 公司)抗地高辛抗体( 购自r o c h e 公司)t e x a s r e d ( 购自r o c h e 公司)二、实验方法1 、质粒的转化和制备1 1 制备感受态的大肠杆菌d h 5a( 1 ) 挑一单菌落，接种子5m l 不含抗生素的液体l b 培养基中。3 t c 振摇过夜。( 2 ) 按1 ：1 0 0 的比例将过夜培养物转接至5 0m 不含抗生素的液体l b 培养基中，3 7 振荡培养至o d 5 为0 4 - 0 5 左右。( 3 ) 将培养物冰浴1 0 分钟，4 c 下4 0 0 0r p m 离心1 0 分钟，收集菌体置于r n a 聚合酶i l i 和l 在c h o 细胞核中转录位点及其相互关系的研究冰上。( 4 ) 弃上清，用吸水纸吸干水，用1 0 m l b ( 预冷的0 1 m o l 的c a c l 2 重悬沉淀。( 5 ) 4 c ，5 0 0 0 r p m 离，l q o m i n ，弃上清，再力n 2 m l 冰预冷的0 1 m o l 的c a c l 2 重悬菌体。( 6 ) 置4 用于转化，若不转化，则加2 0 的甘油，2 0 0 u j 分装，7 0 。c 保存。1 2 质粒的转化( 1 ) 取一装有2 0 0 9 l 感受态的e p p e n d o r f 管，加入质粒1 0 9 l ，混匀，冰浴3 0 分钟。( 2 ) 4 24 c 热击9 0 秒，然后迅速置于冰上。( 3 ) 加入8 0 0 k t ll b 液体培养基，混匀，3 76 c 温育4 5 分钟。( 4 ) 取2 0 0 m 上述混合液均匀涂布于含适量抗生素的固体l b 培养基上。( 5 ) 倒置，3 7 培养过夜。1 3 碱裂解法小量提取质粒s o l u t i o ni ：5 0m mt r i s - h c l ( p h8 。0 ) ，1 0m me d t a ( p h8 o )s o l u t i o ni i ：0 2mn a o h ，1 s d s ( 现用现配)s o l u t i o ni l i ：6 0m lk a o ，11 5m lh a c ，2 8 5m lh 2 0( i ) 取1 5m l 的新鲜菌液于l 。5m l 的e p p e n d o r f 管中，1 2 0 0 0r p m 离心1分钟，弃去上清液，收集菌体。( 2 ) 加入1 0 0 9 l 的s o l u t i o ni ，剧烈振摇，充分悬浮菌体。( 3 ) 加入2 0 0 9 l 的s o l u t i o n ，轻柔倒转几次，使液体澄清。( 4 ) 加入1 5 0 i _ t l1 的s o l u t i o ni i i ，将e p p e n d o r f 管倒转几次，充分混匀内容物。然后置于冰浴中。( 5 ) 1 2 0 0 0r p m 离心1 0 分钟，将上清液转入一千净的e p p e n d o r f 管中。