（遗传学专业论文）猪白细胞介素46融合基因在动物体内的免疫调节效应研究.pdf

四川犬学研究生学位论支。 猪白细胞介素4 6 ( i l - 4 6 ) 融合基因 在动物体内的免疫调节效应研究 遗传学专业 硕士研究生：刘狄广指导老师：高荣教授 摘要 为探索安全高效的新型动物分子免疫增强剂，本实验利用猪新型融合基因 i l - 4 6 与真核载体v r l 0 2 0 连接得到了v r p i l 4 6 ，以离子交联法制各了壳聚糖纳米 颗粒( c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e s ，c n p ) ，探索了c n p 包装p i l 4 6 和介导d n a 转染动 物细胞的特征。用c n p 包裹v r p i l 4 6 ，分别用口服和肌注两种方式接种2 1 日龄昆 明小鼠后，每周尾静脉采血用e l i s a 分析免疫小鼠i g g 、i g a 、i g m 、i l 2 、i i a 和i l 6 水平，检测淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和白细胞数量的变化，观察v r p i l 4 6 及其壳聚糖纳米颗粒包装后对小鼠免疫应答及免疫保护的调节作用。实验结果 发现：v p l l 4 6 c n p 和v p i l 肛c n p + v p i l 6 c n p 接种小鼠的体液免疫机能较对照 组显著增强，其血清中i l 屹、i l 一4 和i l 一6 含量显著高于对照组，外周血液的白 细胞和淋巴细胞数量也较对照组显著增加。免疫后3 5 日以沙门氏菌腹腔注射攻 毒实验小鼠，检测结果发现：v p i i a 6 c n p 组小鼠的体液和细胞免疫应答指标均 显著高于对照小鼠，v p i i a 6 c n p 接种小鼠健康存活，而对照小鼠发病，出现以 胃、十二指肠、空肠粘膜等处出血、肝脾肿大等为主的病变。这些结果表明： v p i l 4 6 c n p 可显著增强小鼠体液和细胞免疫应答水平，增强对微生物感染的抗 病力。 将v r p i l 4 6 经c n p 包装后联合兰耳病疫苗免疫实验猪，检测了对猪的体液和 细胞免疫应答以及特异性免疫水平的影响。结果发现：与对照组对比，v r p i l 4 6 四川大学研究生学位论文 壳聚糖纳米颗粒免疫猪的免疫球蛋白含量、i l - 2 、i l - 4 、i 卜6 水平和免疫细胞 数量均显著增加，说明v r p i l 4 6 壳聚糖纳米颗粒能够显著增强猪对疫苗的细胞和 体液免疫应答反应；同时蓝耳病抗体含量也较对照猪显著增加，猪的特异免疫 应答反应明显提高。所有这些结果都提示v r p i l 4 6 壳聚糖纳米颗粒能显著增强动 物的免疫机能和免疫应答反应，增强了对传染病的抗病力，有望成为一种新型 高效的猪用融合基因免疫增强剂。 关键词：融合基因，v r p h 。4 6 ，猪，壳聚糖纳米颗粒，免疫应答 2 四j = l k 学研究生学位论文 t h es t u d yo ni m m n u o r e g u a lt i o no ff u s i o ng e n eo f p o r c i n ei n t e r l e u k i n 6a n di n t e r l e u k i n 4i na n i m a l s m a j o r ：g e n e t i c s g r a d u a t es t u d e n t ：l i ud i g u a n g t u t o r ：p r o f g a or o n g a b s t r a c t i n0 r d e rt od e v e l o ps a f ea n de f f e c t i v em l m u n ea d j u v a n to fa n i m a l s ，w e r e c o n s t r u c t e dt h ep o r c i n ei d 6a n di l 4g e n e a n dg e tt h en o v e lf u s i o ni l - 4 6g e n e f u r t h e r m o r e , w eg e tv r p i l 4 6 、v r p i l 4 a n dv r p l l 6 t h ec h i t o s a nn a n o p a r t i c l ew a s p r e p a r e db yi o n - c r o s s i n gm e t h o d ，a n dt h i sv r p i i a 6w a se n t r a p p e dw i t hc h h o s a n n a n o p a r t i c l e s ( c n p ) a n du t i l i z e dt oi m m u n i z ek u n m i n gm i c ew h i c hi nt w ow a y s a t t h ea g eo f2 1d a y s t h ep e r i p h e r a lb l o o dw a sw e e k l yc o l l e c t e df r o mt h et a i lv e i no f i n o c u l a t e dm i c et od e t e c tt h ee f f e c t so fv r p i l 4 6c h j t o s a n n a n o p a r t i c l e so ni m m u n e r e s p o n s e so fm i c e t h er e s u l t sw e r ef o u n d e dt h a t , c o m p 盯e dw i t ht h o s eo ft h e c o n t r o l ，t h ec o n t e n to fi m m u n o g l o b u l i n s ，d o m i n a n t l yi g gi n c l u d i n gl e aa n dk m ， a n ds p e c i f i ca n t i b o d i e st ot h ev a c c i n e sa g a i n s ts w i n ef e v e r , t h ep a s t e u r e l l o s i sa n d s t r e p t o c o c c u sm o u n t e ds i g n i f i c a n t l yi nt h es e r af r o mt h ev p i l 4 6 c n p , v a c c i n a t e d m i c e ，t h ea n a o u n to fi l 2 ，i l 4a n d i l 6i n c r e a s e dr e m a r k a b l yi nt h e s e r ao f i m m u n i z e dm i c c ，s ow e f et h en u m b e ro fw h i t eb l o o dc e l l s ，l y m p h o c y t e sa n d m o n o c y t e s ，g r a n u l o y t e so ft h em i c ei m m u n i z e dw i t h v p i i a 6 一c n p a f t e rt h e c h a l l e n g eb yv i r u l e n tp a s t e u r e l l o s i sa n ds t m p t o c o c c u s ，t h e s ei m m u n ev a l u e sw e r e r e s p e c t i v e l ye l e v a t e dt od i f f e r e n te x t e n ti nt h em i c ev a c c i n a t e dw i t hv p i l 4 6 - c n p t 1 l em o s to fi m m u n i z e dm i c es u r v i v e d ，w h i l et h ec o n t r o lm i c ef e l li l lw i t ht h e e v i d e n tl e s i o n sw i t hd i f f u s eh e m o r r h a g ei ns t o m a c h ，s m a l li n t e s t i n e sa n dp e r i t o n e u m 3 四川大学研究生学位论文 t h e nv p l l 4 6 一c n pw a su s e dt oi m m u n i z ep i ga l o n gw i t hr e s p i r a t o r ys y n d r o m e v a c c i n e 1 h ee f f e c t so fv p 4 6 c n pw e r ei n v e s t i g a t e do ue e l i n l a ra n dh u m o r a l i m m u n el e v e l so fp i ga n da n t i g e n s p e c i f i ca n t i b o d yr e s p o n s e s 1 1 l er e s u l t ss h o w e d t h a t , i nc o m p a r i s o nw i t ht h ec o n t r o l ，t h ea m o u n t so fi m m u n g l o b u l i n s ，s p e c i f i c a n t i b o d y 。c o n t e n t so fi n t e r l e u k i n sa n dn u m b e r so fi m m u n o c y t e sw e r ea 1 1e l e v a t e d r e m a r k a b l y ( p o 0 5 ) t h e s ei n d i c a t e dt h a tv p i l 4 6 一c n pc o u l do b v i o u s l yb o o s tt h e i m m u n er e s p o n s e so fp i ga n di n c r e a s ep r o t e c t i v ei m m u n i t y a l lt h e s er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tv p i l 4 6 一c n pc o u l dr e m a r k a b l ym a g n i f yi m m u n i t ya n dr e s i s t a n c eo f a n i m a l sa g a i n s ti n f e c t i o u sp a t h o g e n s ，a n db eu t i l i z e dt od e v e l o pu c wp r o m i s i n g e f f e c t i v em o l e c u l a ri m m u n o a d j u v a n tf o rf u t u r ev a c c i n a t i o na n dc o n t r o la g a i n s t i n f e c f i o u sd i s e a s e so fp o r c i n e k e y w o r d s f u s i o ng e n e ，p o r c i n e ，m o u s e ，v r p i i a 6 ，c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e s ， i m m u n er e s p o n s e 4 四川犬学研究生学位论文 刖茜 养猪业是我国的传统产业，有着悠久的历史，在农业和农村经济中占有重 要地位。我国是世界养猪生产和消费第一大国，猪存栏、出栏总量世界第一 猪的疾病，特别是传染的病毒病、细菌病和寄生虫病，经常给养猪业带来巨大 损失乃至导致养猪业的毁灭，是限制养猪业的发展的最重要因素之一。猪的主 要病毒和细菌传染病( 包括猪瘟、猪丹毒、肺疫、仔猪黄、白痢、副伤寒、蓝 耳病等) 传染性强，发病率高，患畜不仅生长发育迟缓，生产性能下降，而且 免疫机能受到抑制，易继发或并发其它病原感染，使病程加重，最终死亡，每 年给畜牧业带来重大经济损失。一些人畜共患的寄生虫病，不仅每年给畜牧业 带来巨大的经济损失，也严重危害疫区人类健康安全( 罗建等，2 0 0 5 ) 。增强动 物抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率是当前防治传染性疾病最可靠的 简便途径( l o r e n z oe ta l ，2 0 0 6 ) 。因此研制和应用新型高效动物免疫增强剂对防 治现代畜牧业的疾病具有十分重要的现实作用和紧迫性，这在养猪业中表现尤 为突出。有选择地增强与免疫保护密切相关的特定免疫细胞活性，才能使疫苗 动物建立坚强而持久的特异性免疫保护力，并提高机体的整体免疫水平，达到 免疫防病和治病，防止病原感染的根本目的。猪的疾病诊断一直都是研究热点， 到现在都有人专门做这样的研究。( 冯万宇等，2 0 0 6 ) 现代畜牧业的发展日益趋于集约化和规模化，由于抗生素治疗和饲料添加 剂的广泛应用，病原微生物基因的不断漂移和突变( 病毒、细菌表现尤为突出) ， 使病菌的抗药性增强，加之环境污染，密集的饲养与管理经常使动物处于应激 状态，使动物免疫防御能力下降，对灭活疫苗接种免疫应答抑制或削弱，免疫 保护率降低，造成传染性疾病在密集的动物群体中更易发生或流行。现代免疫 学研究进一步发展：许多病原( 病毒、细菌、寄生虫等) 感染动物后，其自身 分泌或诱导机体产生多种免疫抑制物质，使机体的重要免疫调节因子生成减少， 补体含量下降。这些均造成宿主免疫功能低下，疫苗免疫失败或对灭活疫苗接 5 网川大学研究生学位论文 种免疫抑制或削弱，免疫保护率降低，动物易并发或继发其它感染，引起重大 损失。目前防治畜禽疾病的主要方法是药物治疗，疫苗免疫和增强免疫抗病能 力。而第三种防治备禽疾病方法是现在的研究热点。 细胞因子基因是一种疫苗的高效免疫增强剂，使用得当能够大幅度提高疫 苗的免疫保护率和机体的免疫水平( g a u d u i na n dm a r i e - c l a i r e ，2 0 0 6 ) 。这种全 新的“第三代免疫增强剂”如同d n a 疫苗一样，具有安全离效，活性持久，规模生 产成本低，使用简便，易保存运输和应用等，有着传统免疫增强剂所缺少的优点， 能够特异高效而持久地增强机体免疫防御能力，强化疫苗免疫应答，提高免疫保 护水平，达到经济方便地防治目前难以控制的病毒、细菌性传染病和寄生虫病； 并且预防条件性病原造成难于控制的复杂感染和疾病( r a y m o n dc ta l ，2 0 0 6 ) 。新 型免疫增强剂必将首先在动物医学及保健方面获得广泛应用，有力推动各类动 物传染性疾病的预防和治疗，保障畜牧业的顺利发展和人类健康及食品卫生安 全。 白细胞介素4 ( i l 一4 ) 是具有多种生物学功能的细胞因子，i l - 4 可以作用于 t 细胞、b 细胞、胸腺细胞、肥犬细胞、巨噬细胞等多种靶细胞，激活的b 细胞 产生的抗体主要是i g g l 和i g e ，是机体体液免疫的重要调节因子( 周延冲， 1 9 9 2 ) ，也在粘膜免疫中也发挥着重要作用。白细胞介素一6 ( i n t e d e u k i n 6 ，i i - - 6 ) 是迄今发现的功能最为广泛的细胞因子之一，能够刺激b 细胞的分化和i g g 的 产生，亦能刺激外周t 细胞( p e r i p h e r a ltc e l l ) 和胸腺t 细胞( t h y m i ctc e n ) 成熟 分化为细胞毒型，r 细胞( c y t o t o x i c t l y m p h o c y t e ，c t l ) ( k i s h i m o t ot ，1 9 9 5 ) ， 能够抑制人成纤维细胞及羊膜细胞的多种病毒，抗成纤维细胞有丝分裂，诱导 特异性干扰素激活基因，刺激由s p a - c o , a n - i 型激活的正常b 细胞分泌i g m 和i g g ，诱导e b 病毒转化的b 细胞分泌i 酬和i g g ，刺激肝细胞，诱导急性期 蛋白的表达( m u l ej j ，1 9 9 0 ) ，在机体免疫应答、骨髓造血，自身免疫和机体防御 等方面均起到重要作用( m a a l l e re ta l ，2 0 0 6 ) 。 细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他 有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。其结构特点 6 四川大学研究生学位论文 为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用， 使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强( l e ea y ，c ta l ，2 0 0 3 ) 。细胞因子融 合基因，包括人的i l 2 i l 6 ，g m c s f - i l - 3 和g m c s f e p o ( r o c kfc ta l ，1 9 9 2 ； b r u n oee ta l ，1 9 9 2 ；c o s c a r e n aae ta l ，1 9 9 7 ) 已经早有报道能够提高人的免疫能 力i l 一4 和i l 一6 相互调节在很多文献中己有报道，在成骨细胞中i l 一4 可 诱导i l 一6 的分泌，其作用是i l - 1 3 的l o 倍( s i nbe ta 1 1 9 9 6 ) 。i l 一6 可抑 制t h 2 细胞炎症因子的分泌，而这种调节作用需i l - 4 的参与( l e v yfe t a l ，1 9 9 7 ) 。 目前虽有一些关于一4 、i l - 6 表达性质粒作为分子免疫佐剂调节免疫水平 和疫苗免疫应答的报道，但这些报道大多足针对人的细胞因子表达性质粒的研 究。国外对人的一些疾病如h o d g k i n 氏病( k h a ne ta l ，2 0 0 6 ) 、h 1 v ( t r a o r ec ta l ， 2 0 0 4 ) 的研究。国内外目前对猪细胞因子，4 、i l - 6 基因经过重组作为分子免疫 增强剂的研究还未见报道，我们实验室针对这种情况，几年来在这方面开展了 很多工作。因此，我们研究融合细胞因子v r p i l 6 4 的生理活性及在疾病和疫苗 免疫中的作用，为研制新型的商效双分子免疫佐剂，提高猪的免疫应答能力， 增强其抗病性具有重要的现实意义。 7 四川大学研究生学位论文 第一部分新型免疫刺激分子v r p il 6 4 在小鼠 体内免疫活性的研究 摘要 本实验是将本实验室构建的与真核表达载体v r p i l 6 4 、v r p i l 4 、v r p i l 6 用壳 聚糖纳米颗粒包裹，得到了v p l 4 6 - c n p 、v p i l 4 - c n p 、v p i l 6 - c n p 。然后用包裹 的质粒分口服和注射两种方式免疫小鼠。每周自小鼠尾静脉采血，做血细胞计 数及e l i s a 检测免疫球蛋白、细胞因子；3 5 天后以腹腔注射沙门氏菌攻毒小鼠， 检测所构建的免疫分子v r p i l 6 4 对小鼠免疫应答的佐荆作用及对疫苗免疫保护 的影响。实验结果发现：v r p l 6 4 壳聚糖纳米颗粒接种小鼠的体液免疫机能较对 照组显著增强，其血液中i g g i g 和i g a 不同程度地增多( p o 0 5 ) ，其血清中 i l - 2 、i l q 和i l 一6 含量显著高于对照组( p o 0 5 ) ，外周血液的白细胞和淋巴细 胞数量也较对照组显著增加( p o 0 5 ) ；攻毒后v r p i l 6 4 组小鼠的上述免疫指标 均显著高于对照小鼠( p o 0 5 ) ，接种小鼠存活率大大提高，而对照小鼠发病， 出现以胃、十二指肠、空肠粘膜等处出血、肝脾肿大等为主的病变。这些结果 表明：v r p i l 6 4 可显著增强动物体液和细胞免疫应答水平，增强了对沙门氏菌的 抗病力，提示v r p i l 6 4 可作为一种有效的新型疫苗佐剂。 关键词：小鼠，v r p i l 6 4 ，疫苗，免疫应答，免疫保护 1 引言 上个世纪以来，很多种物质都被作为佐剂来研究，以得到提高动物的抵抗 疾病的能力。随着分子生物学和免疫学的发展，很多细胞因子被当做免疫佐荆 束用，这些细胞因子包括白细胞介素，干扰素，e p o ，g m - c s f 等( l e c l e r cca n d r o n c oj ，1 9 9 8 ：d o n g ，1 9 9 5 ) 。沙门氏菌对动物的危害很大，很多细胞因子针 8 四川大学研究生学位论文 对它来研究并取得了很多研究成果( s a s h i n a m ie ta l ，2 0 0 6 ) 。有白细胞介素4 和白细胞介素6 是两种有多种生物功能的细胞因子，它们对免疫系统具有很重 要的调节功能。以前的研究报道了人的自细胞介素4 和白细胞介素6 在抗癌和 抗细菌中有很好的医疗价值( d i j s s e l b l o e mne ta l ，2 0 0 4 ：l a r see ta l ， 2 0 0 1 ) 。在动物医学研究中，自细胞介索4 和白细胞介素6 也显示出了巨大的 提高动物免疫能力的潜在功f i ( k i mt se ta l ，2 0 0 0 ；v a ns n i c kje ta l ，1 9 8 8 ) 。 但是，成本高加上在体内的作用时间短一直是阻碍这两种细胞因子在动物上广 泛应用的原因。近年来的实验证实了细胞因子基因的发展应用可以作为动物疫 茁来增强动物的免疫能力，而且可以克服成本高和在体内的作用时间短的缺点 ( n o b i r o nlc ta l ，2 0 0 1 ；s o m a s u n d a r a m a c ta l 1 9 9 9 ) ，这就给动物研究指出了一 个新的方向。 融合基因近年来被证实足一种很有效的调节动物免疫反应的免疫佐剂，其 中，细胞因子融合基因是其中的研究热点，现在已经报道了包括人的i l 2 i l 6 ， g m c s f - i l 一3 和g m - c s f - e p o ( r o c kfe ta l ，1 9 9 2 ；b r u n oee ta l ，1 9 9 2 ；c o s c a r e l l a a c ta l 。1 9 9 7 ) 。这些融合基因都能提高人对疾病的抵抗能力。细胞因子的功能浯 性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学 活性较各单体大大增强( k e a y e ta l ，2 0 0 3 ) 然而，现在还没有关于i l 4 和i l 6 的融合基因的报道。壳聚糖纳米颗具有很好的生物相容性，是一种具有很大潜 力的缓释材料( g u p t ak ce ta l2 0 0 0 ；j a n e sk a c ta l2 0 0 1 ) 。壳聚糖可包裹浓缩 d n a ，形成小的分散颗粒，将壳聚糖d n a 复合物用于基因运载和转染表达时，能 有效携带目的基因进入靶细胞中。包封于壳聚糖颗粒中的物质，其释放率主要 决定于壳聚糖的生物降解和溶蚀，因此物质释放明显延长q a m e e l as r e ta l ，1 9 9 8 ； j a n e sk a e ta 1 2 0 0 1 ；c a l v ope ta l ，2 0 0 1 ) 。初步研究结果发现：基于壳聚糖的颗 粒系统在生物医学方面具有广阔的应用前景 我们首次研究了猪i l - 4 6 作为免疫佐剂对小鼠免疫机能和免疫保护效应 的影响，为探索研制高效安全、效应持久的新型免疫增强剂奠定了初步基础。 9 四川大学研究生学位论文 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 质粒和攻毒菌 质粒：v r l 0 2 0 ，真核表达载体，美国v i c a l 公司提供； 质粒：v r p i l 6 4 、v r p i l 4 、v r p i l 6 ，由本实验室柯建； 攻毒菌为致病沙门氏菌，农业部成都药械厂提供。 2 1 2 实验动物 2 1 日龄昆明小白鼠，由中国医学科学院输血研究所实验动物中心提供。 2 1 3 主要试剂 壳聚糖分子量为1 5 0 k d ，脱乙酰度9 5 以上，中国科学院成都有机化学研究所 提供。 小牛血清购自华西生物公司。 肝素钠购自成都生化制药厂。 辣根过氧化物酶联葡萄球菌a 蛋白：购自上海生物制品研究所 l b 培养基：胰蛋白胨l o g l ，酵母抽提物5 9 l ，n a c il o g l ，用1 nn a o h 调 节p h 至7 5 2 1 4 主要仪器设备 恒温水浴锅：d k - 8 d 型电热恒温水槽，上海精宏试验设备有限公司 低温台式高速离心机：b e c e t a na v a n t i “3 0 恒温培养箱：上海跃进医疗器械一厂 超净工作台：f r o m as c i e n t i f i c1 8 2 9 s n 1 7 0 6 9 1 5 电泳系统：b i o - r a d m a v l 2 0 ，s a v a n ti n s t r u m e n t si n c 紫外分光光度计：上海第三分析仪器厂 电子天平：m e t t e ra e 2 6 0 型，d e l t a l a n g e 公司 1 0 四j i 大学研究生学位论文 2 2 方法 2 2 1 免疫用质粒d n a 的制备 按常规方法制备质粒v r p i l 6 4 、v r p i l 6 4 、v r p i l 6 4 、v r l 0 2 0 ：接种菌液于 3 m i l k 培养基( 含5 0 p 9 4 dk a n 的l b 培养基) ，3 7 0 c 振摇过夜。将培养基转移 到e p 管中，1 2 ，0 0 0 r m p 离心1 分钟，去上清，加入5 0 0 u l s t e ( 0 1 m o l t n a c l ，l o m m o l lt r i s h c lp h 8 0 ，i m m o l l e d t ap h 8 o ) 打匀，1 2 ，0 0 0 r m p 离心1 分钟，弃上清；加入2 0 0 吵i 溶液i ( 1 葡萄糖，2 5 m m o l lt r i s - h c l p h 8 0 ，l o 姗o l le d t a ) ，悬浮菌体，室温放置5 分钟；加入3 0 0 恤l 溶液i i ( o 2 m o l ln a o h ，1 s d s ) ，轻轻翻转混合，冰浴5 分钟；加入2 5 0 “1 溶液i i i ( 3m o l l k a c ，p h 4 8 ) ，轻轻翻转混合，冰浴l o 分钟；1 2 ，0 0 0 r p m 离心5 分钟两次，转 移上清至新e p 管内，加入2 倍体积的冰无水乙醇，1 1 0 体积i a c ，混匀，- 2 0 。c 放置- 4 , 时以上；1 2 ，0 0 0 r p m 离心l o 分钟，去上清，7 0 乙醇沈涤后室温干燥， 加入5 0 i lt e r ( 含1 0 烬m lr n a s e a 的t e 缓冲液) ，3 7 。c 水浴3 0 分钟；取2 山电泳观察，剩余4 8 一用酚氯仿抽提后无水乙醇沉淀，溶手4 0 “1d d h ：0 ，一2 0 。c 保存溶解于灭菌生理盐水，用紫外分光光度计测其浓度。 2 2 2 纳米颗粒的制备 用离子交联法( b o d m e i e re ta 1 ，1 9 8 9 ) 制备质粒壳聚糖纳米颗粒。将壳聚 糖溶液( p h 5 5 ) 和v r p i l 6 4 、v r p i l 6 4 、v r p i l 6 4 、v r l 0 2 0 ( 含适当浓度三聚磷酸 盐) 溶液5 0 水浴分别恒温2 0 m i n ，然后均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液5 m i n ， 即得v r p i l 6 4 、v r p i l 4 、v r p i l 6 、v r l 0 2 0 的壳聚话纳米颗粒样品液并分别用 v p i l 4 6 - c n p 、v p i l 4 - c n p 、v p i l 6 - c n p 和v r l 0 2 0 一c n p 来表示。 2 2 3 纳米颗粒的形态、粒径及z e t a 电位测定 取少量的v r p i l 6 4 壳聚糖纳米颗粒样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗 粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用z e t a s i z e r 。 阴川大学研究生学位论文 3 0 0 0 h s i h p l 纳米粒度分析仪测定粒径、分散度及z e t a 电位。 2 2 4 凝胶阻滞分析 分别取v r p i l 6 4 、v r p i l 4 、v r p i l 6 溶液和未经纯化的v r p i l 6 4 、v r p i l 4 、 v r p i l 6 壳聚糖纳米颗粒样品液进行0 8 琼脂糖凝胶电泳，观察两组电泳结果的 不同。 2 2 5 实验动物分组 昆明鼠9 0 只，随机分为6 组，每组1 5 只。参考文献( d r e wd r ，e ta 1 2 0 0 0 ) 采用( 1 ) ：肌肉注射法，通过注射小鼠两侧股四头肌免疫小鼠( 8 组) ：( 2 ) 口服 免疫小鼠( a 组) 。每组免疫量如下：a i 组每只小鼠口服3 0 p m o l v p i l 4 6 一c n p ， a 2 组每只小鼠口服3 0 p m o l v p i l 4 一c n p 和3 0 p m o l v p i l 6 一c n p ；b 1 组每只小鼠肌肉 注射6 p m o l v p i l 4 6 一c n p ，b 2 组每只小鼠肌肉注射6 p m o lv p i l 4 - c n p 和6 p m o l v p i l 6 一c n p ；对照组的c 1 组每只小鼠肌肉注射6 p m o l v r l 0 2 0 ，c 2 组每只小鼠肌 肉注射6 p m o lv r l 0 2 0 - c n p 。5 周后每只小鼠腹腔注射沙门氏菌0 4 m l 进行攻毒 ( 3 x 1 0 9i m l ) 。动物免疫具体分组情况见表1 。 表1 免疫小鼠分组 免疫小鼠分组免疫途径和免疫试剂 a l a 2 b l b 2 c 1 c 2 口服v p i l 4 6 一c n p 口服v p i l 4 一c n p + v p i l 6 一c n p 肌注v p i l 4 6 - c n p 肌注v p i l 4 - c n p + v p i l 6 一c n p 肌注v r l 0 2 0 肌注v r l 0 2 0 - c n p 1 2 四川丈学研究生学位论文 2 2 6 体液免疫反应的检测 ，j 、鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，用以检测体液免疫反 应。 i g g 、i g a 及i g m 的含量测定：将小鼠血清用重碳酸盐包被缓冲液( 3 0 r a mn a 2 c 0 3 ， 7 5 r a mn a h c 0 3 ，p h 9 6 ) 稀释1 0 5 ( i g g ) 或1 0 4 ( i g a ，i g m ) 倍后包被9 6 孔c o s t e x 酶标板，4 c 过夜。倒掉包被的血清，用含有0 1 t w e e n - 2 0 的磷酸盐缓冲液( p b s ) 洗涤3 遍，空干后加入l o o u l 用i b s a 以1 ：8 0 0 稀释的特异性兔抗鼠i g g 、i g m 和i g a 重链抗体( 大连t a k a r a 公司生产) 作一抗，3 7 c 温育1 小时。p b s 洗 涤3 次后加入1 ：1 0 0 0 倍稀释的酶标羊抗兔i g g ( 华美生物工程公司) ，3 7 c 温 育1 小时。洗涤3 次后加入1 0 0 u lt m b 底物液( 四甲基联苯胺) ，”温育3 0 分钟。加入5 毗l2 mh 2 5 0 4 反应，m i c r o p l a t er e a d e r3 5 5 0 ( b i o r a d , h e r c u l e s ， c a l i f o r n i a ，u s a ) 铡样品4 5 0 r i m 光吸收值。 2 2 7 特异性抗体的测定： 制备沙门氏菌抗原蛋白包被c o s t a r 酶标板，实验鼠血清1 0 0 倍稀释为一抗， 1 ：1 2 0 0 释的羊抗鼠k g a b c 为二抗，t m b 为底物，s a b c 法测定实验动物血 清中沙门氏杆菌特异性抗体含量。具体操作同上。 2 2 8 细胞因子的检测 小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，实验鼠血清1 0 0 倍稀释包被 c o s t a r 酶标板，兔抗鼠i l 一2 、i l 一4 、i l 一6i g g 抗体( 美国，b e t h y l 公司提供) 为一抗，t m b 为底物，s a b c ( 武汉博士德生物工程公司提供) 法检测血清中i l - 2 、 i l 一4 及i l 一6 含量，具体操作同前上。 2 2 9 免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化 小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，常规法血球自动计数仪计数分类。 四川大学研究生学位论文。 2 2 1 0 攻毒小鼠器官病变的检测 小鼠免疫3 5 天后，每组取l o 只小鼠腹腔注射沙门氏菌进行攻毒。观察实 验小鼠生长情况；对死亡小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况。 2 2 1 l 数据分析 上述各种数据均用方差分析进行差异显著性比较，以p o 0 5 为差异显著性 标准。 3 结果 3 1 纳米粒的形态、粒径及z e t a 电位 透射电镜观察结果表明：壳聚糖纳米颗粒多呈球形( 图1 ) 。纳米粒度分析仪 ( 3 0 0 0h s i h p l ) 测定结果为：平均粒径为4 5 r i m = 多分散度为0 1 9 0 ( 图2 ) ；z e t a 电位为+ 2 5 6 m v ，说明纳米颗粒表面带有正电荷 图1c p g - 壳聚糖纳米颗粒透射电镜图( 5 0 0 0 0 ) 四川大学研究生学位论文 馨 卫。 呈 水 八 k ” = _ ” ” 图2 壳聚搪纳米颗粒粒径分布 3 2 凝胶阻滞分析 图3 为o 8 琼脂糖凝胶水平电泳图。m 表示m a r k e r ，l 、3 、5 分别是v r p i l 6 4 、 v r p i l 4 、v r p i l 4 ，2 、4 、6 分别是1 、3 、5 的壳聚糖包裹组。比较非包裹组和 包裹组可以看出，包裹组的质粒片段完全被阻滞在加样孔中而发亮，说明质粒 全部与壳聚糖结合在一起，未能移动出加样孔。 1 图3 为v r p l l 6 4 壳聚糖纳米颗粒凝胶阻滞电泳 m ：m a