（遗传学专业论文）洋葱细胞核仁结构与rdna复制的动态关系.pdf

摘要 核仁是真核生物细胞中合成加工r r n a 和生产核糖体的场所，它的超微结构主要是 由三种基本结构组分组成：纤维中心( f c ) ，致密纤维组分( d f c ) 和颗粒组分( g c ) 。 在细胞周期中，核仁是一种高度动态的结构，呈现规律性的消失与重建，其结构与功能 都发生很大的变化。本文以洋葱为材料，通过常规电子显微镜和电子显微镜放射自显影 的方法，对核仁结构在细胞周期中的变化规律和r d n a 的复制问题进行了研究。 实验结果如下： 1 早g 1 期核仁出现，核仁数目相对较多且体积较小；s 期和g 2 期细胞中核仁数目 减少，体积相对变大；前期核仁变形变小，数目变多，最后核仁消失。 2 s 期核仁边缘呈毛绒状，核仁与其周边染色质联系紧密。 3 核仁f c 中的染色质在不同时期存在着集缩和解集缩状态的动态变化过程。g l 期 f c 中有电子密度较高的大染色质块，染色质集缩程度高；s 期f c 中染色质块变小，染 色质比g 1 期相对松散，集缩程度降低；g 2 期f c 中染色质块很小且电子密度较低，染色 质趋于解集缩状态；在前期核仁f c 中染色质呈解集缩状态。 4 核仁中f c 和d f c 结构在细胞周期的进程中存在着动态的变构过程。g 1 期d f c 小 且不明显，只有少数较大的f c 分布；s 期d f c 范围增大，电子密度较高，d f c 分布呈区 域性，有的d f c 区域内有f c 分布，也有一些较大范围的d f c 区域内没有f c 分布，此时 出现少数较小的f c ；在g 2 期d f c 范围进一步增大，电子密度高，呈区域性分布更加明 显，在每个d f c 区域内都有很多f c 均匀分布在其中，并且小f c 数量增多；前期核仁中 d f c 变小且模糊，已不呈区域分布，f c 数量明显减少，最后f c 和d f c 结构消失。 5 核仁中r d n a 的复制位置主要分布在核仁边缘的颗粒区和核仁相随染色质部位。 r d n a 的复制时期最早起始于g 1 期的较晚时期，此时只有少数细胞核仁中的r d n a 进行复 制；s 期是r d n a 复制的主要时期，此时复制比较活跃；在g 2 期复制并没有立即停止， r d n a 的复制一直延续到g 2 期结束。 关键词：洋葱；核仁；f c ；d f c ；r d n a 复制 a b s t r a c t n u c l e o l u si st h ed o m a i ni nw h i c ht r a n s c r i p t i o na n dp r o c e s s i n go fr r n aa n da s s e m b l yo f r i b o s o m e st a k e p l a c e i n e u k a r y o t e s ，i t su l t r a s t r u c t u r e i s c o m p o s e d o ft h r e e b a s i c s u b c o m p a r t r n e n t s ：f i b r i l l a rc e n t e r s ( f c ) ，d e n s e f i b r i l l a rc o m p o n e n t ( d f c ) a n dg r a n u l a r c o m p o n e n t ( g c ) i nt h ec e l lc y c l e ，t h en u c l e o l u si sah i g h l yd y n a m i cs t r u c t u r e ，i ti sa s s e m b l e d a tt h ee n do fm i t o s i sa n dd i s a s s e m b l e di np r o p h a s e w i t hi t ss t r u c t u r ea n df u n c t i o n sc h a n g e l a r g e l y i na i l i u mc e p a ，b yu s i n gc o n v e n t i o n a le l e c t r o nm i c r o s c o p ya n de l e c t r o nm i c r o s c o p y a u t o r a d i o g r a p h y , w ei n v e s t i g a t e dt h em o r p h o l o g i c a lc h a n g eo ft h en u c l e o l a rs t r u c t u r ea n dt h e p r o b l e mo f r d n a r e p l i c a t i o ni nt h ec e l lc y c l e t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 ，t h en u c l e o l ib e g a nt oe m e r g ea tt h ee a r l ys t a g eo f g lp h a s e ，t h e r ew e r es e v e r a ls m a l l n u c l e o l i i nsa n dg 2p h a s e ，t h ec e l lh a db i g g e rb u tf e w e rn u c l e o l i i np r o p h a s e ，t h en u c l e o l i w e r es m a l l e r , a n dt h es h a p eo f t h e mc h a n g e d ，t h e nt h en u c l e o l id i s a p p e a r e d 2 h 1sp h a s e ，t h en u c l e o l a rr i ms h o w e dm o r el i n k i n gt ot h ep e r i p h e r a lc h r o m a t i n s 3 i nd i f f e r e n tp h a s e t h e r ew a sad y n a m i cp r o c e s sf r o mc o n d e n s e dc h r o m a t i nt o d e c o n d e n s e dc h r o m a t i ni nf c s i ng 1p h a s e ，t h ec h r o m a t i nc l u m p sw e r eb i ga n dt h e c h r o m a t i nc o n d e n s e dh i 曲l yw i t hh i g he l e c t r o n i cd e n s i t y i nsp h a s e ，t h ec h r o m a t i nc l u m p s c h a n g e ds m a l l ，t h ec h r o m a t i nw e r el o o s e ra n d l e s sc o n d e n s e dt h a ng 1p h a s e i ng 2p h a s e ，t h e c h r o m a t i nc l u m p sw e r es m a l l e rw i t hl o we l e c t r o n i cd e n s i t y , a n dt h ec h r o m a t i nt e n dt o d e c o n d e n s e d t h e ni np r o p h a s e ，t h ec h r o m a t i ni nf c sw e r ed e c o n d e n s e d 4 t h es t r u c t u r eo ff c sa n dd f c sh a dad y n a m i cp r o c e s si nt h ec e l lc y c l e i ng 1p h a s e ， d f c sw e r es m a l lb u tn o tc l e a r , a n df e wb i gd f c si nt h e m i nsp h a s e ，d f c sw e r eb i gw i t h h i g he l e c t r o n i cd e n s i t y , a n ds h o w e dr e g i o n a l i z e dd i s t r i b u t i o n s o m ed f c sh a df c s w h i l e s o m eb i gd f c sh a dn o tf c si nt h e m ，a n ds e v e r a ls m a l lf c sa p p e a r e d i ng 2p h a s e ，d f c s w e r eb i g g e rw i t hh i g h e re l e c t r o n i cd e n s i t y , a n dd f c ss h o w e dr e g i o n a l i z e da n dc e n t r a l i z e d d i s t r i b u t i o no b v i o u s l y t h e r ew e r em a n yf c si ne a c hd f c s ，a n dm o r es m a l lf c si nt h e m h i p r o p h a s e ，d f c sc h a n g e ds m a l la n dv a g u e ，a n dw e r en o tr e g i o n a l i z e dd i s t r i b u t i o n ，t h en u m b e r o f f c s r e d u c e d ，t h e nf c sa n dd f c sd i s a p p e a r e d 5 t h er d n ar e p l i c a t i o nm o s t l yt o o kp l a c ei nt h eg r a n u l a rc o m p o n e n ta n dn u c l e o l a r a s s o c i a t e dc h r o m a t i no f t h eb o r d e rr e g i o no f n u c l e o l i i nt h el a t e g 1p h a s e ，r d n ar e p l i c a t i o n b e g a n sp h a s ew a st h ec h i e fs t a g ei nr e p l i c a t i o n ，a n dt h er e p l i c a t i o no fr d n ac h a n g e d m o r e a c t i v e t h e ni ng 2p h a s e ，t h er d n a r e p l i c a t i o nd i dn o ts t o pa to n c e ，a n dt h er d n ar e p l i c a t i o n l a s t e du n t i lg 2p h a s e k e yw o r d s ：a l l i u mc e p a ；n u c l e o h i s ；f c ；d f c ；r d n ar e p l i c a t i o n i l y 1 0 1 2 9 9 7 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 圣趁 日期： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 日 期：2 妇矗、l 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：继 日 期：护缶畔 电话： 邮编： 第一部分引言 核仁是真核细胞问期核中最显著的结构。在光镜下被染色的细胞、相差显微镜下的 活细胞或分离细胞的细胞核中都容易看到核仁，它们通常表现为一个或多个匀质的球形 小体。核仁的大小、形状和数目随生物的种类、细胞类型和细胞代谢状态而变化。在细 胞周期过程中，核仁是一个高度动态的结构，在有丝分裂期间表现出周期性的消失与重 建。 在真核生物中，核仁是细胞核内生产核糖体的机器【2 j 。自从上世纪四十年代一些细 胞学家证明在核仁中含有大量r n a 和蛋白质【3 ，有关核仁的相关研究就全面展开，五十 至六十年代逐渐阐明它的主要功能是合成r d n a 和装配核糖体1 5 j ，六十年代末m i l l e r 和 b e a t t y 对r r n a 基因转录的形态学观察是核仁功能研究的一个重要突破【6 “，之后的几十 年中关于核仁的超微结构和功能的研究取得了许多进展。核仁的功能己不仅局限于r r n a 的转录、r r n a 前体的剪切和加工、核糖体亚单位的装配，现在已经发现有许多其它功能， 包括一些小r n a s 的核菅酸修饰，在信号识别颗粒的生物合成中可能发挥的作用，与基 因沉默相关蛋白质的隔离和释放，细胞衰老以及细胞分裂等相关【8 】。2 0 0 2 年英国和丹麦 的两个实验室首次完成了h e l a 细胞核仁的蛋白质组学分析，在人细胞中确定了2 7 1 种 核仁蛋白与r r n a 合成、加工和装配有关 9 a o ，如今核仁的蛋白质组学已经成为研究热点 问题之一 1 l 】。 目前关于核仁的超微结构与相关功能的研究己进一步深入，但仍然有一些问题没有 能达成共识，如核仁的生物发生、核仁在有丝分裂过程中的集装和解集装、r d n a 在核仁 内的定位、r r n a 的转录位点和高效转录机制、小核仁r n a 与r r n a 的加工、核仁蛋白的 功能等 1 “。因此，核仁的结构和功能及各相关领域的很多问题仍然需要进一步探索并且 具有很高的研究价值。 一、核仁的超微结构 最初人们发现电子显微镜切片显示的核仁内部结构没有典型的统一模式。随着电予 显微镜分辨能力的发展，已经能够清楚的显示不同类型细胞中核仁的大小、数量，甚至 核仁超微结构的变化。真核细胞核仁内部超微结构都有以下几个部分【”j ： 1 、纤维中心( f i b r i l l a rc e n t e r ，f c ) 电子显微镜下可以看到核仁中存在一些电子密度低的区域，r e c h e r 等称这种区域为 纤维中心( f c ) 14 1 。f c 常呈圆形并且只占核仁体积的很小部分。f c 含有核糖体d n a ( r d n a ) ， r n a 聚合酶i 以及核仁组织者蛋白( n o r ) 等几种成分【1 “。由于n o r 和f c 都含有r n a 聚 合酶i 和u b f ，因而f c 被认为是n o r 在有丝分裂间期的对应物【1 6 1 。f c 中含有染色质成 分，r is u e n o 等根据f c 中染色质集缩程度和状态的不同将f c 分为两种：一种称为异质 性纤维中心( h e t e r o g e n e o u sc e n t e r s ) ，其中的染色质集缩成浓密状；另一种称为同质 性纤维中心( h o m o g e n e o u sf i b r i l l a rc e n t e r s ) ，其中的染色质呈弥散状m 】。 2 、致密纤维组分( d e n s ef i b r i l l a rc o m p o n e n t ，d f c ) 这部分是由直径4 - - l o n m 的纤维构成，通常看不到颗粒成分。由于含有高度密集的 r n p s ，其电子密度很高，在电镜下因其电子密度高染色深而容易被识别。d f c 呈环形或 半月形包围f c 。d f c 在核仁体积中所占比例在动物细胞和植物细胞之间差别很大。 3 、颗粒组分( g r a n u l a rc o m p o n e n t ，c c ) 颗粒组分是代谢活跃的细胞的核仁中的重要结构，由直径1 5 2 0 n m 的核糖核蛋白 ( r n p ) 颗粒组成，可被蛋白酶和r n a s e 消化，一般认为这些颗粒是正在加工、成熟的 核糖体亚单位前体颗粒。g c 通常分布在纤维中心外侧直至核仁的近边缘部位，间期核中 核仁的大小差异主要是由g c 数量的差异造成的。 4 、核仁液泡( n u c l e o l a rv a c u o l e ，n v ) 核仁液泡是指在核仁中一些大的腔隙，这些腔隙多少类似球体内含各种内容物的无 膜结构。核仁液泡内的成分类似核仁基质，其内部通常含有松散分布的核糖体前体颗粒 类似物和纤维成分1 1 ”。 5 、核仁相随染色质( n u c l e o l a ra s s o c i a t e dc h r o m a t i n ，n a c ) 有一些集缩染色质位于核仁周缘附近或进入到核仁的内部结构里，称这类染色质为 核仁相随染色质( n u c l e o l a ra s s o c i a t e dc h r o m a t i n ，n a c ) 。核仁相随染色质分为两种： 核仁周缘染色质( p e r i n u c l e 0 1 a rc h r o m a t i n ) 和核仁内染色质( p e n e t r a t i n g c h r o m a t i n ) 【b 。核仁相随染色质通过一种通道结构进入核仁，此通道称为核仁通道 ( n u c l e o l a rc h a n n e l ) 。 6 核仁基质( n u c l e o l a rm a t r i x ) 应用r n a s e 和d n a s e 处理核仁，在电镜下看到核仁的残余结构，即为核仁基质 ( n u c l e o l a rm a t r i x ) 或核仁骨架( n u c l e o l a rs k e l e t o n ) 。f c 、d f c 和g c 三种组分都湮 没在这种无定性的核仁基质中。 二、核仁组成区和核仁周期 h e i t z 1 8 1 通过总结核仁大小及数量的不同变化以及核仁在细胞有丝分裂中周期性出 现与消失的过程，得出结论：染色体上次级缢痕的数量和长度与核仁数量和大小直接相 关，并且提出染色体上的次级缢痕参与核仁的形成和功能的维持。1 9 3 4 年，m c c l i n t o c k ”9 】在观察玉米染色体元件结构时最早提出核仁组织体或元素( n u c l e o l a ro r g a n i z i n g b o d yo re l e m e n t ) 的概念，现在已经发展成为核仁组织区( n u c l e o l a ro r g a n i z i n g r e g i o n ，n o r ) 。 核仁组成区不仅是r d n a 的携带者，而且参与核仁的形成，在核仁重建过程中起关 键作用。核仁组成区是含有一串联重复r d n a 簇的染色体区段。具有核仁组成区的染色 体称为核仁染色体。核仁组成区一般定位在核仁染色体的次级缢痕部位。这种具有核仁 组成区的染色体的数目依不同物种而异。人单倍体基因组有2 0 0 个r d n a 拷贝，成簇分 布在1 3 、1 4 、1 5 、2 1 、2 2 这5 条不同的染色体上。多种实验研究证实核仁组成区含有 r d n a ，即r r n a 基因( 1 8 sr r n a 、2 8 sr r n a 、5 8 sr r n a 的基因) 。r i t o s s a 和s p i e g e i m a n 【2 0 1 用果蝇作材料，发现n o r 数量的变化与核糖体基因数量的变化直接相关。b i r n s t ie l 和c h i p c h a s e 【2 1 】饲养无n o r 的非洲爪蟾突变体，证明这种爪蟾突变体由于不能合成 r r n a ，也就不能合成核糖体。 核仁是一种高度动态的结构，在细胞周期中出现一系列结构与功能的周期性的变 化，称为核仁周期( n u c l e o l a rc y c l e ) 。当细胞进入有丝分裂时，核仁首先变形变小， 然后随着染色质凝集，核仁的颗粒组分和纤维组分渐渐消失在周围的核质中。当核膜破 裂进入中期，核仁的n o r 被收缩回到相应的n o r 染色体而导致核仁消失，核仁中所有的 r n a 合成停止，致使在中期和后期细胞中没有核仁；在有丝分裂末期，随着染色体的去 凝集，核仁的n o r 也开始解凝集，r r n a 合成重新开始，进而重建核仁。 关于核仁在有丝分裂末期的重新形成，r o b e r tl o c h s 2 2 1 等提出一个前核仁体模型： 在有丝分裂末期，随着染色体的去凝集，核仁的n o r 也开始解凝集，重新合成r r n a 。此 时在染色体的表面出现某些核仁蛋白，如c 2 3 蛋白和纤丝蛋白，并形成前核仁体 ( p r e n u c l e o l a rb o d i e s ，p n b s ) 。这些微小的前核仁体逐渐长大，并融合成极小的核仁 重新出现在染色体的n o r 区附近，最后进一步合并成核仁。 在细胞周期中核仁周期性变化的分子过程还不十分清楚，但近几年来的研究表明， 核仁的动态变化是r d n a 转录和细胞周期依赖性的【i 】。现已发现一些因子对核仁周期具有 调控作用：d f c 在核仁中的定位与整合，关键依赖于j 下在转录的r r n a 基因的活性”j ； r n a 聚合酶i 的活性是细胞周期中核仁重建的一个关键事件 2 4 j ：m 期促进因子能使核仁 蛋白磷酸化，可能对有丝分裂过程中核仁的解体及染色质的凝集具有重要作用；g 2 期合 成的r r n a 分子在分裂中期聚集在染色体的n o r 部位，并随后加入新组建的核仁中，成 为核仁重建的必要条件l 2 3 。 三、核仁中r d n a 的分布定位 对于r d n a 在核仁内的定位研究有很多方法，包括b r d u 引入法、细胞化学d n a 特异 染色方法，d n a 抗体免疫标记技术，分子原位杂交技术等。关于核仁内r d n a 分布定位的 实验在不同的材料中用不同的方法取得的实验结果差异很大，主要有这样几种观点： 1 r d n a 存在于整个核仁中。m a r t i n 【2 5 和p u v i o n 2 q 的实验结果表明在f c 、d f c 、甚 至g c 中都有r d n a 的分布。 2 r d n a 存在于f c 中。t h i r y 在e h r l i c h 肿瘤细胞中先后用两种不同的方法证明r d n a 分布于f c 中，在d f c 中则完全没有r d n a 的分布 2 7 ，28 1 。j o r d a n 对低等植物水绵和海藻 细胞作连续切片结合d n a 荧光染色证实r d n a 存在于f c 中【2 明。m o t t e 在高等植物玉米和 拟南芥细胞中用r d n a 探针作原位杂交，证实r d n a 只分布于f c 中p o 。s c h e e r 在蝗虫卵 母细胞核中用细胞免疫化学和原位杂交技术证明r d n a 位于f c 中1 3 “。 3 r d n a 存在于d f c 中。w a c h t l e r 用不同方法在人精母细胞和人淋巴细胞中证实r d n a 分布于d f c 中( 3 2 ，3 3 。d e r e z i n i 采用锇一胺d n a 特异染色方法确定人淋巴细胞除了在f c 中含有r d n a 外，在d f c 中也存在r d n a 成分【3 ”。h o z a k 等以h e l a 细胞为材料得出结果 显示r d n a 分布于d f c 中u “。 4 r d n a 主要存在于f c 和d f c 交界处。r a s k a 认为r d n a 位于d f c 和d f c f c 交界 处f 3 6 1 ，p l o t o n 认为r d n a 位于f c 和f c d f c 交界处【3 7 】，t e s t i l i a n o 3 8 ，3 9 1 和d e r e z i n i 删 的研究结果表明r d n a 主要存在于f c 和d f c 交界处。 四、核仁中r d n a 的复制 核仁不仅是r r n a 基因表达和把表达产物组装成核糖体前体的场所，也是r r n a 基因 ( r d n a ) 本身自我复制之地。许多学者都对r d n a 的复制位置和复制发生的时期做了大 量的研究，但得到的结果却有很大的差异，有的甚至得出相反的结论，至今仍然存在很 多争议。 1 r d n a 的复制位置 关于在核仁什么部位进行r d n a 的复制已经有三十多年的历史，许多作者曾经应用 电镜放射自显影技术进行过观察和探讨【4 ”，但结果是分歧的，具体发生部位到目前为止 还没有统一的意见。归纳为主要这样两种观点：一种观点认为r d n a 的复制位置主要在 核仁f c 和d f c 区域；另一种观点认为r d n a 的复制位置主要在核仁边缘颗粒区及与核仁 相随染色质相连接的部位。 r d n a 的复制位置主要在f c 和d f c 区域： g o e s s e n s 用3 h 一胸腺嘧啶脱氧核苷( 3 h t d r ) 标记e h r l i s h 肿瘤细胞1 6 5 小时或2 4 小时，曾看到在核仁f c 和核仁伴随染色质部位有银颗粒出现【4 2 】。r e c h e r 等在人的c m p 细胞核仁中只在d f c 部位看到少量银颗粒 4 3 】。在植物方面，r y s e r 等在多头绒泡菌 ( p h y s a r u m p o t y c e p h a j u m ) 的核仁中看到，用3 h - t d r 标记1 0 5 分钟时银颗粒出现在d f c 部1 立【矧。l a f o n t a i n e 和l o r d 用3 h - t d r 标记韭葱( a l l i u mg o r u s ) 幼根1 0 3 0 分钟， 看到银颗粒主要出现在核仁液泡( n u c e o l a rv a c u o l e ) 和其周围的纤维部分，即出现 在f c 和d f c 部位，同时他们还观察到核仁周边的颗粒区和核仁相随染色质处也有银颗 粒分布4 6 1 。r i s u e n o 等用3 ht d r 标记洋葱根端分生组织1 8 小时，看到核仁的f c 和 d f c 部位有明显的银颗粒出现，但在颗粒区无明显标记【4 ”。p 1 i s s 等人用d n a 抗体免疫 标记的方法来标记h e l a 细胞核仁中新复制合成的r d n a ，并在电子显微镜下观察，所得 结果是r d n a 复制主要集中分布在d f c 区域，同时还观察到在核仁边缘区域和核仁相随染 色质相连接的部位也有少量r d n a 复制发生 4 s 。 q r d n a 的复制位置主要在核仁边缘颗粒区及与核仁相随染色质相连接的部位： f a k a n 和h a n c o c k 用3 l i - t d r 对小鼠培养细胞p 8 1 5 进行2 0 或3 0 秒极短时间脉冲标 记，看到核仁中出现的银颗粒主要分布在核仁边缘与核仁相随染色质相连接的部位，有 时在f c 和d f c 区域也看到有银颗粒 4 9 1 。郝水等人以洋葱为实验材料，采用较短时间标 记的方法展开研究，洋葱幼根经5 分钟3 h t d r 脉冲标畦后立即固定并制备分析样品， 银颗粒出现的位置主要分布在核仁边缘及核仁相随染色质相连的部位，同时在f c 和d f c 处也有少量银颗粒出现。由此认为r d n a 的复制部位主要在核仁边缘区域而在纤维中 心也可能有一些r d n a 区段开始复制，然后向核仁周边区转移【5 0 。尹江梅和张飞雄取小 麦根端分生组织为实验材料，短时3 h t d r 脉冲标记5 分钟后不经过培养立即固定材料， 观察到银颗粒大部分出现在核仁周边的颗粒区，并且银颗粒范围较大，少部分出现在d f c 中，而f c 与d f c 交界区看到的银颗粒很少，且银颗粒范围一般较小，说明复制主要发 生在核仁周边的颗粒区，同时在f c 与d f c 交界区也有少量r d n a 复制【5 ”。 2 r d n a 的复制时期 关于r d n a 的复制时期也有很大的争论。研究者们争论的焦点集中于复制发生在s 期的哪个阶段，即早s 期、中s 期和晚s 期。因为不同的研究者所研究的角度不同，分 别建立了不同的模型，由此便产生了很大的分歧。主要有以下几种观点： r d n a 复制发生在早s 期： s t a m b r o o k 以中国仓鼠细胞为实验材料，采用d n a 抗体免疫标记的方法，证实r d n a 的复制在早s 期5 2 l 。a m a l d ie 5 3 埽口d a n d r e a t 5 4 1 分别选用中国仓鼠细胞和哺乳动物细胞为 实验材料，研究结果都认为r d n a 的复制是发生在早s 期。 r d n a 复制发生在中s 期至晚s 期： j u n e r a 等人用p t k i 细胞为材料，根据p c n a 抗体结合的d n a 多聚酶6 在s 期的特 殊分布，能够将s 期化分出早s 期、中s 期和晚s 期，同时用r i ) n a 探针标记的方法并 在荧光显微镜下观察，证明r d n a 的复制是发生在中至晚s 期【55 1 。p l i s s 等人先用细胞 同步化的方法将h e l a 细胞同步化到g l s 期，并且用d u t p 免疫标记和荧光显微镜相结 合的方法，观察到在早s 期没有r d n a 复制信号，直到中s 期复制信号才出现，说明r d n a 的复制是在中s 期至晚s 期【4 8 】。g i a c o m o n ia n df i n k e 的实验结果同样说明r d n a 复制 发生在中至晚s 期1 5 6 1 。 r d n a 复制发生在早s 期、中s 期和晚s 期( 即整个s 期) ： b a l a z sa n ds c h i i d k r a u t 用h e l a 细胞和s v 3 t 3 细胞为材料，b r d u 标记从同细胞系 分离出的新合成的d n a ，研究结果证明r d n a 的复制发生在整个s 期【5 7 。e p n e r 等以鼠红 白血病细胞( m e l c ) 为实验材料，用细胞同步化的方法筛选出同步化到s 期的细胞，同时 用b r d u 探针标记细胞r d n a ，分析数据后得出，在早s 期、中s 期和晚s 期r d n a 进行同 等程度的复制。b e r g e r 的实验结果也认为r d n a 复制发生在整个s 期。 综上所述，核仁中r d n a 的复制是一个矢量过程，其中r d n a 的复制部位与时期一直 是许多研究者争论的问题，虽然研究的时间较长但始终没有得出统一的结论，而且所用 的实验材料以动物细胞较多，对植物细胞研究的较少，其实验结果具有片面性，不能够 完全代表植物细胞的性质。许多研究者的研究手段主要是先对体外培养的细胞进行同步 化，再对同步化的细胞免疫标记，最后以荧光显微镜和共聚焦显微镜并附带以电子显微 镜来观察研究，实验方法比较单一。关于从亚显微水平上对核仁结构在分别处于g l 期、 s 期和g 2 期的动态变化还很少有系统性的报道。本研究是以洋葱根尖细胞为实验材料， 首先用常规超薄切片电镜观察来研究细胞核仁结构在细胞周期中的动态变化规律，再用 3 h 一胸腺嘧啶脱氧核苷( 3 卜t d r ) 放射自显影的方法标记r d n a ，在亚显微水平对r d n a 复 制问题进行研究，并且从细胞周期的角度，探讨核仁的结构与r d n a 复制的关系和变化 规律，本研究可以为进一步阐明核仁功能与其结构的动态变化的关系提供依据。 第二部分实验材料与方法 一、实验材料 高等植物洋葱( g l l y u mc e p a ) 鳞茎，在室温条件下发根，待其根尖长至约l 2 厘 米时，切取根端分生组织细胞作为实验材料。 二、实验方法 ( 一) 常规电子显微镜样品的制备 l 、取材：切取生长旺盛的洋葱根尖，包括根冠部分约l 2 毫米。 2 、固定：根尖固定于2 5 戊二醛( 0 1 m p b s 缓冲液配制，p h = 7 2 ) 中3 4 小时，0 1 m p b s 缓冲液沈三次共1 小时；1 锇酸( o 1 m p b s 缓冲液配制) 后固定2 小时，双蒸 水充分洗涤。 3 、脱水：乙醇一丙酮系列脱水。 4 、包埋：e p o n 8 1 2 包埋剂，渗透、包埋，3 5 。c 、4 5 c 、6 0 高温聚合各一天。 5 、切片：l k b 一5 型超薄切片机切片，切片厚度为6 0 8 0 n m ，用1 0 0 目铜网选取银白至 亮黄色切片捞片。 6 、染色：醋酸铀一柠檬酸铅常规染色。 7 、观察：h i t a c h t i 一6 0 0 型透射电子显微镜，加速电压7 5 k v 条件下观察并照相。 ( 二) 电子显微镜放射自显影样品的制备 制备电子显微镜放射自显影样品用到的主要实验药品： 3 h 一胸腺嘧啶脱氧核苷( 3 h t d r ) 和核4 型原子乳胶购于中国原子能科学研究院。 l 、3 h - t d r 标记根尖细胞：选取1 2 厘米洋葱根尖，将根尖全部浸入到装有3 h - t d r ( 浓 度为2 0 i m 1 ) 溶液的小瓶内处理5 分钟。 2 、取材：将3 h - t d r 处理过的根尖水洗1 0 分钟，立即切取根尖( 包括根冠部分约1 2 毫米) 。 3 、固定：2 5 戊二醛中3 4 小时，1 锇酸后固定2 小时。 4 、脱水：乙醇一丙酮系列脱水。 5 、包埋：e p o n 8 1 2 包埋。 6 、切片：l k b 一5 型超薄切片机切片，7 0 或1 0 0 目铜网，切片厚度比常规样品略厚，约 8 0 1 0 0 n m 。 7 、染色：醋酸铀一柠檬酸铅常规染色。并将染色后的铜网固定于小玻璃块上。 8 、制备乳胶膜：在暗室安全红灯及室温2 0 。c 条件下，4 0 水浴加热使乳胶融化，加入 7 蒸馏水将乳胶稀释4 倍。稀释后的乳胶于4 0 。c 水浴中保温1 5 分钟，后立即置 于冰上冷却3 分钟，再在室温下静置15 2 0 分钟，使乳胶达到半凝胶状态。 取玻璃套环浸入乳胶中，待套环中乳胶膜较快达到稳定态时，将乳胶膜平稳 地套在铜网上。 9 、曝光：乳胶完全干燥后，将玻璃块固定于暗盒中，并在暗盒内加入硅胶干燥剂，暗 盒置于4 冰箱内，曝光6 0 至8 0 天。 1 0 、显影：将粘有铜网的玻璃块全部浸入到约1 9 的显影液中，显影5 8 分钟，其间 搅动显影液数次。取出后立即放入停影液中漂洗3 0 秒钟。 1 l 、定影：玻璃块转移到定影液中，定影8 1 0 分钟，其间搅动定影液数次。后转入自 来水中浸泡或细水流冲洗2 0 分钟。 1 2 、脱水：将铜网从玻璃块上取下放于滤纸上，并置于灯下烤干1 2 天，使其完全于 燥。 1 3 、观察：h i t a c h t i 一6 0 0 型透射电子显微镜，加速电压7 5 k v 条件下观察并照相。 第三部分实验结果与分析 一、洋葱细胞核仁结构在细胞周期中动态变化规律的研究 应用常规电镜制片技术，在电镜下可以清楚地识别洋葱间期细胞核仁的三个基本结 构区域：即纤维中心( f c ) 、致密纤维组分( d f c ) 和颗粒组分( g c ) ( 图1 ) 。f c 是电子 密度较低的圆球形结构小岛，在电镜下染色较浅，其中有凝集的块状或松散的纤维状的 染色质结构，根据染色质集缩程度的不同，分为异质性f c 和同质性f c ，前者的电子密 度明显高于后者。d f c 呈半月形或环形包围于f c 周围，由于其电子密度高，染色较深。 g c 分布在各纤维部分的周围和核仁的周边区域。但是这些结构是随着细胞周期进程发生 着高度的变化。 1 、g 1 期细胞核仁结构 细胞有丝分裂末期，核仁组织者开始组织核仁的重建。在末期后g l 期刚开始不久， 图2 一a 中核仁已经出现，处于正在解集缩的染色体中间，核仁数量较多，体积较小，只 有个别核仁出现少数f c 和d f c 结构，f c 中有较大的染色质块，d f c 结构不明显。图2 一b 中相邻的核仁逐渐融合，核仁数目减少，有的核仁隐约有f c 和d f c 结构出现。随后核 仁体积变大，数目减少，f c 和d f c 结构相对增多( 图2 一c ) 。图2 - d 为g l 期的较晚时段， f c 中有较大的染色质块，染色质集缩程度高，染色较深，d f c 区域逐渐变清晰，但电子 密度不高。从g 1 期图中看到，f c 数量少，d f c 区域范围不大，电子密度不高。g 1 期细 胞核仁边缘都比较整齐，极少有与核仁周边染色质的联系。图2 一d 中看到较小的核仁液 泡。 2 、s 期细胞核仁结构 进入s 期，细胞核仁数量减少，体积增大。图3 - a 细胞核仁的边缘有毛边现象，与 核仁周边的染色质联系紧密，f c 较少，为同质性，i ) f c 开始交厚。图3 一b 中d f c 区域增 大，并且呈区域性分布，少数d f c 区域中有f c 分布，且f c 较大，同时有很小的f c 出 现，大范围的d f c 区域中没有f c 分布。图3 - c 中d f c 区域继续增大，有f c 分布的d f c 区域变多，且同时存在大小两种f c ，看到了核仁通道。图3 - d 核仁中d f c 区域内分布的 f c 数量增多。 s 期细胞核仁f c 数量比g 1 期有所增多，f c 多为同质性( 图3 一a 、3 一b ) ，图3 一b 、3 - c 、 3 一d 中有少数异质性f c ，f c 中染色质块较小，染色较浅，染色质集缩程度没有g 1 期高， 相对松散。核仁中d f c 结构分布呈区域性。d f c 区域的范围逐渐变大，并且d f c 电子密 度相对变高，染色较深。 3 、g 2 期细胞核仁结构 g 2 期细胞中核仁的大小和数目与s 期无明显差异。g 2 期细胞核仁中f c 数量逐渐 增多，并且有较多小f c 出现，d f c 区域的范围进一步增大，并且电子密度高，f c 和d f c 结构呈区域性集中分布，并且分区明显，在每个d f c 区域范围内都有f c 分布。 图4 - a 中d f c 变厚，f c 数量比s 期增多，在每个d f c 区域内都有f c 结构。图4 一b 中d f c 区域较大且均匀分布在核仁周边，出现多个小f c 。从图4 一c 、4 一d 看，f c 和d f c 呈区域性分布明显，区域间界线清晰，各d f c 区域内都有数量较多的f c 均匀分布，并 且有很小f c 。g 2 期核仁中同质性f c 较多，异质性f c 中染色质块较小，染色浅，呈半 集缩状态。在图4 - c 、4 - d 中看到较小的核仁液泡。图4 一d 出现核仁通道，并有核仁相 随染色质进入到核仁内部。 4 、前期细胞核仁结构 g 2 期过后即进入到有丝分裂前期，此时核仁开始逐渐消失。从图5 一a 看到细胞核 中染色质正在集缩，核仁变小且形状极不规则，在核仁内f c 仍然清晰，但数量比g 2 期明显减少，d f c 区域变小、变浅。在图5 一b 中只有少数很小的f c 结构，d f c 区域电子 密度降低。图5 一c 核仁中d f c 区域进一步变小，f c 结构减少并且模糊不清。随着染色质 集缩程度的加深，图5 一d 中核仁已经解体为多个小核仁，被分离并包埋于集缩的染色质 中，小核仁中仅剩个别f c 结构，d f c 区域电子密度很低，甚至观察不到。前期核仁中多 为同质性f c ，异质性f c 少，且f c 中染色质块很小，染色很浅，染色质呈解集缩状态( 图 5 一b 、5 一d ) 。随着前期的深入，小核仁数量增多，最后解体。 二、洋葱细胞核仁r d n a 复制的动态研究 本研究采用3 h 一胸腺嘧啶脱氧核苷( 3 h t d r ) 短时脉冲标记洋葱根尖细胞的电子显 微镜放射自显影的方法，是研究d n a 复制的传统方法。3 h 一般标记在嘧啶环的第5 位上， 胸腺嘧啶脱氧核苷作为d n a 合成的唯一特异的前体，专一的掺入d n a ，因此3 h t 掺入的 部位与数量直接反映出d n a 复制的部位与速率。 我们首先用3 h t d r 短时脉冲标记洋葱根尖细胞5 分钟，水洗后立即取材固定，再 涂乳胶膜并曝光6 0 天，最后在电子显微镜下观察，经3 h t d r 脉冲标记的样品出现明显 的线团状结构，该线团状结构即是3 h 对溴化银( 或氯化银) 颗粒产生电离作用后形成 的潜影在显影剂和定影剂的作用下，得到的被还原的黑色的金属银颗粒。 1 、r d n a 的复制位置 从银颗粒在核仁中出现的位置来看，有的分布在核仁边缘的颗粒区，有的分布在核 仁相随染色质部位，有的分布在核仁的d f c 区与核仁边缘颗粒区相连接的部位( 图6 ) ， 还有的分布在核仁内部的颗粒区( 图7 一c ) ，但是在核仁的f c 部位却没有发现银颗粒。 其中银颗粒分布在核仁边缘颗粒区的居多