（遗传学专业论文）花椰菜抗黑腐病差异表达cdna片段的克隆.pdf

a fi 要 摘要 随着分子生物学技术的发展，世界上对植物抗病方面有了很深入的研究，克 隆到了 1 4个植物抗病基因，并对植物抗病的分子机理有了一定认识，运用了到 生产上，许多转基因植物都获得了对病原的抗性。但对黑腐病抗性的研究还很 不够，主要停留在对黑 腐病菌的研究上 ，许多参与 黑腐病菌致病作用的酶基因 得到克隆。而对于植物的抗性却很少研究，原因是没找到相应的抗性植株进行 分析。 本 研 究 采 用 天 津 市农科院蔬 菜研究 所经过 数十代杂交培 育出的 抗黑腐病近等位 基因系c 7 1 2 和 c 7 3 1 作为 材 料， 创 造性地将近年发展 起来的 较为先进的三 项技 术: 磁珠分离 真核生 物 m r :n a 技术;os m a r t - p c r c d n a合成技术: a f l p 一 银 染 法 创 造 性 地 融 合 在 一 起， 发 展了 一 项 先 进的m r n a 声显 b t 技术 技 术 ，悔技 术 有 多 态 性 强 ， 快 速 灵 敏 ， 污 染 少 ， 重 复 性 好 等 特 点 。rna-aflpm * , 作者研究了花椰菜 c 7 1 2抗黑腐病系在黑腐病菌侵染和非侵染条件下基因表达的 1清况，筛选了 2 0对引物组合，获得了 1 0 0多条差异表达的 c d a片段，并将其 中的 1 5 条特异带挖出重新扩增， 1 3 条差 杂交的办法， 将 1 3 个克隆的插入序列分 e v er s e n o r t h e r n 下花椰菜的 c d n a 探针池杂 交以 筛掉 假阳性的克 隆， 获得了两个克隆m 2 和m 6 , n o r t h e r n b l o t 和 点杂交进一步证明了m 2 不是差异表达的基因。 而m 6 是差异表达的基因， s o u t h e r n 杂交的结 果证明m 6 在花 椰菜基因组中是 单拷贝序列。 进一步用 h ., o , 胁迫处理发 现 m 6 受氏 仇诱导，在诱导早 期 1 6 h r - 2 4 h r 高度表达。 序列分析表明 m 2 编码一 个 渗 透 酶 同 源 蛋白 ， m 6 和 拟 南 芥1 号 染 色 体 的b a c f 1 9 p 1 9 中6 6 6 6 5 b p - 6 6 8 1 3 6 p 有 8 4 % 同 源性， m 6蛋白与 拟南芥的2 a 6蛋白 有 9 1 %同 源性，与番茄的氨基环 丙烷酸氧化 酶 ( 1 一 二i n o c y c l o p r o p i n e - l - c a r b o x y l a t e o x i d a s e , a a c o x i d a s e , a c o )有 7 6 % 的同源性，拟南芥的一个受乙烯诱导含 5 4个氨基酸的 d n a结合因子 ( d n a b i n d i n g f a c t o r ) 有7 0 % 同源 性，因 此 m 6 可能就是花椰菜中 2 a 6 蛋白 ， 通 过 调 节 乙 烯 合 成 来 介 导 花 椰 菜 抗 黑 腐 病。 丫 关 键词:花 椰菜， 黑腐病， 抗病墓因， m r n a - a f l p ， 乙 烯， 2 a 6 蛋白 a b s t r a c t ab s t r a c t wi t h d e v e l o p m e n t o f m o le c u l a r b i o lo g y t e c h n i q u e s , g r e a t p r o g r e s s w a s m a d e o n p l a n t r e s i s t a n c e t o d i s e a s e . 1 4 r e s i s t a n c e g e n e w e r e c l o n e d a n d s e q u e n c e d , w h i c h w i l l n o d o u b t h e lp p e o p l e t o m a k e d e e p e r u n d e r s t a n d i n g o f m o l e c u l a r m e c h a n i s m o n p l a n t d i s e a s e r e s i s t a n c e . h o w e v e r , r e s e a r c h o n b l a c k r o t is n o t e n o u g h . i n t h e p a s t r e s e a r c h m a i n l y f o c u s e d o n x a n t h o n i o n a s c a m p e t r i s p r c a m p e t r i s a n d ma n y b a c te r ia l 即 n e s w h ic h e n c o d e e n z y m e s d u r in g d is e a s e d e v e lo p m e n t w e re c lo n e d . b u t l i t t l e w a s k n o w n a b o u t p la n t r e s i s t a n c e t o b l a c k r o t b e c a u s e i t i s h a r d t o f i n d t h e r e s i s t a n c e p l a n t i n n a t u r e . a n e a r i s o g e n i c l i n e ( n i l ) o f b r a s s i c a o l e r a c e a ( l . ) v a r b o t r y t i s w it h r e s i s t a n c e a n d s u s c e p t ib i l i t y t o b l a c k r o t ，c 7 1 2 a n d c 7 3 1 , w e r e u s e d i n t h i s r e s e a r c h . t h r e e a d v a n c e d t e c h n i q u e s : l .i s o la t i o n o f m r n a u s i n g m a g n e t i c b e a n s , 2 . s m a r t - p c r c d n a s y n t h e s i s , 3 _ a f l p - s i l v e r - s t a i n i n g m e t h o d w e r e c r e a t e d i n t o a n e w d iff e r e n t ia l d i s p l a y m e t h o d : m r n a - a f l p . i t c o n t a i n s s e v e r a l a d v a n t a g e s : h i g h p o l y m o r p h i s m , q u i c k a n d s e n s i t i v e , l o w c o n t a m i n a t i o n a n d g o o d r e p r o d u c i t y . u s i n g t h i s m e t h o d a u t h o r o b t a i n e d a b o v e 1 0 0 d i ff e r e n t i a l e x p r e s s e d c d n a fr a g m e n t s i n d u c e d b y b l a c k r o t . 1 3 c d n a f r a g m e n t s o f t h e m w e r e c l o n e d . p r i m a ry s c r e e n w a s c a r r i e d b y r e v e r s e n o r t h e r n b l o t h y b r i d i z a t io n w i t h i n f e c t e d a n d c o n t r o l c d n a p r o b e p o o l s . t w o p o s i t i v e c l o n e s ， m6 a n d m2 , w e r e g o t .n o rt h e r n d o t b l o t a n d n o rt h e rn b l o t w e r e u s e d f o r f u r t h e r t e s t o f t h e s e t wo c l o n e s a n d n 1 6 w a s f o u n d t o b e d i ff e r e n t ia l e x p r e s s e d w h e r e a s m2 w a s c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s e d d u r i n g b l a c k r o t i n f e c t i o n . s o u t h e r n b l o t s h o w t ; d m6 wa s s i n g l e - c o p y g e n e i n b r a s s i c a g e n o m e . mo r e o v e r , m6 w a s a l s o h i g h ly e x p r e s s e d i n 1 6 - 2 4 h o u r s a ft e r h , o , i n d u c t i o n . s e q u e n c e o f m 2 i n d i c a t e d t h a t m 2 e n c o d e d a p e r m e a s e - l i k e p r o t e i n . m 6 h a s 8 4 % h o m o l o g y w i t h 6 6 6 6 5 6 p - 6 6 8 3 1 b p o f b a c f 1 9 p l 9 o n a r a b id o p s i s c h r o m o s o m e 1 . t h e p r e d i c t e d m 6 p r o t e i n h a s 9 1 % p o s i t i v e h o m o l o g y w i t h a r a b i d o p s i s 2 a 6 p r o t e i n w h i c h r e g u l a t e s e t 坷l e n e s y n t h e s i s , 7 6 % h o m o l o g y w it h i - a m i n o c y c l o p r o p a n e - l - c a r b o x y l a t e o x i d a s e ( a c o ) w h i c h i s t h e l a s e e n z y m e i n e t h y l e n e s y n t h e s i s , 7 0 % h o mo l o g y w i t h a n e t h y l e n e in d u c e d d n a b i n d i n g f a c t o r . t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t m 6 m a y t a k e a p a rt i n r e s i s t a n c e t o b l a c k r o t b y r e g u l a t i n g e t h y l e n e s y n t h e s i s . ke y wo r d c a m p e t r i s , br a s s i c a r e s i s t a n c e o l e r a c e a 必.夕 v a r b o t r y u s , x a n i h o n r o n a s c a m p e t r i s p v g e n e , m r n a - a f l p , e t h y l e n e , 2 a 6 p r o t e i n 成 a - 第一部分前言 植物由于缺少类似动物的血液循环系统和免疫系统，在自然环境中面临各 种微生物包括病毒、细菌、真菌，及原虫、昆虫的挑战，在漫长的共进化过程 中，植物逐步完善和发展了一套独特的防御机制来保护自己，这里既包括了非 专一性的抗性 ( b a s i c r e s i s t a n c e或 n o n - h o s t r e s i s t a n c e ) ，也有专一性的抗 性 ( s p e c i f i c r e s i s t a n c e ) 。非专一 性的抗性是指植物 对大多数病原所具有的 普遍抗性，而非对专一某种病原的抗性，如植物的角质层，细胞壁，酚类次生 代谢物及可诱导的防御反应 ( 如 s a r , i s r ) 。专一性的抗性是指植物群体在与自 然天敌 的长期进化过程中形成的专门识别某种病原致病小种的抗性，它可由一 个单一显性的抗性基因 ( r - g e n e )控制，也可能为数个基因控制 ( 数量性状) 。 抗性基因产物专一识别特定病原的无毒基因 ( a v r )产物，从而介导植物产生抗 性反应 【 1 。尽管人类对植物抗病基因及其抗性在生产上的应用做了大量的工 作，但由于一直未能克隆到植物的抗病基因，因此 9 0年代以前植物抗病的分子 生物学研究进展一直很缓慢，而 9 0年代后，由于图 谱克隆技术 ( m a p - b a s e d c l o n i n g )和转座子标签技术 ( t r a n s p o n s o n t a g g i n g t e c h n i q u e )的应用， 人 们克隆到数个植物抗病基因， 使植物一 病原 相互 作用的 机理研究迅速发展，并 为 抗病基因在生产上的应用带来前景。 一 植物感病和抗病的分子基础 ( 一)植物与病原的相互作用关系 植物和病原菌 互作关系， 有亲和互作 ( c o m p a t i b l e i n t e r a c t i o n ) 和 非亲和互作 ( i n c o m p a t i b l e i n t e r a c t i o n ) 两种类型。 亲和互作是 病原菌有毒， 植物感病的相互作用:非 亲和互作是病原菌无 毒， 植 物 产生抗性的相互作用。 5 0年代初， 植物病理学家 f l o r 幻 根据他 对亚麻 和亚 麻锈菌互 作的 遗传规 律的研究， 提出了著名 的基因 对基因 假说 ( g e n e - f o r - g e n e h y p o t h e s i s ) : 植物 和病原菌中存在一对互 补的基因， 即 病原菌中 的无 毒基因( a v i r u l e n t g e n e , a v r ) 和寄主植物的抗病基因 ( r e s i s t a n c e g e n e , r ) ，当二者均为显性时，植物与病 原为非亲和互作，病原菌无毒，植物抗病;当二者任何一个为隐性时，植物和 病原菌为亲和互作，病原菌致病，枝物感病。现在这种假说在分子水平 上 能很 好地被配体一 受体模式 ( l i g a n d - r e c e p t o r m o d e l )加以解释，即病原菌的 a v r 扩 e 基因直接或间接编 码产 物为配体 ( l i g a n d ) .能被植物互 补抗病基因 ( r )编码 的受体 ( r e c e p t o r ) 所识别， 并产生某 种形式的次级信号， 继而诱发作用自 身 的防卫反应基因 表达， 激发抗病反 应。如果病原菌缺少无毒 基因或植物缺少抗 病基因时， 这种识别作用不能完成，结果都是病原菌致病而 植物感病。 其关系 可由表 1显示。 表1 . r - a v r 基因相互 作 用关系 植物基因型 r1 r 2rl r 2 病 原 基 因 型 a v rl 非亲和 亲和 a v r 2 a v rl 亲和非亲和 av r 2 ( 二) 病原菌致病相关基因 致病基因主要包括毒性基因 ( v i r u l e n t g e n e s , v i r ) 和无毒基因 ( a v i r u l e n t g e n e s , a v r ) 前者决定对植 物表现亲和性， 即调控病害的发生发展; 后者决定病原 菌小 种与 含有相应抗病基因 的寄主植物的专化 不亲和性。 根据毒性基因产物的认识程度，可分为己知产物毒性基因和未知产物的 毒 性基因两大类。已 知产物的毒性基因包括胞外水解酶 类，胞 外多糖，植物激素 和毒素等。胞外 水解酶类是病原体 分泌的， 在侵染过程中降解植物细胞壁成分 的酶类， 如果胶 酶、 纤维素酶、蛋白 酶等。包外多糖类包括 外多糖 ( e p s ) 、 脂 多糖 ( l p s ) 和葡聚 糖， 胞外多 糖在病菌侵染过程中有堵塞导 管引 起植物枯萎的 作用 3 ) a毒素是一 类在低浓度下就能 对寄主植物起破 坏作用的 物质，它往往通 过阻断植物某些 氨基酸合成途径或其他代谢合成途径来实现 其毒性作用。如玉 米圆斑病菌 ( c o c h l i o b o l u s c a r h o n u m ) 雷尔逊小种 1 能产生专 化性 h c - 毒素， 农杆菌能合成的 胭脂碱或章鱼碱等。未知 产物的毒性基因 包括过敏反应和致病 基因 ( h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e a n d p a t h o g e n i c i t y g e n e , h r p g e n e ) ,即具 有在非亲和寄主植物上引起过敏反应 ( h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e ) ，以及在亲 和寄主上引起病 害 ( p a t h o g e n i c i t y ) 双重 功能的基因。1 4 8 6 年 i n dr e n 等， m r才 最早发现用转座子诱导的 p . s y r i n g a e p v p h a s e o l i c o l a的 h r p突 变体不 能在 非寄主植物上引起过敏反应或产生病害，h r p的突变体表现类似与植物毫无相互 关系的细菌，如 c o l i 。此后在许多病原菌如 p . s y r i n g a e p v . s y r i n g a e , p s e u d o m o n a s s o l a n a c e a r u m , x a n t h o m o n a s c a n p e s t r i s p v . y o s i c a t o r i a ，中 分离到 h r p 基因簇。h r p 基因功 能己 经得到较系统地 研究。 x i a o等【 6 发 现h r p 在细菌进入植物组织的细胞间隙时高表达 而在丰富营养的培养基中却低表达， 说明 h r p基因产物组成了感受蛋白来接受植物或环境信号。更有意思的是许多 h r p基因产物是蛋白分泌通道的组分，它们形成i i i 型 ( t y p e i i i )分泌通道，类 似于几种人类致病菌，如 y e r s i n i a s p p在令人致病时形成的分泌通道【 7 0 无毒基因 ( a v r )直接或间接编码的是能在含有相应抗病基因的寄主植物上 引起抗病反应的激发子 ( e l i c i t o r ) 。 根据无毒基因 的特点， 司 一 以 用基因 座互补 法、转 座子 标签法、产物导向 法来克隆病原菌的 无毒基因。1 9 8 4 年 d a n i e l 等通 过细菌交配实 验将甘蓝黑 腐病黄单胞菌甘蓝改 病变种 ( x a n t h o m o n a s c a m p e s t r i s p v c a m p e s t r l s )基因文库中的克隆互补到另一个菌株，使后者寄主专化性改变， 从而 克隆到其 无毒基因【 8 0 1 9 9 1 年 v a n k a n j a l等用 产物导向 法克 隆到番 茄叶 霉病菌 ( c l a d o s p o r i u m f u l v u m )的无毒基因 a v r 9 9 。至今已有近 4 0个 a v r 基因被克隆。不仅有力的支持了基因对基因学说，而且也促进了对无毒基因的 认识。尽管大多数无毒基因的 序列己知，但对大多 数无毒基因编码的 最终 产物 和在含互补抗病基因的寄主植物上引起过敏反应的机制还不清楚。许多 a v r基 因编码亲水蛋白，但只有丁香假香单胞杆菌 ( p . s y r i n g a e p v . t o m a t o ) 的无 毒基因a v r d 是编码具酶活的蛋白，含3 1 1 个氨基酸的多 肤 s y r i n g o l i d e ， 这种 多肚能在含 r p g 4抗性基因的 大豆品种上激发过敏反 应【 1 0 1 。番茄叶霉病菌的 a v r 9 编码 一个 2 8 个氨 基酸的 多肤， a v r 4编码最终 产物是一个含 1 0 6 个氨 基酸 的多肤均具有激发含相应抗性基因 c f - 9和 c f - 4的番茄品种过敏反应的功能， 说明 可能作为配体与互补抗病基因 编码的受体结合【 1 1 o x a n t h o m o n a s 的 无毒基 因 a v r b 3基因家族编码的蛋白含有 3 4个氨基酸残基的重复，其重复可达2 5次， 这个重复序列在数量、位置的任何改变都会影响其表型。病毒与真菌、细菌的 侵染方式不同。植物病原真菌和细菌是在胞间定殖、生长并与植物细胞作用， 而病毒是入侵植物细胞内，在植物细胞复制出新的病毒粒子，再通过胞间连丝 侵染另外的细胞。烟草花叶病毒 ( t v)研究得较为清楚，它是 r n a病毒，含 4 个开放读码框 ( o r f ) ，分别编码复制酶 ( r e p l i c a s e ) 、运动蛋白 ( m o v e m e n t p r o t e i n ) 、衣壳蛋白 ( c o a t p r o t e i n ) 和一个重叠基因的蛋白，这四 种蛋自 均 的蛋白，这四 种蛋白 均可作为潜在的配体 被 r 基因识别仁 1 2 0 ( 三)植物的抗病基因 长期以来由于对抗病基因及其产物性质一无所知，对抗病基因介导的 抗病反应只能停留在遗传、细胞和生理水平上，尽管早就提出了植物与病原菌 相互作用的基因对基因假说及配沐一 受体模型，但无法从分子水平上加以验证。 随 着现代分子生 物学的发展及多种作物遗传连锁图 和物理图的 绘制成功，使图 谱克隆技术 ( m a p - b a s e d c l o n i n g ) 和转座子标签法 ( t r a n s p o s o n t a g g i n g ) 在克隆高等动植物基因获得成功。通过这两种克隆技术，人们己在 7种植物中 克隆到 1 4个抗病基因， 抗病基因的分离及其产物结构功能的分 析，解读了 植 物抗病反应信号传导链的关键，为最终全面深入了解植物抗病的分子基础提供 了条件。 通过分析已克隆的植物抗性基因发现它们在结构上具有高度同源性，常构 成基因家族。根据其蛋白结构特性可分为五类 ( 见表 2 . ) 。 表2 .植物中已克隆的 抗性基因 类 别 抗性 基 因 植物病原及 相应 的 无毒基因 侵染特性 及组织 9 1_ m 月 1一克隆方法 文献巴 月 围 书 习 j门 7 j 结构 1h ml 玉米 c o c bl i b o l us c ar b o nu m r a c e 1 坏死营养 型 真 菌 / 叶子 h c -毒 素 还原酶 转座子标签 法 1 3 1 2p t o西红 柿 尸s e u d o mo n as s yn n g ae p v . t o mat o ( a v r p t o ) 胞外细菌 / 叶子 胞 内 丝 - 苏 氨酸蛋 白激酶 图谱克隆法 1 4 r p s 2 拟南 芥 只s y r l n g a e . p v t o ma t o ( a v r r p t 2 ) 胞外细菌 / 叶子 l . z i p / nb s ! l r r 图 谱克 隆 法 1 5 扩才 i ，玉米 h m 工基因为第一个被克隆的抗病基因。负责对真菌 c o c h l i o b o l u s c a r b o n u m r a c e l 的 抗性。 利用玉米转座子 ( m u ) 克隆的。 h m 2 编 码部分长4 0 8 b p , 编码依 赖于n a d p h 的h c 毒素还原酶， 与二氢叶酸还原酶高 度同 源， 但它不符合 基因对基因模式。 2 ，番茄的 p t o基因使第一个被克隆的符合基因对基因模式的植物抗病基因; 它决定对它 a v r p t o的 p . s . p v . t o m a t o的抗性。1 9 9 3年 m a r t i n等利用图谱克 隆技术和与 p t o紧密连锁的r f l p 标记筛选到一个跨 p t 。区 y a c 克隆，y a c克隆 从。 d n a 文库中 筛到相应的。 d n a 克隆。 通过转基因互补实验证明 这c d n a 就是p t o 基因编 码区。其蛋白 产 物为 含 3 2 1 个氨基酸的丝 氨酸/ 苏氨酸蛋白 激酶， 能自 动 磷酸 化。 p t o 蛋白 含2 7 个丝 氨酸和1 3 个苏氨酸残基， 与甘 蓝自 交不亲和基因s r k , 哺乳动物信号分子 r a f ，人类 工 r a k激酶属 同一蛋白激酶家族。序列分析表明似 乎 p t o 在信号传递过程中 不能 起识别作 用， 但 1 9 9 6 年 t a n g x . 等 2 9 利用酵母 双杂交系统证明p t o与a v r p t o是能够直接相互 作用，而 p t o的自 身磷酸化是 p t o - a v r p t o相互作用所 必需的。 在含 p t 。的 番茄突 变株中 发现另 一个抗性基因 p r f ， 是 p t o执行功能所 必需的。p r f 编码 1 8 2 4 个氨基酸蛋白， 并含有亮氨酸 拉链结构 ( l e u c i n e z i p p e r , l . z i p ) , n b s ( n u c l e o t i d e b i n d i n g s i t e )和 l r r ( l e u c i n e - r i c h r e p e a t ) 结 构， 属于p r s 2 和 r p m 1 类基因。这说明含有l r r 蛋 白 和蛋白 激酶可能是同 一 个信号 传导途径上的不同成分。 3 . 含n b s / l r r 蛋白 的 基因 ( 1 ) r p s 2 和 r p m 1 拟南芥的r p s 2 基因决 定其对含 a v r r p t 2 基因的p . s y r i n g a e 具抗性，产 物为一个 9 0 9个氨基酸的蛋白质，其结构特点是:n末端是一个亮氨酸拉链 ( l e u c i n e z i p p e r , l . z i p ) 第 3 4 。到3 6 0 位氨基酸 构成一个跨膜结构域， 近 c 端是多个不完全的富 含亮氨酸重复序列 ( l e u c i n e - r i c h r e p e a t , l r r ) 组成， 蛋 白 质中 有6 个n - 糖 基 化 位 点 ， 还有 一 个 核 昔 酸 结 合 位点( n u c l e o t i d e b i n d i n g s i t e , n b s ) e r p m 1 基因负 责 对带有 a v r b 和 a v r p t m l 无毒基因的p . s y r i n g a e 的 抗 性， 但a v r b 和a v r p t m l 无同 源性。r p m i 是一个2 7 7 8 b p 的无内 含子基因，编 码一个含 9 2 6个氨基酸的蛋白质，其中有 n b s位点、亮氨酸拉链和 1 4个不完备 的l r r 形成的功 能区， 还有一 个疏水的 膜结合区及3 个 n - 糖基化位点。r p s 2 和 r p m 1 的l . z i p 区 域有4 到6 个连续的七氨基酸序列组成，可促进形成螺旋结构， 有利于蛋白 二聚 体的 形成 或与 其它蛋白 相互作用。 r p s 2的 g p g g v k t序列与激酶 l a 和磷 酸结合环 p - l o o p ) 的 保守区 一致， 紧接着连有激酶2 及3 a 的结构域， 对 这是金属离子结合必需的， 也是结合a t p 必需的。 n b s 的 存在说明r p s 2 和r p m 1 蛋白 可结合a t p或g t p ， 执行激 酶功能或g 蛋白 功能。 l r r 的结构广泛 存在于 蛋 白 质一 蛋白 质相互作用或 配体 结合作用中。说明r p s 2 和r p m 1 可能是编 码细胞 质 中的胞内受体。 ( 2 )烟草 n 基因、亚麻 l 6 和拟南芥 r p p 5 基因 n基因决定烟草对 t m v的抗性，长 3 4 3 2 b p ，编码含 1 1 4 4个氨基酸的蛋白 ( n ) . n 蛋白 有 n b s 位点， 有 4 个不完备的以2 6 个氨 基酸为单 位的l r r 区 域， 其氮端于 r p s 2和 r p m 1不同，而与哺乳动物的白介素受体 ( i n t e r l e u k i n - 1 r e c e p t o r , 1 l - r )及果蝇的 t o l l蛋 白类似，被命 名为 t i r结构域 ( t o l l / 1 n t e r l e u k i n - 1 / r e s i s t a n c e )因 此 n 蛋白 可能参与信号传递而 不是与 配 体结合的受体。 l 6基因是 利用玉米转 座子 a c )克隆到的负 责 对含 a v r a l 6的 亚麻锈菌 的 抗性。 l 6 基因通过选择性切 割可产生两种 m r .n a ，大m r n a 编码 1 2 9 4 个 氨基酸 蛋 白， 也有t i l , n b s 及2 7 个l r r 区域， l 6 的 氨端还 有6 0 个氨基酸的 锚定信号 序 列，表明其可直接进入分泌途径。小 m r n a编码 7 0 5 个氨基酸蛋白 ( l 6 ) ， 其中 6 7 6 个与l 6 蛋白 一致， 之后2 9 个新的氨基酸，没了 大 部分 l r r 结构，这2 9 个 氨基酸可能是个跨膜区 域。 l 6 / l 6 定 位于膜上 可促 进对真菌 a v r基因 信号的 识 别。 拟南芥r p p 5 基因负 责对霜 霉p e r o n o s p o r a p a r a s i t i c a 的 抗性， 编码 含1 3 6 1 个氨基酸的蛋白: n 端有t i r 结构 域，一个 n b s 区， 及c 端的 2 1 个 l r r 。 这个 蛋白无信号肚及跨膜区，说明可能存在于细胞质。 4 番茄 c f 类基因 番茄 c f - 9 , c f - 2 , c f - 4 和c f - 5 基因负 责 对含 相应无毒基因的番茄叶 霉病 菌的抗性，它们是利用玉 米 d s 转座子克隆的. c f - 2 编码 1 1 1 2 个氨基酸的 蛋白 产物;c f - 9编码 8 6 3个氨基酸的蛋白;c f - 4编码 8 0 6个氨基酸的蛋白;c f - 5 编码9 6 8 个氨 基酸蛋白 。c f - 9 蛋白是定 位于膜上 的胞 外糖蛋白 ，含 2 7 个不 完全 的 l r r ，平均每个含 2 4 个氨基酸，有疏水结构域。含2 2 个 n - 糖基化位点，n 端 含有几个保守的半肤 氨酸， 对蛋白结构很重要。 c f - 4 与c f - 9 基因紧密 连锁 ，仅 比c f - 9 少2 个l r r 结构 域。 c f - 2 基因是串联 存在的 两个有功能的拷贝， 与c f - 9 / c f - 4 不连锁，含 3 7 个 l r r s ， 有 2 4 个不带电 荷的 氨基酸 构成的一个 跨膜结 构域，蛋白上有 3 1 个 n - 糖基化位点。c f - 5与c f - 2 基因紧密连锁 ，蛋白结构也 时才 与 c f - 2极为相似，仅比 c f - 2少了6 个 l r r s区。总体上看 c f 基因编码的蛋白 含 3个结构域: 伸展于胞外的 l r r区: 跨膜区;很 短的膜内区域，都是定 位在 膜上的细胞外糖蛋白，可能起受体作用。 5 .水稻 x a 2 1 基因 x a 2 l 基因 负责对 3 0多 个白 叶 枯病菌 株的 抗性，它含 有一个3 0 7 5 b p 的巨大 o r f ,编码一个 1 0 2 5 个氨基酸的蛋白质，含一个 8 4 3 6 p的内含子，x a 2 1蛋白具 有一个推断的信号肤和一个胞外的 2 3个 l r r 结构域，多个糖基酸化位点，一个 跨膜区，和一个胞内 的丝氨酸/ 苏 氨酸蛋白 激酶结构域， 整个 x a 2 1蛋白与 拟南 芥的受体丝氨酸 / 苏 氨酸激酶 r l k s 有 高度同 源性。 由于x a 2 1 同时 含有 l r r 特征 和类蛋白 的丝 氨酸/ 苏氨酸激酶结构 域， x a 2 1 蛋白是 一个同时具 有受 体功能 和下 游信号传递能力的抗性基因。 抗病基因是 否有其它类型?目 前还有 一 些基因已 克隆 或己 在克隆最后阶段 如番茄抗真菌的 1 2 基因，亚麻抗锈病的m基因，小麦抗包囊线虫的 c r e 3基因。 根据这些基因 编码蛋白 质的 特性， 可 将它们归于蛋白 含 n b s / l r r基因类。 综上 所述，可能植 物能 利用有限的 识别/ 信号 传导系统来抵抗 病原 物的 侵入。 ( 四) 植物抗病反应机制 在漫长的进化过程中，植物在病原菌的选择压力下，逐步形成并完善了一 套阻止或忍耐 病菌侵染的 机制。当 植物受到病原菌入侵， 其 a v r基因产物被植 物相应的抗病基因识别后，一系列的抗病信号传递被开启，激起植物一连串的 抗病反应发生， 包括 c a t 流， k - h 交换导致 胞间隙 碱化、 氧化爆发 ( o x i d a t i v e b u r s t ) ， 病菌侵 染点 细胞进入 程序死亡 ( p r o g r a m m e d c e l l d e a t h , p c d ) ， 侵染 点细胞壁结构蛋白 氧化交联，木质素沉积，防卫基因表达。 这些反 应即我们所 称的过敏反应 ( h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e , h r ) ， 其直接结果是病原菌被限制 在侵染点坏死组织中 不能向 周围 扩展获得充足的营养物质，以 致死亡。病菌侵 染点的 过敏反 应激活水杨酸 ( s a l i c y l i c a c i d , s a ) 的合成。s a浓度在侵染点 升高并作为信号 分子 扩散到植株的 其它部分， 激活未侵染部分 防卫基因， 特别 是 病理 相 关 ( p a t h o g e n e s i s r e l a t e d , p r ) 蛋白 的 表 达， 从 而 使 整 个植 株 获 得 对所有病原菌的广谱抗性。这是一种时间上落后于 h r反应，性质上类似于动物 免疫的一种抗病机制， 称为系 统获得 性抗性 ( s y s t e m i c a c q u i r e d r e s i s t a n c e , s a r ) . s a r 可由非 亲和病菌接种或化 学 物质诱导 产生， 持续数天到数月不等， 是 可以在生产上直接利用的抗病机制。h r和 s a r是在植物中普遍存在的两种抗病 e才 机制，众所周知，环境中的各种微生物致病机制各不相同，而植物面临多样性 病原微生物挑战的机会均等，在进化过程中使形成了这套对各种病原菌都有效 的抵抗机制。 1 . 过敏反 应 ( h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e , h r ) 植物的过敏反应不是由于病原菌毒性因子对细胞的毒害作用而引起的细胞 死亡，而是植物主动表现抗病反应的一种细胞程序性死亡 p r o g r a m m e d c e l l d e a t h , p c d ) ，是细胞的一种保护性自杀行为，也发生类似动物细胞程序性死亡 的过程。r y e r s o n d e等 3 0 发 现黎豆锈菌诱发相应黎豆抗性植 株细胞死亡时伴 随 类似动物细胞凋 亡( a p o p t o s i s ) 时的核d n a 断裂; w a n g h . 等 川 用a l t e r n a r r a a l t e r n a t a f . s p .厅c o p a r s i c i的a a l 毒素处理番茄的原生质 体及幼 叶 后发现 出现凋亡小体及 d n a梯度 ( d n a l a d d e r )的细胞凋亡现象。凋亡小体也在拟南 芥、烟草、大豆等植 物的过敏反应中被观察到。 这说明细胞凋亡在过敏反应中 时普遍存在的。氧化爆发即在细胞膜上的 n a d p h氧化酶催化下产生活性氧中间 产物 ( r e a c t i v e o x i d a t i v e s p e c i e s , r o s ) 执 仇 、 o h , o , z - ，使细 胞中 活性氧 浓度升高，被认为与过敏反应的细胞死亡及抗病性有关。 氧化爆发可被 特异的 细菌 或真菌无毒因子诱导发 生， 蛋白 磷酸化酶2 a 抑制剂可诱导l i p , 产生。 k e l l e r t 等 3 2 分离到一个水 稻 r b o h a 基因与人 类嗜中 性白 细胞 n a d p h 氧化酶g p 9 1 p h u a 有高 度同 源性，是氧化 爆发必需的。 有报道， d p i 、过氧化氢酶在抑制 愧 仇积累 的同时，带无毒基因菌株引起的细胞凋亡也被抑制，而蛋白磷酸化酶 2 a的抑制 剂c a n t h a r i d i n 可 诱 导性 飞 的 产生 . 也 能 在未 侵 染 的 细 胞引 起 细 胞 死 亡， 说 明氏 仇 是细 胞死亡的必要条 件。 但g l a z e n e r j a 等 3 3 发现当大豆细胞被p . s v r i n g a e p v . g l y c i n e a侵染时 会产生 两次氧化爆发， 阶段 i 是弱而快速的， 阶段h 的 氧化爆 发依 赖 a v r 和h r p 基因的 表达，引 起氧化爆发及过敏细胞死亡，当h r m a 基因突 变 后p . s . p v . 列 y c i n e a 仍 能 引 起性 飞积 累 但 不 能 引 起 细 胞 死 亡 ， 因 此 他 们认 为氏 飞 不 足以 引 发 细 胞 凋 亡。 魄 几 可 激 发c a l+ 浓 度 升 高 ， 而 在 大 豆 细 胞 中c a t ， 是 引 起细胞死亡必需的，c a z + 的 离子通道 a 2 3 1 8 7可使细胞外的 c a 2 1 进入细 胞而引 起大豆细胞凋亡。而有趣的是，r b o h a基因产物有 c a + 结合位点，c a z 流反过来 也 可以 促进 n a d p h 氧化酶产生更多的氧化物， 这是个正向 反馈反应。r o s 有以 下 几种功能:抗微生 物活 性; 氧化交联细胞壁;激活基因表达:激活过 敏反应细胞死亡; 与 s a相 互作用激活系统获得 性抗性 ( s a r ) 。一 个 s a结合 蛋白己 从烟草中分 离， 经鉴定是过氧化氢酶，s a抑制这个过氧化氢 酶而 导致体 内h ,o 2 浓 度上 升 。 因 而k 2 被 认 为 是s a r 的 第 二 信 使， 而s a 为 第 一 信 使 3 4 ; 对宫 但也有证据证明 烟草引发s a r 时并无氏 0 , 积累， 而比 仇是 作用于s a 的 上游口因 此1 2 0 2 的作用仍需大量实验证 据证明。 2 .系统获得性抗性 ( s y s t e m i c a c q u i r e d r e s i s t a n c e , s a r ) 系统获得性抗性是植物防卫反应基因被系统诱导表达的结果，特别是 p r蛋 白 类基因。p r 蛋白 至少分五类:p r - 1 - 5 ，其中 有降 解 病原细胞 壁的 酶如几丁 质 酶、0 - 1 , 3 - 葡聚 糖酶， 也有抑制 病原生长 的酶如 过氧 化物酶、 超氧化物歧 化酶、 脂氧化酶等。p r - 1能抗疫霉 ( p h v t o p h t h o r a ) , p r - 5能破坏真菌细胞膜的稳定 性。在 植物形成 s a r 时常有恒定的p r 蛋白基因被高 水 平系统诱导 表达， 因此 这 类基因被称为 s a r 基因，而 s a r基因是否系统表达就成为判断植物是否发生s a r 的分子标准。 s a r 是继 h r 后植物产生的一种抗病机制，时 间落 后于局部 性的 h r ， 而信号 是如何从病原侵染点传到远离侵染点的健康组织的 呢?1 9 9 0年两个实 验室的 独 立工作使这个问 题明朗 起来，m a l a m y j . 等 3 5 3 发 现t m v 侵染 烟草时，内 源 水杨 酸浓度上升。 m e t r a u x j 等 3 6 同时发现黄瓜在 表现s a r