（遗传学专业论文）莽草酸基因工程菌构建的初步研究.pdf

莽草酸基因工程菌构建的初步研究 付小花 缩略语 a r o l a r o k s a p e p e 4 p d a h p d h s q a c s r a c s r b e c o l i p t s d h q a t p b p p p s a p y r r 5 p s t r k a n a m p c m t r i s s s c t y r r s d s d 1 v r o d p c r l - t y r 常用缩略语表 英文全名 g o n eo f s h i k i m a t ek i n a s ei g e n eo f s l l i k i m a t ek i n a s ei i s h i k i m i ca c i d p h o s p h o e n o l p y r u v a t e d - e r y t l l = r o s e4 - p h o s p h a t e 3 - d e o x y - d a r a b i n o - h e p t u l o s o r d ea c i d - p h o s p h a t e 3 - d e h y d r o s h i k i m i ca c i d q u i n i ca c i d c a r b o ns t o r a g er e g u l a t o ra c s r ab i n d i n gr n a e s c h e r i c h i ac o l i p h o s p h o t r a n s f e r a s es y s t e m 3 - d e h y d r o q u i n i ca c i d a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e b a s ep a i r p h o p h o e n o lp y r u v a t es y t h e s a s e p y m v a t e 5 - p h o s p h a t er i b o s e s l r e p t o m y c i n k a m y c i n a m p l i c i l l i n c h l o r a m p h e n i c o l t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e t y r o s i n er e g u l a t o r s o d i u md o d c c y ls u l f a t e d i t h i o t h v e i t 0 1 o p t i c a l d e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n l t y r o s i n e 中文全名 莽草酸激酶i 基因 莽草酸激酶n 基因 莽草酸 磷酸烯醇式丙酮酸 4 磷酸赤藓糖 3 脱氧d 阿拉伯庚酮糖 酸7 磷酸 3 脱氢莽草酸 奎尼酸 贮碳调控因子a c s r a 结合的r n a 大肠杆菌 糖磷酸基转移系统 3 一脱氢奎尼酸 三磷酸腺苷 碱基对 磷酸烯醇式丙酮酸合酶 丙酮酸 5 磷酸核糖 链霉素 卡那霉素 氨苄青霉素 氯霉素 三羟甲基氨基甲烷 标准柠檬酸盐溶液 酪氨酸调控子 十二烷基硫酸钠 二硫苏糖醇 吸光度 聚合酶链式反应 l 酪氨酸 论文独创性声明 小论文是我个人在导帅指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志刈本研究的启发和所做的贞献均已在沦文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名 论文使用授权声明 日期 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借蒯；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以露用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论义在解密后遵守此 规定。 作者签名：导师签名：日期 莽草酸基因工程菌构建的初步研究 付小花 摘要 莽草酸( s h i k i m i ca c i d ，s a ) 是芳香氨基酸生物合成的重要中间产物，它 具有众多生理功能：通过影响花生四烯酸代谢来抑制血小板聚集，从而可以抑制 动、静脉血栓及脑血栓形成；具有抗炎、镇痛作用；还可作为抗病毒和抗癌药物 的中间体，有广泛的药用价值。莽草酸是可以抑制h 5 n 1 型禽流感病毒的药物 磷酸奥司米( o s c l t a m i v i r p ho s p h a t c ，商品名达菲) 的原料，随着禽流感疫情在全 球蔓延，莽草酸更加供不应求。 目前主要是从八角属植物果实中提取莽草酸，产量不仅受产地和气候的限制 而且提取工艺繁琐，成本较高。莽草酸的化学合成反应复杂，要求条件高，产品 收率低，并且莽草酸是手性分子，在化学合成时形成的手性异构体杂质很难去除， 这些缺点都使得化学合成法在大规模工业生产中的应用受到影响。微生物发酵生 产不受气候等条件的影响，可以大规模投产，工艺简单，成本低，立体专一性好， 因此利用微生物发酵生产是解决当前莽草酸短缺问题的最佳方法，但我国目前还 没有可以发酵生产莽草酸的菌种。 本研究以e c o l i d h 5 基因组为模板克隆莽草酸激酶基因( a r o l ，a r o l o ，适 当酶切后分别插入两端带有f r t 位点的卡那霉素抗性基因，得两个质粒 p m d a r o l ：k a n 和p m d a r o k ：k a n ，经e c o ri 、p s ti 双酶切得到基因打靶d n a 片段，利用质粒p k d 4 6 编码的r e d 重组系统，用打靶d n a 片段的c a n 及两端 的基因同源序列替换大肠杆菌t o p l 0 f 基因组上的莽草酸激酶基因，再运用质 粒p c p 2 0 编码的f l p 重组酶消除基因组上的筛选标记k a n 基因。p c r 及s o u t h e r n b l o t 证实基因敲除是成功的，测序结果表明基因敲除成功且c a n 已经从基因组上 消除，摇瓶发酵显示构建的基因工程菌的莽草酸产量是原始菌株的2 0 3 倍。 关键词：莽草酸，莽草酸激酶，基因敲除，r e d 重组系统 中图分类号：q t s 莽草酸基因工程菌构建的初步研究付小花 a b s r r a c t a so n eo ft h ep r i m a r yi n t e r m e d i a t e si nt h ep a t h w a yo fa r o m a t i ca m i n oa c i d b i o s y n t h e s i s ，s h i k i m i ca c i dh a ss e r i e so fp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s i tc a ni n h i b i tb l o o d p l a t e l e ta s s e m b l i n ga n dt h r o m b i s i sb ya f f e c t i n gt h em e t a b o l i s mo fa r a c h i d o n i ca c i d i t i sa n t i - i n f l a m m a t i o n ，a n t a l g i ca n dam e d i ao fa n t i v i r u sa n da n t i c a n c e rd r u g s s h i k i m i c a c i di sa l s ot h es t a r t i n gm a t e r i a lo fo s e l t a m i v i r p ho s p h a t e t h ea n t i - h 5 n 1 砌u e n z a d r u gm a r k e t e da st a m i f l u ，a n dt h e r e f o r es h o r to f d e m a n dd u r i n gt h eb i r df l ue p i d e m i c s i t u a t i o na l lo v e rt h ew o r l d n o w a d a y ss h i k i m i c a c i di s m a i n l yi s o l a t e df r o ma n i s e e d s ，w h o s ey i e l di s r e s t r i c t e db yp r o d u c i n ga r e a , c l i m a t e s ，a n dt h ee x p e n s ea n dc o m p l e x i t yd u r i n g p r o d u c t i o n c h e m i c a ls y n t h e s i so f s h i k i m i ca c i di sc o m p l i c a t e d ，d e m a n d i n gw h i l eh a s l i m i t e dp r o d u c t i o n t r o u b l e sf r o me h i r a li s o m e r sa l s oa d dt ot h ed i f f i c u l t yo f i n d u s t r i a ls c a l e a p p l i c a t i o n o fc h e m i c a ls y n t h e s i s i n s t e a d ，m i c r o b e c a t a l y z e d s y n t h e s i sa v o i d st h ep r o b l e m sa b o v ea n dc a l lb eu s e df o rl a r g es c a l ep r o d u c t i o n w h i l em i c r o b e c a t a l y z e ds y n t h e s i si st h eb e s tw a yt of i l lu pt h es h o r t a g eo fs h i k i m i e a c i d ，t h e r ei sn os t r a i nf o rs h i k i m i ca c i df e r m e n t a t i o ni nc h i n an o w p c rc l o n es h i k i m a t ek i n a s eia n dhg e n e s ( a r o l a r o k ) f r o me c o h l ) h 5 a g e n o m e ，d i g e s t e da n dt h e ni n s e r t e db yt h ec o m p l e t eg e n eo fk a n a m y c i nr e s i s t a n c e g e n e ( k a n r ) t oc o n s t r n s tp m d a r o l ：k a na n dp m d a r o k ：k a n t h e yw e r ed i g e s t e d w i t he c o r i ，p a t ia n dt h et a r g e tf r a g m e n tr e c l a i m e d t h el i n e a rf r a g m e n tw a s e l e c t r o p o r a t e di n t oe c o h t o p f p k d 4 6 t h ea r o la n da r o ki ne c o l ig e n o m ew e r e r e p l a c e db yt h el i n e a rc a s s e t t eu t i l i z i n gr e dr e c o m b i n a n ts y s t e m 1 1 l ek a ng e n ew a s t h e ne l i m i n a t e db yf l pr e c o m b i n a s ef r o mt h ep l a s m i dp c p 2 0 p c ra n ds o u t h e r n b l o t t i n gc o n f i r m e dt h a tt h eg e n ek n o c ko u tw a ss u c c e s s f u l t h ef l a s k sf e r m e n t a t i o n v e r i f i e dt h a tt h es h i k i m i ca c i dy i e l do f t h em o d i f l e ds t r a i ni s2 0 3t i m e so f t h ec o n t r 0 1 k e yw o r d ：s h i k i m i ca c i d ，s h i k i m a t ek i n a s e ，g e n ek n o c k o u t ，r e dr e c o m b i n a n ts y s t e m c l c ：q 7 8 2 一 莽草酸基因工程菌构建的初步研究付小花 一前言( i n t r o d u c t i o n ) 1 1 莽草酸的性质及药理作用 莽草酸( 幽k i l n i ca c i d ，s a ) 是芳香族氨基酸的生物合成共同途径莽草酸 途径的重要中间体”，其结构式及主要性状如下： o o h o h 分子式：c 7 h i 0 0 5 相对分子质量：1 7 4 1 5 学名：3 , 4 ，5 三羟基1 环己烯一1 羧酸 性状：白色结晶粉末气微，味辛酸，有一定刺激性 熔点：1 8 5 1 8 7 相对密度：1 6 4 溶解性：易溶于水，难溶于氯仿、苯和石油醚 水中溶解度：1 8 0g l 旋光度：一1 8 0 。 最大吸收波长：1 9 1n l n 莽草酸分子结构中有三个羟基、一个羧基、一个双键，具有手性异构体，可 以成酯，也可以成盐。莽草酸是合成生物体内新陈代谢化合物的重要中间体，也 是合成许多生物碱、芳香氨基酸与吲哚衍生物、手性药物( 如抗病毒药) 的原料。 由于莽草酸具有众多生理功能而在药品行业应用广泛，它能通过影响花生四烯酸 代谢，而抑制血小板聚集，从而抑制动、静脉血栓及脑血栓形成；它具有抗炎、 镇痛作用；它还可作为抗病毒和抗癌药物的中间体，因而有广泛的药用价值【2 】。 莽草酸是可以抑制h 5 n 1 型禽流感的磷酸奥司米( o s e l t a m i v i r p ho s p h a t e ，商品名 达菲) 的原料，随着禽流感疫情在全球蔓延，莽草酸更加供不应求。因此，莽草酸 的市场潜力很大。 莽草酸基因工程菌构建的初步研究 付小花 1 2 工业大规模生产莽草酸 1 2 1 化学法合成莽草酸 化学合成莽草酸的方法主要有d i e l s - a l d c r 反应、逆d i e l s - a l d e r 反应、碳氢化 合物转化法和奎宁酸转化法，如图l 所示。 从图中可以看到1 1 法是用环戊二烯和苯醌经d i e l s - a l d e r 反应后在经多步 复杂反应最终得到莽草酸，总收率约1 6 3 【3 1 。1 2 法的原料与1 1 法相同，但 后续的化学反应及催化剂方面得到了改进，最终的总收率约4 1 【4 】。1 3 法是用 ( + ) ( 1 s ，4 r ，4 a r , 5 1 l 8 s ，b a r ) 一l ，5 ，8 ，8 a - i 噩t 氢，5 ，8 二羟氢- 1 ，4 亚甲基萘- - 4 a ( 4 h ) 一酸甲酯 为原料经七步复杂的化学反应后得到莽草酸，总收率1 4 8 【5 】。2 法为碳氢化合 物转化法，以手性结构单元( 1 k 5 r 7 s ) 7 - 【( 二甲基叔丁基硅氧基) 甲基】一6 ，8 二氧 二环【3 2 1 】辛3 烯2 酮和乙烯溴化镁经1 ，4 - 力成、n a b h 还原碳基成醇、m o m c i 保护仲醇、脱伯醇t b s 保护基及三苯嶙作用下发生碘代反应，经锌粉还原断裂碳 桥键，l i a i h 还原后发生双烯复分解反应等复杂反应最后经脱羟基保护和水解反 应得到莽草酸，总收率约7 8 1 6 1 。3 法是奎宁酸转化法，即以奎宁酸为原料的 合成，可有3 种合成途径：第一种合成方法的总收率1 0 i7 】第二种合成方法总 收率6 2 t 8 1 ；第三种合成方法总收率约1 9 【9 1 0 1 。化学合成莽草酸反应复杂， 要求条件高，并且产品收率低，并且莽草酸是手性分子，在化学合成时形成的手 性异构体杂质很难去除，这些缺点都使得化学合成法在大规模的工业生产中的应 用受到限制。 1 2 2 生物合成莽草酸 1 2 2 1 植物中提取莽草酸 莽草酸是芳香氨基酸生物合成的共同途径葬草酸途径的重要中间体，该 途径广泛存在于植物、微生物和寄生生物中。但是由于生物体内严密的代谢调控 的存在，各种生物中可以大量累积莽草酸的并不多。 莽草酸在木兰科常绿灌木莽草的干燥果实八角中含量较高，可达八角干重的 l o t l l 。莽草的植株高3 m 8 m ，叶革质，1 , - , 2 朵腋生；瞢荚果木质，顶端有长 而弯曲的尖头；种子淡褐色，有光泽。花期在五月，果期9 1 0 月。在全球，9 0 的八角产于中国，主要在福建、广东、广西、云南、贵州等省土壤疏松的山 地。目前市场上的莽草酸主要是从八角中提取得到的，而植物提取莽草酸的方法 繁琐，。且纯度一般只有9 8 。另外随着禽流感在全球的蔓延，作为世界卫生组 织推荐的抗禽流感药物达菲”的大量生产势在必行，这样其原料莽草酸 的短缺问题就日益凸现出来。八角的产量受到产地气候等条件的影响，新栽种 莽草酸基因工程菌构建的初步研究 付小花 - 5 - 饕陵链辫滁稷铝燃粹薯_缀 莽草酸基因工程菌构建的初步研究 付小花 的莽草要十到二十年才能开花结果，这样通过提高八角产量来获得莽草酸的想法 就难以实现。 1 2 2 2 微生物发酵生产莽草酸 莽草酸途径广泛存在于微生物中，通过微生物发酵也能提取莽草酸。微生物 发酵生产不受气候等条件的影响，可以大规模投产，从而可以解决当前莽草酸短 缺的矛盾。通过微生物发酵法生产莽草酸的优点还在于工艺简单，成本低，立体 专一性好。这就可以有效的解决化学合成的反应复杂，消耗大而产率低等矛盾； 也可以避免植物提取繁琐步骤及产地气候等条件的限制，所以微生物发酵生产是 可以大量且迅速提高莽草酸产量的最佳手段。 国内外开展微生物发酵生产氨基酸的研究已有5 0 多年的历史，最初是用典型 的菌种培养及随机诱变筛选技术来得到需要的生产菌种，现代分子生物学技术的 发展使基因工程菌的获得变得相对容易了，有意识的改造代谢途径和调节代谢流 对提高氨基酸的产量都很有效。在氨基酸特别是芳香氨基酸发酵生产研究方面积 累的经验对开展莽草酸发酵生产的研究具有指导意义。苯丙氨酸的发酵生产主要 用大肠杆菌( e c o l i ) 和谷氨酸棒状杆菌( c g l u t a m i c u m ) 为生产菌种【1 2 1 ，有研究 报道基因工程菌株的苯丙氨酸产量最高可达5 0 9 l i l ”。 瑞士及德国在莽草酸的发酵生产方面进行了大量研究：d r a t h s 将e c o l i 的莽草 酸途径的莽草酸激酶基因( a r o l ，a r o k ) 破坏从而阻断莽草酸途径中莽草酸后的 反应，从而使莽草酸产量增加【1 4 1 ，i o m a n t a s 在b a c i l l u ss u b t i l i s 菌株【1 5 1 、s h i r a i 在 c f f 加6 d c 研加彻庙f 菌株【1 6 】中运用随机突变筛选法破坏了莽草酸激酶的功能，从 而提高了莽草酸的产量，但是副产物3 脱氢莽草酸( d h s ) 较多，最大产率达2 7 ( d h s s a ) 。l o m a n t a s j 丕报道了一种新的莽草酸发酵生产方法【l5 1 ，5 - 烯醇式丙 酮酰莽草酸( e p s p ) 合成酶功能缺陷菌株可累积3 磷酸莽草酸( s 3 p ) ，再利用细菌 的磷酸酶活性将s 3 p 转化为莽草酸。 嫩旦婶骂斟尊 秒即乱睁 莽草酸基因工程菌构建的初步研究付小花 图2 大肠杆菌中莽草酸的产生途径 f i g 2t h ep r o d u c t i o no f s h i k i m i ca c i di ne c o l i b i o s y n t h e t i ci n t e r m e a i a t e s ( a b b r e v i a t i o n s ) ：，p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ( p e p ) d - e r y 岫o s e 4 - p h o s p h a t e ( e 4 p ) ，3 - d e o x y - d - a r a b i n o - h e p t u l o s o n i ca c i d7 - p h o s p h a t e ( d a h p ) 3 - d e h y d r o q u i n i c a c i d ( d h q ) , 3 - d e h y d r o s h i k i m i ca c i d ( d h s ) ，q u i n i ca c i d ( q a ) ，s h i k i m i ca c i d ( s a ) e n z y m e s ( g e n e s ) ：( 1 ) d a h p s y n t h a s e ( a r o g ，a r o f , a r o h ) , ( 2 ) d h q s y n t h a s e ( a r o b ) ，( 3 ) d h qd e h y d r a t a s e ( a r o d ) ，( 4 ) s h i k i m a t e d e h y d r o g e n a s e ( a r o e ) ，( 5 ) s h i k i m a t ek i n a s e ( a r o l , a r o k ) 莽草酸的市场前景好，微生物发酵生产莽草酸的优势较多，国外这方面的研 究工作取得了一定进展，但我国目前尚无这方面的研究工作。本研究是国内首次 报道利用基因工程法改造大肠杆菌的莽草酸途径使其累积莽草酸，在微生物发酵 生产莽草酸方面做了尝试。应用基因工程法改造细菌莽草酸途径的研究将有助于 填补这一空白。 1 3 代谢工程及其在莽草酸生产中的应用 代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) ，亦称途径工程( p a t h w a ye n g i n e e r i n g ) 和代谢 设计( m e t a b o l i cd e s i g n ) ，是利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过 d n a 重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造。细 胞代谢网络是由若干乃至上千种酶和膜传递系统及信号传递系统组成的受精密 调控又互相协调的复杂系统组成。因此，代谢工程一般是多基因的基因工程【l ”， 它涉及到多基因的联合协同表达控制机制，与传统的蛋白多肽单基因表达( 第一 代基因工程) 以及基因定向突变( 第二代基因工程) 有显著差别，故有人将它称之为 第三代基因工程【1 8 】。所以，代谢工程的核心是通过对代谢流的定量分析和细胞的 代谢网络进行修饰，对细胞的分解代谢和合成代谢中的多步级联反应进行合理设 计，然后利用d n a 重组技术强化和( 或) 灭活控制代谢途径相关基因【1 9 1 。近年来， 随着分子生物学研究的不断深入，有机体越来越多的生物合成途径被人们所认 识，一些微生物基因组全序列的测定【2 0 】及多基因之间的协同作用和代谢网络的刚 柔兼性研究、代谢工程和生物信息学】研究的兴起，基因、宿主有机体、载体系 统和分子生物学工具的发展，通过代谢途径的修饰不仅可以提高细胞己有的化学 物质产量或产生宿主细胞本身不能合成的新物质，而且可以扩展细胞的底物使用 范围，形成降解毒性物质新的催化活性，提高一些有重要经济价值的初级代谢产 物和次生代谢产物，并以提高氨基酸的产量最具有成功的典范i 2 2 。如k o m a t s u b a r a l 2 3 蝣通过完全解除天冬氨酞激酶和同丝氨酸脱水酶的反馈抑制，同时过表 达苏氨酸合成途径中的关键酶获得了产苏氨酸l o o g l 的菌株。 正常条件下，只有少量的中心代谢物被转化为某种特定的代谢物，亦即各种 物质的天然生物合成是与细胞自身需求密切协调的，各物质的合成受到转录水 莽草酸基因工程菌构建的初步研究 付小花 平、翻译水平和细胞整体水平的严密调控。但在诱导或有意识地进行代谢修饰的 菌株中，细胞的这种平衡状态会被打破，在碳源过剩的情况下，细胞可大量合成 某种目的产物或启动其他途径的无效循环【2 4 1 。随着代谢工程作为- - f 学科的诞生 和向系统学科的发展【25 划，重新合理设计菌株的代谢途径来更好地实现目的产 物生产逐渐成为研究热点。来自不同株系的抗反馈抑制基因和代谢途径“瓶颈” 酶的过表达相结合，可以使目的产物的产量得到提高【2 7 1 ，如利用抗反馈抑制的3 脱氧i f , 阿拉伯庚酮糖7 磷酸( d a h p ) 合成酶和分支酸变位酶预苯酸脱水酶在棒 状杆菌中的表达，可使产苯觥2 s g l t 2 8 1 。近年来，代谢流分析和定量生理 学在菌种改造上的应用【2 9 】，经典技术方法、分子遗传学和代谢工程的结合，使代 谢工程菌更易于获得较高的目的产物生产率p “。 1 3 1 莽草酸的生物合成途径 对莽草酸的生物合成途径及相关酶及其调控方式、代谢流及转运系统等的了 解是对其进行改造的必要前提。 1 3 1 1 中心代谢途径及其相关酶 莽草酸是生物体合成芳香氨基酸的重要中间代谢物。芳香族氨基酸包括苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸，自然界中芳香氨基酸只能由植物、微生物和寄生生物合 成。莽草酸的生物合成是以葡萄糖为起始物，经戊糖磷酸途径得中间产物赤 藓糖4 一磷酸( e r y t h r o s e 一4 - p h o s p h a t e ，e 4 p ) 和糖酵解过程得中间产物磷酸烯 醇式丙酮酸( p h o p h o c n o lp y r u v a t e ，p e p ) ，二者缩合形成一个七碳酮糖开链磷酸化 合物，称为3 脱氧d 一拉伯庚酮糖酸7 磷酸，如图3 ( a ) 所示。 图3 葡萄糖转化为d a h p 的级联反应 ( a ) 在没有h , s 存在的情况下( b ) 在p p s 存在的情况下 图中数字表示转化7 t o o l 葡萄糖到d a h p 的相对代谢流。p o s , 磷酸烯醇式丙酮酸合成酶 莽草酸基因工程菌构建的初步研究 付小花 g - 6 - p ：6 磷酸葡萄糖；6 f d p ：1 , 6 二磷酸果糖；g a p ：3 - 磷酸甘油醛；r s p ：5 壤酸核糖：x s p ： 5 磷酸木糖：s t p ：7 前酸景天糖；p y r ：丙酮酸；d a h p ：3 - 脱氧- m 阿拉伯庚酮糖m - 7 磷酸 从图中可以看到葡萄糖的吸收需要p e p 提供磷酸基，同时，利用水解a t p 产生的能量，这样p e p 转变成丙酮酸( p y r ) ，葡萄糖进入细胞之后经糖酵解重 新生成p e p 。另一方面，g - 6 p 经过磷酸戊糖途径的氧化、脱氢、脱羧形成r s p ， 再经磷酸戊糖分子重排，产生不同碳链长度的磷酸单糖，如e 4 p ，e 4 p 与p e p 缩 合形成d a h p ，与莽草酸的生成有关。与此过程有关的酶包括糖酵解途径的酶， 磷酸戊糖途径的酶，糖转运入细胞的转运系统的酶等，特别是磷酸烯醇式丙酮酸 合成酶( p p s a ) 、转酮酶( t k t a 和t k t b ) 、d a h p 合成酶( a r o f ，a r o g ，a r o h ) 对莽草酸生物合成尤为重要。 芳香氨基酸合成的共同代谢步骤有七步是共同的，如下图所示： 嗍卵。衄与嘲 粥厶塑i p 4 雾勰：嚣辨0 2 ： 砸c 图4 芳香氨基酸合成的七步共同途径及催化各步反应的酶 a ：d a h p 合成酶( a r o f , a r o g , a r o h ) ；b ：3 - 脱氢奎尼酸( d h q ) 合成酶( a r o b ) ； c ：d h q 脱水酶( a r o d ) ；d ：莽草酸脱氢酶( a r o e ) ；e ：莽草酸激酶( a r o l ，a r o k ) ； f ：5 烯醇式丙酮酰莽草酸( e p s p ) 合成酶：g ：分支酸合成酶( a r o c ) 。 莽草酸是合成三种芳香氨基酸的共同前体，这一段芳香氨基酸合成的共同途径称 为莽草酸途径，图中可以看出莽草酸是这条途径的中问代谢产物，要提高莽草酸 的产量不仅要阻断莽草酸下游的代谢反应，即破坏莽草酸激酶的功能，使莽草酸 下游的反应不能进行，从而累积莽草酸；还要调节上游的酶反应，改变细胞的代 谢流，将大量的碳流引入这条途径，这样才能大大提高莽草酸的产量。大肠杆菌 的莽草酸激酶由两个基因编码，即a r o k 和a r o l ，它们分别编码莽草酸激酶i 和 莽草酸激酶i i ，其中莽草酸激酶i i 是主要酶，其k m 值比莽草酸激酶i 约小1 0 0 倍【3 l 】，所以在通常情况下莽草酸的浓度还没有累积到可莽草酸激酶i 的作用浓度 就已经被莽草酸激酶i i 转化为3 磷酸莽草酸。在其他的微生物如枯草芽孢杆菌、 谷氨酸棒状杆菌中，莽草酸激酶只有一个编码基因。 1 3 1 2 代谢途径及其相关酶的调控方式 芳香氨基酸的生物合成中，目前已经知道至少有1 7 种酶参与，且表现出复 杂的代谢调控机制【3 2 i 。莽草酸合成的第一个限速反应是p e p 和e 4 p 缩合成 d a h p ，在e c o l i 中，催化此步反应的三个同工酶分别由a r o f 、a r o g 、a r o h 编 码，分别受酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的反馈抑制。其中苯丙氨酸抑制的a r o g 莽草酸基因工程菌构建的初步研究 付小花 占总酶活性的7 9 ，酪氨酸抑制的a r o f 占总酶活的2 0 ，而色氨酸抑制的a r o h 占总酶活的1 。a r o g 和a r o f 的反馈抑制非常有效，可使；9 5 的酶失活；而 a r o h 的反馈抑制只可以抑制其酶活的6 0 ，另4 0 表现为组成型活性【3 3 1 。第 一步反应的底物之一p e p 是多个酶的竞争底物，p e p 羧化酶( p p c ) 可以把p e p 转化为草酰乙酸，进入三羧酸循环；丙酮酸激酶( p y k ) 可以把p e p 转化为丙酮 酸；只有d a h p 合成酶可以把p e p 和e 4 p 转化为d a h p 进入芳香族氨基酸合成 途径；同时，葡萄糖的吸收又需要p e p 提供磷酸基，即通过糖磷酸基转移系统 ( p h o s p h o t r a n s f c r a s es y s t e m ，p t s ) 来吸收葡萄糖。另一个反应底物e 4 p 则是经 磷酸戊糖途径，由转酮酶催化而得。在从d a h p 到莽草酸的反应中，每一种酶 都受其反应产物的反馈抑制，其中d h q 合成酶、莽草酸脱氢酶又是限速酶，它 们受到莽草酸的反馈抑制。提高莽草酸的产量的同时这种反馈抑制作用也在加 强，所以解除莽草酸的反馈抑制对提高莽草酸的产量也非常重要。 大肠杆菌的t r y r 基因编码t y r r 蛋白，此蛋白可以调控芳香氨基酸的生物合 成和转运有关的一系列基因的表达。这些基因分布于8 个转录单元，组成t y r r 调控子。t y r r 蛋白经常以酪氨酸作为辅助因子而发挥阻遏作用，a r t ) g 和t y r r 基 因也被t y r r 蛋白所阻遏，但这种阻遏不是由酪氨酸而是以苯丙氨酸作为辅助因 子。商量等报导敲除大肠杆菌t y r r 基因有利于p h c 产量的提高【3 4 1 。 近年来，r o m e o l 3 5 】等人通过对2 5 个相关碳代谢的各种酶或基因的研究发现， e c o l i 苯丙氨酸合成中心代谢途径及其生理特性的调控因子贮碳因子 ( c a r b o ns t o r a g er e g u l a t o r a ，c s r a ) 。当敲除d 耐基因时，可以增强糖异生和糖 原合成酶的活性。这是通过细菌的基因组，从整体水平上实现对芳香氨基酸的中 心代谢途径的调控，并由此提出了“整体代谢工程”( g l o b a lm t a b o l i ce g e e r i n g ) 的概念。 总之，芳香族基酸在代谢途径上的调节方式是顺序抑制( s e p u e r t i a l i n h i b i t i o n ) ，在代谢途径的横向调节是代谢互锁( m e t a b a l i cm t c r l o c k ) ，是一个涉 及多个基因、多个因子、多个途径的复杂的代谢网络。要改造这个代谢网络，使 莽草酸产量大幅度提高绝不是可以一蹴而就。 1 3 1 3 共同途径和分支途径代谢流的定向分析 代谢途径分析【37 】表明，葡萄糖经糖酵解和磷酸戊糖途径分别生成磷酸烯醇式 丙酮酸和4 磷酸赤藓糖，两者在3 一脱氧d 阿拉伯庚酮糖酸7 磷酸合成酶的作用 下缩合成d a h p ，这是莽草酸生物合成的途径的第一步反应，也是决定莽草酸产 率和产量的关键步骤。因此，在大肠杆菌莽草酸合成中d a h p 是第一个也是最 重要的代谢中间物，能否把中心代谢流有效的导向d a h p 的合成是决定莽草酸 生物合成产量高低的决定因素。化学计量分析1 3 8 l 表明：由于葡萄糖的吸收需要糖 莽草酸基因工程菌构建的初步研究付小花 一磷酸基转移系统，吸收一分子葡萄糖需要消耗一分子p e p ，所以p e p 成为d a h p 理论产量的限制性底物。在野生型大肠杆菌中，以葡萄糖为碳源的情况下，如不 能循环利用由于p t s 系统而消耗的p e p ，d a h p 的理论产量仅为4 3 ( m o l m 0 1 ) ( 如图1 a 所示) 。有研究证明【3 9 】，在过量表达p e p 合成酶( p p s ) 时，此酶利用 a t p 水解释放的能量将丙酮酸转变为p e p ，其d a i 口的产量可以提高近一倍， 几乎达到最大理论产量8 6 ( m o l m 0 1 ) ( 如图1 b 所示) 。代谢流定量分析【删表 明：l m o l 葡萄糖要进入细胞后经糖酵解可生成2 m o l 的p e p ，而葡萄糖要进入细 胞需经过p t s 系统，p e p 是p t s 系统中的磷酸基供体，i m o l 葡萄糖的进入细胞 要将l m o l 的p e p 转变成丙酮酸，同时p e p 又可在丙酮酸激酶和p e p 羧化酶的 作用下分别生成丙酮酸和草酰乙酸。丙酮酸在生物体内由于高能障而不能自发的 转变回p e p ，使大量的碳流就经丙酮酸而生成有机酸、二氧化碳和细胞的内容物。 运用代谢控制理论和代谢流控系数，即可预测或控制代谢流的去向。 l 3 14 转运系统 底物吸收利用和产物的胞外分泌，在莽草酸生产上也很重要。在一些菌株中， 特别是大肠杆菌，底物吸收的不同机制已有详细研究【4 1 】。在以葡萄糖为唯一碳源 的情况下，其吸收是通过p t s 系统实现的。莽草酸穿膜运输机制目前还不是很 清楚，但有研究证明【4 2 】，幽谢基因编码的s h i a 蛋白与莽草酸从胞外的摄入有关， 剔除曲谢基因可减少莽草酸的摄入，最终可增加莽草酸的积累。在阻断葡萄糖 到莽草酸的反应同时敲除s h i a 的实验中发现细胞仍然从培养基中摄取莽草酸， 说明除s h i a 蛋白外，大肠杆菌中还存在其他的莽草酸摄入途径。 1 3 1 5 整体代谢网络调控 在了解细菌代谢调控及其生理功能分子机理的基础上，虽然取得相当大的进 步，但一些新的重要调控机制仍不断被发现。如2 0 世纪末发现的碳贮存调控因 子( c s r ) 3 5 1 ，该系统的主要组成部分c s r a 基因编码一个6 1 个氨基酸的小分子 蛋白，它是一个包含了r n a 结合结构域k h ( 4 习的特殊结合蛋白。在大肠杆菌中 可负调控指数生长后期的一些代谢途径，包括糖原的生物合成与分解代谢途径和 糖异生，而对糖酵解的一些重要基因的表达则执行正调控功能，同时还影响细胞 的表面特征及其对外环境的反应能力与适应性。 体外研究证实，c s r a 是通过反式作用元件与西g c 邻近的核糖体结合位点相 互结合促进了酉g c a pm r n a s 的降解，而g l g c a pm r n a s 是编码糖原合成酶和 糖原磷酸化酶。r o m e o t 4 4 等纯化了c s r a 蛋白，发现这种蛋白几乎全部都包含在 一个巨大的核蛋白复合体中，每一个复合体大约包含1 8 个c s r a 亚基和一个非编 码的r n a 分子c s r b 。事实上，c s r a 在激活g i g 基因的作用上比c s r a c s r b 复合物更具有活性，作用也远较明显；体内研究证实，高表达c s r b 可以使糖原 莽草酸基因工程菌构建的初步研究付小花 的积累增加，这也进一步表明，c s r b 在体内有拮抗c s r a 的作用。c s r a 和c s r b 的可能作用机制如图5 所示。 r n a s eeo ro t h e r ：翟黼酬坶 e n d o n u c m a s e s ? 图5 c s r a 和c s r b 的可能作用机制 c s r a 结合到g l g c a p 转录本可能通过如下机制而使之降解：( 1 ) c s r a c s r b 可能作为核酸内切酶直接作用底物或c s r a 的结合可能改变m r n a 的结构使之更 易于被降解；( 2 ) c s r a 的结合可能抑制核糖体的结合从而抑制翻译；( 3 ) 以上 两种机制的相互结合也有可能发生。c s r a 的活性受控于其自由形式和c s r b 的结 合形式之间的动态平衡。在此模型中，c s r b 在细胞内的聚集可激活c s r a 所抑制 的基因的活性，而c s r b 的降解则可以释放c s r a ，从而抑制c s r a 所抑制的基因 的活性。 另外，大肠杆菌中，f r u r 是果糖的抑制因子，它可以控制与碳利用有关的一 些基因的表达。有报道1 4 5 1 证实它通过对糖异生的相关基因的转录激活和对糖酵解 的相关基因的抑制从而调控碳代谢流。所以，对整体代谢网络基因的调控，不仅 可以抑制竞争代谢途径，而且可以使理想代谢途径碳代谢流得到增强。 1 3 2 莽草酸基因工程菌构建策略与优化 归纳起来，莽草酸基因工程菌构建策略主要考虑以下几方面因素：( 1 ) 宿主 菌及载体的选择；( 2 ) 加速限速反应；( 3 ) 改变代谢流；( 4 ) 降低副产物的产生；( 5 ) 整体代谢网络的重建。通过对以上几个方面的优化可望有效的提高莽草酸产量， 以达到工业生产的目的。 1 3 2 1 宿主菌和载体的选择 经典的株系改良选育包括以下几个步骤：( 1 ) 选择合适的宿主菌；( 2 ) 弱化或 消除生成副产物的代谢途径；( 3 ) 在酶的活性水平和转录水平上解除反馈抑制和 莽草酸基因工程菌构建的初步研究 付小花 反馈阻遏；( 4 ) 理想代谢途径关键酶的高表达。在选择宿主菌及载体时，既要考 虑表达载体的表达量和质粒转移及重组的可能性，又要考虑应用原料的范围、中 间产物的获得、宿主生理学和遗传背景及可能的环境污染问题等。目前，氨基酸 的生物合成主要采用大肠杆菌和棒状杆菌，莽草酸是芳香氨基酸合成的中间产 物，所以莽草酸的生物合成也以用大肠杆菌和棒状杆菌较为合适。虽然棒状杆菌 的代谢途径相对于大肠杆菌较为简单，但对其进行遗传操作较为困难；而大肠杆 菌则可以运用各种复杂的现代分子生物学技术对它进行遗传操作，有利于提高莽 草酸的产量积累。也有报道【l5 】以枯草芽孢杆菌为生产菌种，但其副产物奎尼酸的 产量与莽草酸的产量几乎相等或更高，这样就不利于莽草酸产量的大幅度提高。 莽草酸是芳香氨基酸合成的中间代谢产物，要提高莽草酸产量，使细胞大量 累积莽草酸，首先必须破坏共同途径莽草酸下游的酶莽草酸激酶的功能，这 样莽草酸就不能继续转化，从而累积起来，并且破坏莽草酸激酶功能后，由于芳 香氨基酸的合成遭到破坏，菌株成为三芳香氨基酸的营养缺陷型。而营养缺陷型 菌株由于缺陷一些副调控作用，在生物合成控制上具有一定的优势【4 “。这样，当 上游的一些抗反馈抑制的限制酶基因高表达时，就有可能累积大量的莽草酸。有 研究表明【4 ”，低拷贝质粒在代谢工程应用上比高拷贝质粒更为有效，所以在选择 高表达关键酶基因的表达载体时，应选择低拷贝且携带有强启动子的质粒。总之， 莽草酸的生物合成是复杂的系统工程，要提高莽草酸生产菌种的产量，需要从代 谢控制、菌种选育等多方面做深入的研究。 1 3 2 2 加速限速反应 可以通过关键酶基因的克隆表达和去除产物的反馈抑制等方面加速限速反 应。目前研究认为莽草酸合成的关键酶有：p e p 合成酶，转酮酶、转醛酶、d a h p 合成酶，3