（遗传学专业论文）短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因启动子的功能研究.pdf

图片目录 正文 图1 大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体p s u g v 4 的物理图谱8 图2 质粒p s u b p a p 的物理图谱。 图3p m d l 8 - t 载体的物理图谱 图4 1 a - p c r 扩增碱性叠白酶基因启动子的凝胶电泳2 3 图5 短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列及推测的氨基酸序列。 图6 短小芽孢杆菌u n 3 1 c - 4 2 碱性蛋白酶基因p c r 扩增产物“2 6 图7 碱性蛋白酶基因a t g 上游序列的分析2 7 图8 启动子上游开放阅读框编码的氨基酸序列比对结果2 8 图9 短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因启动子核苷酸保守序列分析2 9 图】o 启动子p a p r 序列的同源分析 图1 l 表达质粒p s u b p w a p 的构建3 1 图1 2 重组子p s u b p w a p 的凝胶电泳一3 2 图1 3 重组子p s u b p w a p 经b a m hi - p s tl 酶切的凝胶电泳。3 2 图1 4 碱性蛋白酶基因表达产物的s d s - p a g e 3 4 图1 5 碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌w b 6 0 0 中的表达曲线3 5 图1 6 启动子p a p r 的顺序缺失 3 7 图1 7a ：p c r 扩增1 6 sr d n a 结，b ：重组质粒p m d l 6 s 。4 0 图1 8 短小芽孢杆菌1 州- 3 1 - c - 4 2 的1 6 sr d n a 序列 图1 9p c r 扩增卡那霉素抗性基因结果 图2 0 整合载体构建示意图 4 1 4 2 图2 l 启动子1 0 区上游的t g t r 模型4 6 综述 图1 不同的突变对启动子转录效率的影响6 0 图2r n a 聚合酶与启动子结合示意图6 8 w 表格目录 正文 表1 碱性蛋白酶基因表达质粒在枯草芽孢杆菌w b 6 0 0 中的表达 表2 碱性蛋白酶基因表达质粒在短小芽孢杆菌u n 一3 1 - c 珥2 中的表达3 6 表3 启动子顺序缺失的表达质粒在枯草芽孢杆菌w b 6 0 0 中的表达3 8 综述 表1 大肠杆菌的不同s 因子识别不同的共同顺序6 9 表2 枯草杆菌的s 因子及其相应启动子的共同顺序7 0 表3 在启动子处影响r n a 聚合酶功能的调节蛋白。7 2 表4 真核生物3 种r n a 聚合酶的比较7 4 v 四川大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师王海燕副教授指导下进行的研究 工作及取得的科研成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在 jj i 大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川大学所有，特此声明。 导肌粥t 硕士生：求玩希1 豇 2 0 0 6 5 2 4 四川大学硕士学位论文 短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因启动子的功能研究 专业：遗传学 硕士生：杨春晖指导教师：王海燕副教授 摘要 短小芽孢杆菌u n 3 1 - c - 4 2 是一株产生具有脱毛功能的碱性蛋白酶的菌株。 该菌株的碱性蛋白酶基因编码区已被克隆，本研究通过嗍l p c r ( t h e r m a l a s y m m e t r i ci n t e r l a c e dp c r ) 扩增得到碱性蛋白酶基因编码区上游的启动子片段 p a p r ，经测序、序列拼接及比对分析等对p a p r 进行了鉴定。该启动子片段长7 9 7 b p ，在片段的5 端存在一个开放阅读框，可能为磷酸甘油酸变位酶基因的部分 编码区，故碱性蛋白酶基因启动予的长度为3 7 8b p 。通过对启动子序列的分析， 推测出了该启动子的保守序列及转录起始位点。对启动子的顺序缺失研究证实 基因起始密码子上游1 6 0 b p 的d n a 片段包含完整的启动功能片段。 根据p a p r 序列设计引物，从短小芽孢杆菌u n 3 1 一c - 4 2 基因组中扩增获得 了包含启动子、信号肽、前肽、成熟肽及终止子的完整的碱性蛋白酶基因片段 w a p 。将w a p 插入大肠杆菌一芽孢杆菌穿梭质粒载体p s u g v 4 中，构建了碱 性蛋白酶基因表达质粒p s u b p w a p 。将p s u b p w a p 分别转入大肠杆菌j m l 0 9 、 枯草芽孢杆菌w b 6 0 0 以及短小芽孢杆菌u n 3 1 c 4 2 中进行表达。包含了质粒 p s u b p w a p 的大肠杆菌j m l 0 9 细胞内外均检测不到碱性蛋白酶活性。在枯草 芽孢杆菌w b 6 0 0 中的表达则可在胞外检测到碱性蛋白酶活性，证明启动子p a p r 可在枯草芽孢杆菌中启动碱性蛋白酶基因的表达，产生的碱性蛋白酶活性最高 达到4 6 6 5u m l ，与包含b p 5 3 启动子的碱性蛋白酶基因表达质粒p s u b p a p 比 四川大学硕士学位论文 较，酶活提高2 倍。p s u b p w a p 在短小芽孢杆菌u n 一3 1 c 4 2 中也能表达产生 碱性蛋白酶活性，但宿主菌的蛋白酶产量并未提高。 利用细菌的1 6 sr d n a 通用引物从短小芽孢杆菌u n 3 1 c - 4 2 基因组中扩增 到1 6 sr d n a 片段，将该片段插入载体p m d l 8 - t 中，构建了重组质粒p m d l 6 s 。 从载体p s u g v 4 中扩增到卡那霉素抗性基因片段，与碱性蛋白酶基因一同插入 质粒p m d l 6 s 的1 6 sr d n a 片段中，构建整合型质粒。拟将该质粒整合至短小 芽孢杆菌基因组，提高其蛋白酶产量。 关键词：碱性蛋白酶基因，启动子，t a i l - p c r ，短小芽孢杆菌，枯草芽孢杆 菌 四川大学硕士学位论文 s t u d yo ft h en a t i v ep r o m o t e r o f a l k a l i n ep r o t e a s e g e n ef r o mb a c i l l u s p u m i l u s m a j o r ：g e n e t i c s c a n d i d a t e ：c h u n - h u iy a n gt u t o r ：h a i y a hw a n g a b s t r a c t b a c i l l u sp u m i l u su n 一3 1 c - 4 2i sas t r a i nw h i c hp r o d u c e sa l k a l i n ep r o t e a s e w i t hd e h a i r i n gf u n c t i o n t h en a t i v ep r o m o t e ro fa l k a l i n ep r o t e a s eg e n e ，p a p r , w a s c l o n e db yt a i l p c rf r o m 最p u m i l u su n - 3 1 一c 一4 2 t h r o u g hb l a s ta n a l y s i s t h e s e q u e n c e o fp r o m o t e rp a p rw a sc o n f i r m e da n dt h ec o n s e r v e ds e q u e n c e sw e l e d e d u c e d t h ep r o m o t e rw a s3 7 8b pi nl e n g t h ，a n dap h o s p h o g l y e e r a t em u t a s eg e n e w a sl o c a t e da tt h eu p s t r e a mr e g i o no fp r o m o t e rp a p r d e l e t i o na n a l y s i so fp a p r r e v e a l e dt h a tt h ep r o m o t e ro f1 6 0b pc o u l di n i t i a t et h et r a n s c r i p t i o no fa l k a l i n e p r o t e a s eg e n e t h ea l k a l i n e p r o t e a s eg e n e ，i n c l u d i n gp r o m o t e r , t h ec o d i n gr e g i o n o f p r e p e p t i d e ，p r o p e p t i d e a n dm a t u mp e p t i d e ，a n dt e r m i n a t o r , w a si n s e r t e di n t o p s u g v 4 ，a ne s c h e r i c h i ac o b - b a c i l l u ss u b t i l i ss h u t t l ev e c t o r t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp s u b p w a pw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ij m l 0 9 b s u b t i l i sw b 6 0 0a n d b p u m i l u su n - 3 l c 4 2 r e s p e c t i v e l y e x p r e s s i o no fa l k a l i n ep r o t e a s eg e n ei np s u b p w a p i ne c o l ij m l 0 9d i dn o t r e s u l ti nd e t e c t a b l ee x t r a c e l l u l a ra n di n t r a c e l l u l a rp m t e a s ea c t i v i t y b u ti te x p r e s s e d a c t i v ee x t r a c e l l u l a rp r o t e a s ei nb s u b t i l i sw b 6 0 0a n d & p u m i l u su n 一31 - c - 4 2 t h e e n z y m a t i ca c t i v i t yo fr e c o m b i n a n t si n 丑s u b t i l i sw b 6 0 0w a s4 6 6 5u m 1 i tw a s t w i c em o r et h a nt h a to f p l a s m i dp s u b p a pw h i c hw a su n d e rt h ec o n t r o lo f p r o m o t e r b p 5 3 t h ee n z y m a t i ca c t i v i t yo f p s u b p w a pi n 丑p u m i l u su n - 3 1 一c - 4 2a c h i e v e d 3 四川大学硕士学位论文 3 9 6 0u m 1 b u ti tw a ss t i l l l o w e rt h a nt h eh o s ts t r a i n t h e1 6 sr d n a w a sc l o n e df r o mg e n o m eo f kp u m i l u su n 一3 1 c 4 2b yp c r t h ef r a g m e n to f1 6 sr d n aw a si n s e r t e d i n t ov e c t o rp m d l 8 - t ，c o v e t i n g r e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d l 6 s t h ef r a g m e n t so fa l k a l i n e p r o t e a s eg e n e a n d k a n a m y e i n - r e s i s t a n tg e n ew e r ei n s e r t e di n t o1 6 sr d n ai np m d l 6 s t h er e c o m b i n a n t w i l lb ei n t e g r a t e di nt h ec h r o m o s o m eo fa p u m i l u su n 31 - c - 4 2t oi n c r e a s et h e y i e l do f a l k a l i n ep r o t e a s e k e yw o r d s ：a l k a l i n ep r o t e a s eg e n e ，p r o m o t e r , t a i l - p e r , b a c i l l u ss u b f i l i s , b a c i l l u s p u m i l u s 4 四川大学硕士学位论文 1 引言 我国是世界皮革生产大国，制革业在我国发展势头迅猛，皮革工业出口连 续6 年居轻工业首位。但同时制革业环境污染问题令人瞩目。目前我国制革行业 年排放废水l 亿吨左右，在各轻工行业中仅次于造纸和食品酿造业。制革业的污 染主要来自于脱毛过程，传统的“灰碱法”脱毛所使用的的石灰一硫化物所生 成的废弃物是造成皮革工业污染的主要原因。实践证明，用酶法脱毛替代石灰 硫化钠脱毛不仅能消除硫化物污染，脱下的毛还可以回收利用，废液中富含 的蛋自质还可以做肥料，对推动制革业的可持续发展具有重要的意义闭。 酶法脱毛主要是指在脱毛过程的浸灰操作中，使用蛋白酶替代大部分传统 工艺中大量使用的石灰及硫化钠。这些蛋白酶可以直接通过毛皮的肉面或粒面 进入皮中，水解毛鞘、毛球周围的粘蛋白、类粘蛋白以及基膜组织周围的蛋白， 从而破坏毛鞘与毛囊、毛球与毛乳头之间的联接，使毛与表皮松解而达到脱毛 的效果。由于浸灰操作中的条件多为碱性，因此酶法脱毛中所用的酶主要是碱 性蛋白酶。 碱性蛋白酶指最适p h 值在碱性范围内可水解蛋白质肽键的酶类【i 引，最早发 现于猪胰脏中。1 9 1 3 年r o h m 首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用，1 9 4 5 年瑞士 的d r j a a g 等发现了微生物碱性蛋白酶 2 2 , 3 9 ，近年来对碱性蛋白酶的研究更加广 泛【1 2 1 。用于碱性蛋白酶的生产菌主要是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及短小芽 孢杆菌，如由邱秀宝等人筛选到的嗜碱性短小芽孢杆菌( a l k a l i p h i l i cb a c i l l u s p u m i l u s ) 【1 0 1 ，由徐子渊等育种的地衣芽孢杆菌2 7 0 9 菌株( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s n 0 2 7 0 9 ) 等【9 1 1 】。当前国外碱性蛋白酶高产菌株的选育主要是用基因工程技术 和蛋白质工程手段进行菌种的定向选育，目的性强，而且酶结构研究也比较深 入。t s u y o s h in o n a k a 4 l 】等人研究了枯草杆菌抗氧化性及稳定性，期望能应用于 洗涤剂行业。k u n a n m e n ia d i n a r a y a n a 2 9 等人研究了枯草芽孢杆菌p e 1 1 的热稳 定性。在我国，碱性蛋白酶主要应用于洗涤、制革、食品等行业。目前我国洗 涤行业中加酶洗涤剂已占9 0 以上，且占有率有上升趋势【l4 1 。碱性蛋白酶在皮 革脱毛中的应用也有了一些进展，李志强等研究开发了以铬交联胶原为活性载 体的亲和层析技术，并利用该项技术首次实现了2 种制革酶制剂分离纯化和组分 确定，进一步研究开发出了无胶原酶的脱毛酶一“安全脱毛酶”；国外有人进行 四川大学硕士学位论文 过猪皮酶脱毛的研究，并进行过大生产应用。波兰w j o n c z y k 等人建立了酶脱毛 过程的数学模型，通过数学模型找出了高活力的胰蛋白酶的最佳工艺条件；丹麦 诺维信公司浸灰酶产品在p h 值8 1 2 范围内，具有较高的活力，而在硫化钠石灰 液中4h 内具有较高的稳定性，适合在脱毛过程中使用1 6 j 。 但酶法脱毛目前也存在一些问题，制约了它在工业上的应用。微生物产生 的蛋白酶大多组分复杂，活力不稳定；组分中含有能破坏生皮胶原的胶原水解 酶，在脱毛过程中使用不当，即会造成皮革质量低劣，甚至出现烂皮事故等； 还有一个重要的原因就是生产菌株的蛋白酶产量低，酶制剂价格昂贵。这些因 素使蛋白酶的大规模应用受到了极大地限制。利用基因工程的方法克隆碱性蛋 白酶基因，构建高效表达的基因工程菌是解决这些问题的一个可能途径。 为了大幅度提高目的基因的表达水平，采用一个强启动予启动目的基因的 表达是一个有效的方法【l 引。启动子一般可分为两类：一类是r n a 聚合酶可以 直接识别的启动子，另一类启动子在与r n a 聚合酶结合时需要蛋白质辅助因子 的存在。原核生物的启动子多属于前一类。无论是原核生物还是真核生物，启 动子是控制转录起始的序列，它决定着某一基因的表达强度。 细菌基因的启动子通常具有一些特定的结构保守区，如：p r i b n o w 序列，- 3 5 序列和c a p c a m p 结合位点等。这些结构保守区在不同细菌中序列组成有所不 同，但功能相近。结构保守区中碱基的变化会影响r n a 聚合酶的识别与结合， 从而影响转录水平的高低，所以基因启动子有强启动子和弱启动子之分。强启 动子能够提高目的基因的转录效率，从而获得高效表达的目的产物。在芽孢杆 菌中已经有一些强启动子被克隆及鉴定，并得到了广泛的应用。如w o n g 4 2 等人 利用p 4 3 启动子表达b 内酰胺酶基因，表达的酶活性比该基因自身启动子提高 了1 8 倍；m e l v i l l e t 3 5 】等利用报告基因且葡萄糖苷酸酶基因( g u s a ) 检测c p e 启动 子，其产量比原启动子提高t 3 倍。此外常用的启动子还有s a c b 启动子【4 剐等。 本实验室曾从富含蛋白质的成都市生活垃圾中分离筛选到一株碱性蛋白酶 产生菌短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) b a ( 0 6 ) 降”】，b a ( 0 6 ) 菌株经紫外线、 亚硝基胍等反复诱变得到一株碱性蛋白酶高产菌株丑p u m i l u su n 3 1 - c 4 2 ，蛋 白酶产量达到4 0 0 0u m l ，该菌株的发酵液脱毛效果很好，且胶原水解活性很 低。黄庆等 4 1 已从该菌发酵液中分离纯化了能够独立完成脱毛过程的碱性蛋白 6 四川大学硕士学位论文 酶d h a p ，并从丑p u m i l u s u n 3 1 c 一4 2 的基因组中克隆到碱性蛋白酶基因( 命 名为a p ) 。克隆得到的基因含有完整的转录起始位点、编码区序列和终止予结 构，但它的启动子部分是不完整的。潘皎等利用启动子探针型载体筛选短小芽 孢杆菌的基因启动子，将其中的b p 5 3 片段插入a p 基因上游，构建了重组质粒 p s u b p a p ，该质粒在枯草芽孢杆菌w b 6 0 0 中可成功表达碱性蛋白酶基因。但 与出发菌株相比，p s u b p a p 表达产生的蛋白酶活性非常低。由此推测短小芽孢 杆菌碱性蛋白酶基因自身的启动子对其高效表达起到重要作用。 本论文采用t a i l p c r t 3 0 方法从短小芽孢杆菌基因组中克隆到碱性蛋白酶 基因自身的启动子，对该启动子进行了比对分析。从基因组中扩增得到完整的 碱性蛋白酶基因，构建重组质粒p s u b p w a p ，研究了碱性蛋白酶基因在自身启 动子调控下在不同宿主菌中的表达。 四川大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌株 大肠杆菌j m l 0 9 ：基因型为f t r a d 3 6p r o a b + l a c l q a c z m 1 5 r e c a l e n d a lg y r a 9 6t h ih s d r l 7s u p e 4 4r e l a l a ( 1 a c - p r o a b ) m c r a ，本室保存。 枯草杆菌w b 6 0 0n p r e ，a r p a ，e p r ，b p f , 聍矿，n p r b ，c m r ，用于碱性蛋白 酶基因的表达，由加拿大c a l g a r y 大学d r w o n g 惠赠。 短小芽孢杆菌( b p u m i l u s ) u n - 3 1 c - 4 2 ：自成都市生活垃圾分离、诱变所 得，其分泌的蛋白酶有良好的脱毛效果，且胶原水解活性极低。 2 1 2 质粒 p s u g v 4 ：6 4 k b ，k a n ta p rl a c za ，e c d ，f 丑s u b t i l 西穿梭载体( 图1 ) ，由 本实验室构建，其多克隆位点区与p u c l 8 的多克隆位点区相同”。 es ik s mb x bsps ph o k j _ 一l o l 二七 、 图1 大肠杆菌一枯草杆菌穿梭载体p s u g v 4 的物理图谱 b b a m h i ；e e c o r l ；h h i n d l l i ；k k p n l ；e 朋i ；s s a i ； s i s a c i ；s p 跏i ；s m s m a l ；x b x b a l o r i + 为且s u b 盯l i s 复制起点，o r i 一为ec o l i 复制起点；a p r 为用于大肠杆菌的氨苄青霉 素抗性基因；k a n 为用于枯草杆菌的卡那霉素抗性基因 p s u g v 5 ：多克隆位点区方向与p s u g v 4 相反，其余与p s u g v 4 完全相同。 四川大学硕士学位论文 p s u b p a p ：7 6k b ，k a n a p r ，碱性蛋白酶基因的表达质粒，由潘皎构建3 弭 ( 图2 ) 。 围2 质粒p s u b p a p 的物理图谱 b p 5 3 ：短小芽孢杆菌启动子：a p ：短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因编码区；t ：短 小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因终止子片段 p m d l 8 - t ：是一种高效克隆p c r 产物的专用载体，购自宝生物公司，用于 碱性蛋白酶基因整合载体的构建( 图3 ) 。 9 四川大学硕士学位论文 绣孓 埯夕隰$ t p n t ：嚣：7t ：嚣嚣；：f r c ：l o n 岫 图3p l v l d1 8 - t 载体的物理图谱 2 1 3 培养基 2 1 3 1i b 、s o b 、s o o 培养基 l b 培养基( 1 0 0 0 m l ) ：胰蛋白胨l o g ；酵母粉5 9 ：n a c l1 0 9 ； 6 6 m l1 m o l ln a o h 调p h 到7 5 s o b 培养基( 1 0 0 0m l ) ：胰蛋白胨2 0g ；酵母粉5g ；n a c lo 5 8 9 ；k c l o 1 9 9 ； * 1 0 0 x m 矿1 0 m l力1 3 m ll m o l l n a o h 调p n 到7 0 1 0 0 m g * ( 1 0 0 m l ) ：m g c h 6 h 2 0 o 3 3g ； m g s 0 4 7 h 2 02 4 6 5g s o c 培养基( 1 0 0 0m l ) ：s o b + 2 0 m m o l l 葡萄糖 2 1 3 2 枯草芽胞杆菌发酵最适培养基 2 5 可溶性淀粉，l 大豆蛋白胨，o 5 酵母膏，0 , 5 n a c l ，加热溶化后 四川大学硕士学位论文 调d h 值至7 5 。适合枯草芽孢杆菌w b 6 0 0 发酵。 2 1 3 3 短小芽胞杆菌发酵最适培养基( 1 0 0 0m l ) 麸皮 2 5 黄豆粉( 或水解液) 2 0 酵母膏 3 k 2 h p 0 4 4 n a h 2 p 0 4 0 4 c a c 0 3 3 2 1 3 4 芽胞杆菌转化培养基( 1 0m l ) 1 0 p c0 9 2m l ( 1 0 p c ：k h 2 p 0 4 4 4m m o l l ，k ：i - i p 0 46 0m m o l l ，柠檬酸三钠3 0 m m o l l ) 2 2 m g m l 柠檬酸铁铵 5g l 0 5m o f l 天冬氨酸钾0 2 4m l 5 m g r a l 色氨酸 0 1 m l 5 0 葡萄糖 o 1 m l lm o l l m g s 0 4 3 0g l d d h ：o 8 6 m l 2 1 3 5 牛奶培养基 1 2 固体l b 与脱脂牛奶分别灭菌后混合，脱脂牛奶终浓度为1 2 1 。4 溶液和缓冲液 2 1 4 1 溶液i l 葡萄糖，5 0m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，2 5m m o l lt d s - h c l ( p h 8 0 ) 2 1 4 2 溶液1 1 0 2m 0 1 ln a o h ，1 s d s 四川大学硕士学位论文 2 1 4 3 溶液| i l 3m o l lk a c ( p h 4 8 ) 2 1 4 4t b 缓冲液 2 5 0m m o l lk c l ，5 5m m o i lm n c l 2 ，1 5m m o v lc a c l 2 ，1 2 5m m o l lk m e s p n 6 7 2 1 4 5 硼砂- n a 0 h 缓冲液( p i t 9 6 ) 0 0 5 m o l l 硼酸钠5 0 m l 5m l 加水至终体积2 0 0m l 。 2 1 4 6 0 4m o i 几三氯乙酸溶液 5 5 8g 三氯乙酸加水至1 0 0m l 2 1 4 72 水解酪蛋白 2 9 酪素溶解于1 0m l0 2 m o l ln a o h 溶液中，放置过夜。加入5 0m l 硼 砂- n a o h 缓冲液( p h 9 6 ) ，反复加热至沸腾，直至酪素完全溶解。冷却后用 0 2m o l ln a o h 调节至p h 9 6 ，加硼砂- n a o h 缓冲液定容至1 0 0m l 。 2 1 4 8 聚丙烯酰胺母液 3 0 丙烯酰胺，o 8 亚甲双丙烯酰胺 2 1 4 94x t r i s - c i ，s d s ( p h8 8 ) 在3 0 0 m l h 2 0 中溶解9 1 9 t r i s 碱( 1 5m o f l ) ，用lm o l l h c l 调节p h 值至8 8 ，补加h 2 0 至5 0 0 m l 。再加入2 9s d s ，于4 c 可以保存1 个月。 2 1 4 1 0 4 x t r i s - e l ，s d s ( p h 6 8 ) 在4 0 m l h 2 0 中溶解6 0 5g t r i s 碱( o 5 t o o l l ) ，用1 m o l l h c i 调节p h 值 至6 8 ，补加h 2 0 至1 0 0 m l 。再加入o 4 9 s d s ，于4 c 可以保存1 个月。 2 1 4 1 1s d s 电泳缓冲液( 5 ) r i f f s 碱 甘氨酸 1 5 1g 7 2 0g 1 2 四川人学硕士学位论文 s d s 5 0 9 加去离子水至1 0 0 0 m l ，使用前稀释至l x s d s 电泳缓冲液 2 1 4 1 2s 1 ) s 样品缓冲液( 6 ) 4 x t r i s c 1 s d s ，p h 6 8 2 5m l 甘油 2 0 ( w v ) 】 2 0m l d t t3 1g 溴酚蓝 lr a g 加去离子水至1 0 0m l 并混匀。分装并于- 2 0 ( 2 贮存 2 1 4 1 3s d s 聚丙烯酰胺凝胶的银染溶液 固定液 乙醇 5 0 ( “v ) 冰乙酸 1 0 ( “v ) h 2 0 4 0 于室温可保存一个月。 浸泡液 7 5m l 乙醇，1 7g 醋酸钠，1 2 5m l2 5 戊二醛，o 5g 硫代硫酸钠5 h 2 0 d h 2 0 定容至2 5 0 m l 银染溶液 0 2 5g 硝酸银，5 0 此甲醛，dh e 0 定容至2 5 0m l 显色溶液 6 2 5g 碳酸钠，2 5 此甲醛，dh 2 0 定容至2 5 0m l 终止反应液 3 6 5ge d t a - n a 2 2h 2 0 ，dh 2 0 定容z 罕2 5 0m l 3 四川大学硕士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1 芽孢杆菌总d n a 的提取 接种一环菌于3m ll b 液体培养基中，3 7 振荡培养过夜。取菌液2 3m l 于1 0 ，0 0 0r p m 离心3 0s c c 收集菌体，弃上清液。加入5 7 0i t l 含5m g m l 溶菌 酶的溶液i 悬浮细胞，3 7 温育3 0m i n 。加入3 0 此1 0 的s d s ，颠倒混匀至溶 液完全澄清。加入3 此2 0 m g m l 的蛋白酶k ，混匀，予3 7 温育3 0 r a i n 。用 等体积的苯酚：氯仿( 1 ：1 ) ，氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 各抽提1 次。将上清液转入一只新 e p 管中，加入1 1 0 体积的3m o l l k a e f p h 4 8 ) 和2 倍体积的无水乙醇，轻轻颠 倒混匀至絮状沉淀出现。用无菌吸头挑出絮状染色体d n a 于1m l7 0 乙醇中 漂洗，4 ，0 0 0r p m 离心3m i n ，弃上清，倒置e p 管，3 7 放置约5 1 0m i n 至乙 醇完全挥发。将沉淀溶于1 0 0p , l t e 缓冲液( 含0 tm g m l r n a s e a ) ，3 7 保 温2 0m i n 。置4 或2 0 保存。 2 2 2 大肠杆菌的转化 接一环e c o l i 受体菌于2m ls o b 中，3 7 振荡培养1 2 1 5h 。取o 5m l 培养物于5 0 m l s o b 中，1 8 ( 2 振荡培养1 8 2 4 h ，使o d 5 6 0 约为0 6 。培养物在 冰上放置1 0m i n ，倒入预冷的5 0m l 离心管中，3 ，5 0 0r p m 离心l on f i n 收集菌 体。加入1 5m l 已在冰上预冷的t b 缓冲液，混匀，冰上放置1 0m i n ，3 , 0 0 0r p m 离心5 m i n 。加入4 m l t b 缓冲液，轻轻混匀，加入2 8 0 9 l d m s o 使其终浓度 为7 。在冰上放鼍1 0m i n ，将感受态细胞分装于e p 管中，每管0 5 1m l 。 把细胞浸于液氮中至少5m i n 。取出细胞，使之在室温下融化，与已在冰上预 冷的1 1 0 md n a 混匀，冰上放置3 0m i n 。4 5 热冲击3 0 s ，在冰上放置1 - 2m i l l ， 加入o 8m ls o c ，混匀，3 7 振荡培养lh 。4 , 0 0 0r p m 离心3r a i n ，倒去约 o 8m l 上清液，将细胞和余下的上清液混匀后涂在含适当抗生素的平板上，3 7 培养过夜。 1 4 四川大学硕士学位论文 2 2 3 枯草芽孢杆菌的转化 + 接种宿主菌于2m ll b 液体培养基中，3 7 剧烈振荡培养1 2 1 6h ，将0 2 m l 培养物接于1 0m ll b 培养基中，3 7 剧烈振荡培养3 q h r 至 o d 6 0 0 。= o 9 1 0 左右。取0 2m l 此培养物加入到1 0m lm d 培养基中，然后 于3 7 培养约3 4 h 至o d 6 0 0 n 。= 1 0 左右，此时细胞进入感受态。取3 , - - 5 m l m d 培养物于1 0 0 m l 三角瓶中，加1 之u g d n a ，3 7 剧烈振荡培养1h ，加入o 3 - - - 0 5 m l1 0 x l b ，于3 7 c 剧烈振荡恢复培养1 5h ，涂布平板。 2 2 4 短小芽孢杆菌转化 接种宿主菌于2m l l b 液体培养基中，3 74 c 剧烈振荡培养1 2 1 6 h ，转种2 1 1 1 1 于5 0 m l m d 培养基中，3 7 剧烈振荡培养约4h 。4 5 0 0r p m 离心1 0 m i n 收 集菌体，倒去上清液，剩余约5m l 上清液重新悬浮菌体。于1m l 菌液用作负对 照，其余菌液加入约2 5u gd n a ，3 7 。c 剧烈振荡培养2h ，加入相应体积1 0 x l b ， 3 7 剧烈振荡恢复培养2h ，将全部菌体离心，涂布平板 2 2 5 大肠杆菌质粒的提取 接一环含质粒的e c o l i 细胞于2m ll b 液体培养基中，3 7 振荡培养1 2 1 5 h ，1 3 ，0 0 0r p m 离心o 5r a i n ，弃上清液。加入1 0 0i t l 溶液i 充分混合，置于室 温下5 m i n 。加入2 0 0 i t l 溶液i i ，轻轻混匀，冰浴5 m i n 。加入1 5 0 皿溶液i i i ， 混匀，冰浴2 0m i n 。1 3 ，0 0 0r p m 离心5r a i n ，取上清液，加入9 0 0 此无水乙醇， 静置5 m i n ，1 3 ，0 0 0r p m 离心5 m i n ，弃上清液。用7 0 乙醇洗沉淀2 次，沉淀 干燥后溶于5 0 皿d d h 2 0 中，加入2 “1 1 0 m g m l r n a s e a ，3 7 保温1 0 m i n 。 2 2 6 芽孢杆菌质粒的提取 将含有质粒的芽孢杆菌接种于2m l 的l b 培养基( 含相应抗生素) 中，3 7 c 振荡培养1 2h ，1 3 ，0 0 0r p m 离心1m i n ，加0 1m l 含1m g m l 溶菌酶的溶液i 于沉淀中，混匀后3 7 。c 静置3 0r a i n ，加入0 2m l 溶液i i ，混匀后冰浴5r a i n ， 再加入o 1 5m l 溶液i i i ，混匀后冰浴1 5m i n ，1 3 ，0 0 0r p m 离，t l , 5m i n 。取上清 四川大学硕士学位论文 液，用等体积的苯酚、苯酚：氯仿( 1 ：1 ) 、氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 各抽提1 次，加入2 倍体积的无水乙醇，混匀后静置1 5m i n ，1 3 ，0 0 0r p m 离心5m i n ，用7 0 乙醇 洗沉淀两次，干燥后溶解于d d h 2 0 中。加入r n a s e a 于3 7 c 处理3 0 r a i n 。 2 2 7 蛋白酶活性的平板检测 1 0m ll 的琼脂糖于5 5 时加入1 0m l2 的脱脂牛奶混匀倒入平板中， 静置冷却。在平板上打孔，将待测样品点于孔中，于3 7 0 保温，观察水解圈。 2 2 8 碱性蛋白酶在枯草杆菌w b s 0 0 中的发酵培养 挑取单菌落至最适发酵培养基( 分别含2 0i _ t g m l 氯霉素和卡那霉素) 中， 3 t c 培养2 4h ，按1 的接种量转种至5 0m l 发酵培养基( 装于2 5 0m l 三角 瓶中) ，3 t c ，2 0 0r p m ，连续培养4 8h 。取发酵上清液进行酶活测定。 2 2 9 蛋白酶酶活检测 发酵液经1 3 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，取上清液，采用改良的f o l i n 酚试剂显 色法测定酶活力：用硼砂- n a o h ( p h 9 6 ) 缓冲液将酶液按一定比例稀释；稀释 酶液与底物2 酪蛋白溶液分别在5 0 c 水浴中预热2m i n ；取l m l 稀释酶液 加入l m l2 酪蛋白溶液，混合后于5 0 反应1 0 m i n ；加2 m l0 4 m 0 1 l 三 氯乙酸终止反应2 0 r a i n 对照是1 m l 稀释酶液先加入2 m lo 4 m o l l 三氯乙酸， 5 0 c 反应2 0 m i n 后再加2 酪蛋白溶液，5 0 c 保温1 0 m i l l 。反应结束后将反应 液用滤纸过滤。取1m l 滤液加入5m l0 4m o l l 碳酸钠溶液，4 0 ( 2 水浴中预热 2r a i n ；加入lm lf o i l n 酚溶液，摇匀后4 0 c 水浴中显色2 0r a i n ；用分光光度 计测6 8 0r i m 光密度值。 酶活定义：以酶液在一定条件下催化酪蛋白水解，每分钟释放出1 微克酪 氨酸所需要的酶量为1 个酶活力单位，用u m l 表示。 酶活的计算公式： 蛋白酶活力( u r n l ) = o d 6 8 0 1 1 m x n x k x 4 1 0 1 6 四川大学硕士学位论文 a o d 6 8 0 。为以对照样品为空白时样品的光密度值； k 为光密度为1 o o 时所相当的酪氨酸浓度； n 为酶液的稀释倍数。 2 2 i o 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - p a g e ) 1 用2 块干净的玻璃平板和垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，固定 在灌胶支架上。 2 在2 5m l 量杯中，先后加入5 2 5m lh 2 0 ；3 7 5m l4 x 1 矗s i s d s ， p h s 8 ；6 0 0m l 聚丙烯酰胺母液( 终浓度1 2 ) ，混匀后加入o 0 5m l 1 0 过硫酸铵和o 0 1m lt e m e d 。将配好的分离胶溶液沿夹层一边的 边缘加入于玻璃夹层中。 3 分别从两边垫片往夹层中缓慢加入一层异丙醇。让凝胶在室温下聚合 3 0 6 0m i n 。 4 倾去顶层的异丙醇，并以1x t f i s c i s d s ，p h 8 8 缓冲液冲洗凝胶的顶 部表面，用滤纸吸干。 5 在2 5m l 量杯中，混匀3 0 5m l h 2 0 ；1 2 5m l 4 x t f i s c 1 s d s ，p h 6 8 ； 0 6 5m l 聚丙烯酰胺母液，混合后加入0 0 2 5m l1 0 过硫酸铵和0 0 0 5 m lt e m e d 。将配好的积层胶溶液沿夹层一边的边缘加入于玻璃夹层 中，直至离夹层的顶部约1c m 高为止。 6 将梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶溶液充盈剩 余空间。让积层胶在室温下聚合3 0 - 4 5m i n 。 7 在具螺口盖的微量离心管中，用2 x s d s 加样缓冲液按1 ：l ( v v ) 稀释待 测蛋白质样品，于1 0 0 煮沸3 - 5v a i n 。1 3 0 0 0r p m 离心5m i n 。同样缓 冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。 8 小心地拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶的加样孔。 9 将玻璃平板安装在电泳装置上，倒入l x s d s 电泳电极缓冲液，淹没凝 胶的加样孔。 1 0 微量注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，对照孔 1 7 四川大学硕士学位论文 中加入蛋白质分子量标准样品，若有空置的加样孔，须加等体积的空 白1 s d s 样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。 1 1 连接电源，先在1 0m a 恒流下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶， 再将电流调至1 5m a 至溴酚蓝到达凝胶底部为止。 1 2 关闭电源并撤去导线，弃去电极缓冲液。 1 3 在不损坏凝胶的基础上，将凝胶剥离出来并切去凝胶的一角傲上标记。 接着就可以进行蛋白质的检测。 2 2 1 1s d s 聚丙烯酰胺凝胶的银染 1 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后，用1 0 0m l 的固定液固定蛋白质，于 室温平缓摇动至少3 0n f i n 。 2 废弃固定液，加入1 0 0m l 浸泡液，室温平缓摇动3 0m a n 。 3 废弃浸泡液，用蒸馏水漂洗3 次，每次5 m i n 。 4 加入1 0 0m l