（遗传学专业论文）萝鞭木mct、hds、sgd基因的克隆与遗传转化体系的建立.pdf

i 独创性声明 1 i l l i l l l l m l l ) p i i111i l uii i iiil 4y 18 814 8 6 ” 学位论文题目：蔓苤盎巡! ! 塑旦美! 妥塑叁囤鲍壶隆鱼童堡挂垡 体系的建立 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：柳r 签字日期： b 1 1 年6 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者张狲同导师鲐谚听 签字日期：劲1 1 年1 月日签字日期：矿t 年多月2 - 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址：邮编： 1 3 1 器官发生途径。：3 1 3 2 体细胞胚发生途径3 1 3 3 农杆菌介导的遗传转化途径3 1 4 萝芙木t i a s 合成途径4 1 5 萝芙木t i a s 合成途径中的关键酶基因5 1 5 1 l - 脱氧d 木酮糖5 磷酸合成酶( d x s ) 5 1 5 21 脱氧一d 木酮糖5 磷酸还原异构酶( d x r ) 6 1 5 32 - c 甲基d 赤藓醇4 - 磷酸胱氨酰转移酶( m c t ) 6 1 5 42 - c 甲基赤藓醇- 2 ，4 司：焦磷酸合成酶( m e c s ) 6 1 5 5 羟甲基丁烯基4 磷酸合成酶( h d s ) 7 1 5 6 羟甲基丁烯基_ 4 磷酸还原酶( h d r ) 7 1 5 。7 色氨酸脱羧酶( t d c ) 7 1 5 8 香叶醇1 0 脱氢酶( g 1 0 h ) 8 1 5 9 次番木鳖苷合成酶( s l s ) 8 1 5 1 0 异胡豆苷合成酶( s t r ) 。9 1 5 1 l 异胡豆苷p 。葡萄糖苷酶( s g d ) 9 1 6 萜类吲哚生物碱的代谢工程9 第二章绪论1 1 2 1 研究目的和意义。1 1 2 2 研究范围和内容l l 2 - 3 技术路线1 2 第三章材料与方法1 3 3 1 植物材料1 3 3 2 菌株和质粒1 3 3 3 仪器和设备1 3 3 4 试剂盒及试剂1 3 3 5 自配试剂1 3 3 6 常规方法介绍1 4 、 3 6 1r n a 的提取1 4 3 6 2d n a 产物的琼脂糖凝胶电泳15 3 6 3 目的条带的回收1 5 3 6 4 目的片段与克隆载体t 连接1 5 3 6 5 大肠杆菌d h 5 ( x 感受态细胞的制备( c a c l 2 法) 1 6 3 6 6 连接反应物转化大肠杆菌感受态细胞1 6 3 7r v m c t , r v h d s 和r v s g d 基因的克隆与分析1 6 3 7 1 从萝芙木总r n a 合成第一链c d n a 1 7 3 7 2r v m c t , r v h d s 和r v s g d 基因的克隆1 7 3 7 3r v m c t , r v h d s 和r v s g d 基因的生物信息学分析2 2 3 7 4r v m c t , r v h d s 和r v s g d 基因的组织表达谱分析2 2 3 8 萝芙木高效再生体系的建立2 4 3 8 1 萝芙木无菌苗快繁体系的建立。2 4 3 8 2 萝芙木愈伤组织的诱导2 4 3 8 3 萝芙木悬浮细胞体系的建立2 4 3 8 4 萝芙木愈伤组织的再生2 4 3 9 萝芙木发根遗传体系的建立：2 5 3 9 1 发根农杆菌c 5 8 c 1 的活化2 5 3 9 2 发根农杆菌c 5 8 c1 转化萝芙木外植体2 5 3 9 3 萝芙木发根的p c r 鉴定2 5 3 9 4 萝芙木发根中阿玛碱含量的检测2 6 第四章结果与分析2 9 4 1r v m c t 基因的获得和分析2 9 4 1 1r v m c t 基因的获得。2 9 4 1 2r v m c t 基因的生物信息学分析3 0 4 1 3r v m c t 基因的组织表达谱分析3 4 4 2r v h d s 基因的获得和分析3 4 4 2 1r v h d s 基因的获得3 4 4 2 2r v h d s 基因的生物信息学分析3 5 4 2 3m 彻s 基因的组织表达谱分析4 0 4 3r 彻基因的获得和分析4 0 4 3 1r v s g d 基因的获得4 0 4 3 2r v s g d 基因的生物信息学分析4 l 4 3 3r v s g d 基因的组织表达谱分析4 4 4 4 萝芙木高效再生体系的建立4 4 4 4 1 萝芙木无菌苗体系的建立。4 4 4 4 2 萝芙木愈伤组织的诱导。4 4 4 4 3 萝芙木愈伤组织的植株再生4 5 4 5 萝芙木发根遗传体系的建立4 6 4 5 1 萝芙木发根的诱导。：4 6 4 5 2 萝芙木发根中阿玛碱含量的检测4 8 4 6 结论与展望4 9 参考文献5l 附录5 7 缩略词表5 7 攻读硕士学位期间发表的论文5 9 1 改谢6 1 一 摘要 萝芙木m c t 、h d s 、s g d 基因的克隆与遗传 转化体系的建立 遗传学专业硕士研究生郑月 指导教师廖志华陈敏教授 ( 摘要) 萝芙木( r a u v o l f i av e r t i c i l l a t al ) 是一类重要的生产萜类吲哚生物碱( t e r p e n o i di n d o l e a l k o l i d s ，t 认s ) 的夹竹桃科木本植物，如今已经从其中分离到了超过9 0 种生物碱，包括治疗 高血压的阿玛碱、利血平，以及治疗男性不育和动脉硬化的育亨宾等。但天然药源萝芙木中 生物碱的含量很低，目前萝芙木的生产远远不能满足国际市场的需求。化学合成阿玛碱、利 血平等生物碱成本高、毒性大，所以不能应用于生产。近年来，随着萜类吲哚生物碱生物合 成途径相关酶基因的克隆，基因工程成为提高阿玛碱含量的有效途径之一为了研究阿玛碱 生物合成的分子机理和为萜类吲哚生物碱代谢工程提供新的靶点，本研究采用r a c e 技术从 萝芙木中首次克隆获得了阿玛碱合成途径中的三个关键酶基因：2 4 2 甲基- d 赤藓醇一4 磷酸胱 氨酰转移酶( 2 - c - m e t h y l d - e r y t h r i t o l4 - p h o s p h a t ec y t i d y l t r a n s f e r a s e ，m c t ：e c ：2 7 7 6 0 ) 基因、 羟甲基丁烯基- 4 - 磷酸合成酶( 1 - h y d r o x y - 2 - m e t h y l - 2 ( e ) - b u t e n y l - 4 - d i p h o s p h a t es y n t h a s e ，h d s ； e c ：1 1 7 4 3 ) 基因和异胡豆苷p d 糖苷酶( s c r i c t o s i d i n e i - g l u c o s i d a s e ，s g d ：e c ：3 2 1 1 0 5 ) 基因，并进行了相应的生物信息学分析。此外，本研究还建立了萝芙木的高效再生体系和发 根遗传转化体系，从而为在萝芙木中开展代谢工程研究奠定了基础。 m c t 是甲基d 赤藓醇4 磷酸( m e p ) 途径途径上的第三个酶，催化2 - c 甲基d 赤藓醇 _ 4 磷酸和c d p 缩合成4 - ( 5 焦磷酸胞苷心c 甲基- d 赤藓醇( 4 - ( c y t i d i n e 5 - d i p h o s p h o ) - 2 - c - m e t h y l e r y t h r i t o l ，c d p - m e ) 。本研究采用r a c e 技术，从萝芙木中克隆了m c t 基因的全长e d n a ，命名为r v m c t ( g e n b a n k 登录号为：j f 9 6 6 7 3 2 ) 。生物信息学分析表明， 该基因e d n a 全长1 5 2 4b p ，包含9 4 5b p 的开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) ，编码3 1 4 个氨基酸残基蛋白质，其理论分子量为3 4 4 5k d a ，等电点为7 3 4 ，t a r g e t p 软件预测其n 端 存在质体转运肽。蛋白质序列比对分析显示，r v m c t 蛋白与其它物种的m c t 蛋白具有同源 性，尤其与植物来源的m c t 具有高度同源性，与长春花( c a t h a r a n t h u sr o s e u s ) m c t 相似性 达到了8 4 1 。生物信息学分析预测r v m c t 蛋白质二级结构由5 2 8 7 的随意卷曲、1 5 6 1 的片层和3 1 5 3 的a 螺旋组成。将r v m c t 与来源于植物、细菌的m c t s 构建分子进化树， 西南大学硕士学位论文 结果表明m c t s 在进化树上按照各自所属类群分为3 大枝：细菌、裸子植物和被子植物，r v m c t 聚到被子植物的一枝，且与长春花m c t 亲缘关系最接近。利用荧光定量p c r 对r v m c t 进行 组织表达谱分析结果表明r v m c t 在嫩叶中的表达量最高，其次是老叶、树皮、根和茎。 h d s 催化2 - c 甲基赤藓醇2 , 4 环焦磷酸( m e - c p p ) 转化生成羟甲基丁烯基4 磷酸 ( h m b p p ) ，是m e p 途径中的倒数第二个酶。本研究采用r a c e 技术，从萝芙木中克隆获 得了h d s 基因的全长e d n a ，并命名为r v h d s ( g e n b a n k 登录号为：h q 6 5 9 7 5 9 ) 。该基因 e d n a 全长2 6 4 5b p ，包含2 2 2 3b p 的开放式阅读框，编码7 4 0 个氨基酸残基的蛋白，其电子 预测分子量为8 2k d a ，等电点预测为6 2 8 。生物信息学分析显示，r v h d s 与来源于其他物种 的h d s 蛋白序列同源，尤其是与植物来源的h d s 高度同源，在n 端有质体转运肽。r v i - i d s 序列包含h d s 蛋白典型的c y s 2 7 0 、c y s - 2 7 3 、c y s 3 0 5 氨酸残基活性位点，这三个氨基酸残 基被认为是h d s 蛋白催化区域中最保守的三个位点。对来源于不同物种中的h d s s 构建进化 树表明，h d s s 在进化树上聚为3 枝，r v h d s 聚到植物的一枝且与长春花h d s 的亲缘关系最 近。荧光定量p c r 结果表明r v h d s 在老叶中表达量最高，其次是树皮、嫩叶、根和茎。 s g d 催化t i a s 合成途径中的通用前体异胡豆苷进行去糖基化反应，此步反应促使了t i a s 在不同物种中的多样性。本研究采用r a c e 技术，从萝芙木中克隆获得了s g d 的全长e d n a ， 并命名为r v s g d ( g e n b a n k 登录号为：j f 9 6 6 7 3 3 ) 。该基因e d n a 全长1 8 5 9b p ，包含1 6 0 8 b p 的开放阅读框，编码5 3 6 个氨基酸，其电子预测分子量为6 1k d a ，等电点p i 为6 1 6 。生物信 息学分析显示，r v s g d 与蛇根木s g d 及长春花s g d 的序列相似性分别高达9 0 1 和7 0 9 ， r v s g d 也具有s g d 蛋白的三个保守的氨基酸催化位点h i s 1 6 1 ，g l u - 2 0 7 和g l u - 4 1 9 。荧光定 量p c r 表明r v s g d 在树皮中表达量最高，其次是老叶、根、嫩叶和茎。对r v m c t , r v h d s 和r v s g d 基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解这三个基因在t i a s 的生物 合成中的作用，并为今后调控t i a s 的生物合成提供了新的靶点。 随着基因克隆及生物合成途径的阐明，代谢工程被认为是提高萜类吲哚生物碱含量的有 效途径。通过遗传转化获得高产t i a s 的转基因植株或发根从而解决t i a s 原料短缺是一种可 行的方法。然而转基因工作的进行必须依赖于植物高效再生体系的建立或毛状根遗传体系的 建立，萝芙木是一种木本植物，再生和遗传转化相对困难。为了给后续开展萝芙木转基因研 究奠定基础，本文对萝芙木植株再生体系和发根转化体系分别进行了研究。研究结果表明， 以萝芙木茎段作为外植体，先在添加了0 8i i 虮i b a 的1 2 m s 培养基上培养，后转至添加2 0 m g l6 - b a 和0 0 5m g ln a a 培养基上可以高效再生出萝芙木植株。通过农杆菌c 5 8 c1 的侵 染建立了萝芙木发根转化体系，并用h p l c 方法检测了发根中阿玛碱的含量为1 7 0 9 9r t e g g 。 本文的研究对今后在萝芙木中开展t i a s 的代谢工程研究奠定了基础和提供了参考。 关键词：萝芙木：萜类吲哚生物碱；2 c 甲基一d 赤藓醇- 4 磷酸胱氨酰转移 酶；羟甲基丁烯基_ 4 一磷酸合成酶；异胡豆苷一d d 一糖苷酶；遗传转化；阿玛碱 c l o n i n go tm c t 、h d sa n ds g dg e n e sf r o m r a u v o f f q a v e r t 记i l l a t aa n de s t a b l 遗h m e n to f g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m m a s t e rc a n d i d a t em a j o r i n gg e n e t i c s ：y u ez h e n g s u p e r v i s o r s ：p r o f z h i h u al i a o & p r o f m i nc h e n ( a b s t r a c t ) r a u v o l f i av e r t i c i l l a t ai sam e d i c i n a ls h r u bb e l o n g i n gt ot h ef a m i l ya p o c y n a e e a e ，f r o mw h i c h m o l et h a n9 0k i n d so ft e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d sf r t a s ) h a v eb e e ne x t r a c t e di n c l u d i n ga j m a l i c i n e ， r e s e r p i n ea n dy o h i m b i ne t e t h el o wc o n t e n to ft i a si nn a t u r a lp l a n t sh a sg r e a t l yh a n d i c a p p e di t s c o m m e r c i a lp r o d u c t i o n , t h u st h ed e m a n do ft i a si ni n t e r n a t i o n a lm a r k e tc a n n o tb em e t e v e n t h o u g ht h ec h e m i c a ls y n t h e s i so fr e s e r p i n ei sp o s s i b l e ，i ti sn o tf e a s i b l eb e c a u s eo ft h eh i g hc o s t s w i t ht h ep r o g r e s si nc l o n i n gg e n e si n v o l v e di nb i o s y n t h e t i cp a t h w a y , m e t a b o l i ce n g i n e e r i n gi s d e e m e da sap r o m i s i n gs t r a t e g yt oe n h a n c et h ep r o d u c t i o no fa j m a l i c i n e t ou n v e i lt h eb i o s y n t h e t i c p a t h w a yo ft i a sa sw e l la st op r o v i d en e wt a r g e tg e n e s ，m c t , h d sa n ds g dw e r ec l o n e df r o mr v e r t i c i l l a t af o rt h ef u - s tt i m e m e a n w h i l e ，t h eh i g h l ye f f i c i e n tr e g e n e r a t i o ns y s t e ma n dh a i r yr o o t s y s t e mo f t h i ss p e c i e sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d 0 2 - c - m e t h y l - d - e r y t h r i t o l4 - p h o s p h a t ec y t i d y l l r a n s f e r a s e ( m e t , e c ：2 7 7 6 0 ) ，t h et h i r de n z y m e o ft h e2 - c - m e t h y l - d - e r y t h r i t o l4 - p h o s p h a t e ( m e p ) p a t h w a y , c a t a l y z e sm e pa n dc d pt oy i e l d 4 - d i p h o s p h o e y t i d y l - 2 - c - m e t h y l e r y t h r i t o l ( c d p - m e ) a n dp p i 。t h ef u l l - l e n g t he d n ao fm c t w a s i s o l a t e df r o mr v e r t i c i l l a t au s i n gr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ( r a c e ) t e c h n i q u ea n d c h a r a c t e r i z e d t h en e we d n aw a s d e s i g n a t e da sr v m c t a n ds u b m i t t e dt og e n b a n k t ob ea s s i g n e d w i t ha na c c e s s i o nn u m b e r ：j f 9 6 6 7 3 2 t h ef u l l - l e n g t hr v m c tw a s1 5 2 4b pc o n t a i n i n ga9 4 5b p c o d i n gr e g i o ne n c o d i n ga31 4a n l i n oa c i d sp e p t i d e 、i mac a l c u l a t e dm o l e c u l a rn l a s so f3 4 4 5k d a a n da ni s o e l e c t r i cp o i n to f7 3 4 s e c o n d a ys t r u c t u r ep r e d i c t i o nr e v e a l e dt h a tr v m c tc o n s i s t so f 5 2 8 7 r a n d o mc o i l ，1 5 6 1 e x t e n e ds t r a n da n d3 1 5 3 a l p h ah e l i x r v m c tw a sp r e d i c t e dt o p o s s e s sap l a s t i dt r a n s i tp e p t i d ei ni t snt e r m i n a l c o m p a r a t i v ea n db i o i n f o r m a t i ca n a l y s e sr e v e a l e d t h a tr v m c th a de x t e n s i v ei d e n t i t yw i t hm c t sf r o mo t h e rp l a n t s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i ss u g g e s t e d t h a tm c t sc a nb ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p si n c l u d i n gb a c t e r i a l ，g y m n o s p e r ma n da n g i o s p e r m r v m c tb e l o n g st oa n g i o s p e r mm c t sf a m i l y q u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a tr v m c t e x p r e s s e dh i g h e s ti nt e n d e rl e a v e s ，f o l l o w e db yo l dl e a v e s ，b a r k ，r o o t sa n dt e n d e rs t e m s i i i 西南大学硕十学位论文 l - h y d r o x y - 2 一m e t h y l - 2 - ( e ) - b u t e n y l - 4 - d i p h o s p h a t es y n t h a s e ( h d s ，e c ：1 1 7 4 3 ) c a t a l y z e st h e s i x t he n z y m a t i cr e a c t i o no fm e pp a t h w a y t h ef u l l - l e n g t he d n ao fl i d sw a qc l o n e da n d c h a r a c t e r i z e df r o mr v e r t i c i l l a t a t h en e we d n aw a sd e s i g n a t e da sr v h d sa n ds u b m i t t e dt o g e n b a n k t ob ea s s i g n e d 、玩t l la l la c c e s s i o nn u m b e r ：h q 6 5 9 7 5 9 t h ef u l l - l e n g t he d n ao fr v h d s w a s2 6 4 5b p ，c o n t a i n i n ga2 2 2 3b po r fe n c o d i n g7 4 0a m i n oa c i d sw i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a rm a s s o f8 2 0k d aa n da ni s o e l e c t r i cp o mo f6 2 8 b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a tr v h d sh a d e x t e n s i v eh o m o l o g yw i t hh d s sf r o mo t h e rp l a n ts p e c i e sa n dc o n t a i n e dac o n s e r v e dt r a n s i tp e p t i d e f o rp l a s t i d s t h ep h y l o g e n e f i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tr v h d sb e l o n g e dt o p l a n th d s sf a m i l y q u a n t i t a t i v er t - p c rs h o w e dt h a te x p r e s s i o nl e v e lo f r v h d sw a sh i g h e s ti no l dl e a v e s ，f o l l o w e db y b a r k s ，t e n d e rl e a v e s ，r o o t sa n dt e n d e rl e a v e s s c r i c t o s i d i n e - p d - g l u c o s i d a s e ( s g d ，e c3 2 1 1 0 5 ) c a t a l y z e st h ed e g l u c o s y l a t i o nr e a c t i o no f s c r i c t o s i d i n e ，c o n t r i b u t i n gt ot h ed i v e r s i 够o ft i a si nd i f f e r e n ts p e c i e s t h ef u l l l e n g t he d n ao f s g dw a sc l o n e da n dc h a r a c t e r i z e df r o mr v e r t i c i l l a t a t h en e we d n aw a sd e s i g n a t e da sr v s g d a n ds u b m i t t e dt og e n b a n k t ob ea s s i g n e dw i t ha na c c e s s i o nn u m b e r ：j f 9 6 6 7 3 3 t h ef u l l - l e n g t h e d n ao fr v s g dw a s1 8 5 9b p ，c o n t a i n i n ga1 6 0 8b po r fe n c o d i n g5 3 6a l n i n oa c i d sw i t ha c a l c u l a t e dm o l e c u l a rm a s so f6 1 0k d aa n da ni s o e l e c t r i cp 0 缸o f6 1 6 b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i s r e v e a l e dt h a tr v s g ds h o w e dh i j g hs i m i l a r i t yw i t hs g d sf r o mc 。r o s e t l sa n dr a u v o l f i as e r p e n t i n aa t t h ea m i oa c i dl e v e l ，a n dt h r e ec o n s e r v e dc a t a l y t i cs i t e sh i s - 1 6 1 ，g l u - 2 0 7a n dg l u - 4 1 9w e r ea l s o p r e s e n ti nr v s g d q u a n t i t a t i v er t - p c rs h o w e dt h a te x p r e s s i o nl e v e lo fr v s g dw a sh i g h e s ti n b a r k s ，f o l l o w e db yo l dl e a v e s ，r o o t s ，t e n d e rl e a v e sa n dt e n d e rs t e m s t h ep r e s e n ts t u d yw i l lb e h e l p f u lt ou n d e r s t a n dm o r ea b o u tt h ef u n c t i o n so ft h et h r e eg e n e sa tt h el e v e lo fm o l e c u l a rg e n e t i c s ， a sw e l la sp r o v i d i n gn e w t a r g e t sf o rm o l e c u l a rr e g u l a t i o no f t i a sb i o s y n t h e s i s d u et ot h es h o r ts u p p l yo fr v e r t i c i l l a t a ，m e t a b o l i ce n g i n e e r i n gi so n eo ft h em o s tp r o m i s i n g s t r a t e g i e st os o l v et h i sp r o b l e mw i t ht h eh e l po ff u r t h e re l u c i d a t i o no fb i o s y n t h e t i cp a t h w a y t r a n s g e n i cp l a n t sa n dh a i r yr o o t so b t a i n e dt h r o u g hg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o na r ea l t e r n a t i v es o u r c e so f t i a s e s t a b l i s h m e n to ft r a n s f o r m a t i o ns y s t e mi si n d i s p e n s a b l ef o rc a r r y i n g0 1 1t r a m g e n i cr e s e a r c h ； h o w e v e r , r v e r t i c i l l a t ai sak i n do fw o o d yp l a n tw h i c hi sd i f f i c u l tf o re s t a b l i s h i n gh i g h l ye f f i c i e n t r e g e n e r a t i o ns y s t e m i no r d e rt of a c i l i t a t et h et r a n s g e n i cr e s e a r c hi nt h ef u t u r e ，t h ep r e s e n tr e s e a r c h i n v e s t i g a t e dt h ee s t a b l i s h m e n to fr e g e n e r a t i o ns y s t e ma n dh a i r yr o o tt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m _ t h e r e s u l ts h o w e dt h a tr e g e n e r a t i o ns y s t e mc a l lb ed e v e l o p e dt h r o u g hc u l t i v a t i n gs t e m so nh a l fs 仃e n g t h m sm e d i u mc o n t a i n i n g0 8m g hm a f i r s t l y , f o l l o w e db yc u l t i v a t i n go nm sm e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h2 0m g l6 - b aa n d0 0 5m g ln a a t h r o u g hi n f e c t i n gt e n d e rl e a v e sw i n la g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e sc 5 8 c 1 ，h a i r yr o o ts y s t e mo f r v e r 打c i l l a t aw a se s t a b l i s h e d h p l cd e t e c t i o ns h o w e dt h a t a j m a l i c i n ep r o d u c t i o ni nh a i r yr o o tw a s17 0 9 9u g g ( d 哪t h ep r e s e n ts t u d yw i l lf a c i l i t a t et h e i v a b s t r a c t r e s e a r c ho nm e t a b o l i ce n g i n e e r i n go f t i a si nr r a u v o l f i ai n t h ef u t u r e k e y w o r d s ： r a u v o l f i av e r t i c i l l a t a ；t e r p e n o i d i n d o l e a l k a l o i d s ； 2 - c m e t h y l - d - e r y t h r i t o l4 - p h o s p h a t e c y t i d y l t r a n s f e r a s e ； 1 - h y d r o x y - 2 - m e t h y l 一2 一( e ) - b u t e n y l - 4 一d i p h o s p h a t e s y n t h a s e ； s c f i c t o s i d i n e - p d g l u c o s i d a s e ；t r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ；a j m a l i c i n e v 一 第一章文献综述 第一章文献综述 植物生物碱( a l k a l o i d s ) 是植物在长期对生态环境适应中为抵御微生物等的攻击而产生 的一大类非生长所必需的次生代谢产物( s e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ) 。生物碱是一类含氮的碱性有 机化合物，多具有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性，是中草药中重 要的有效成分之一。生物碱类化合物因具有药理活性而引起人们的广泛关注。目前为人类所 知的生物碱约在2 0 0 0 种以上。按照生物碱的基本结构可以被分为萜类吲哚生物碱( 如利血 平、长春新碱等) 、异喹啉类( 小檗碱、吗啡等) 、莨菪烷类( 阿托品、东莨菪碱等) 等。 1 1 背景概况 萝芙木是一类重要的药用植物，是夹竹桃科( a p o c y n a c e a e ) 萝芙木属( r a u v o l f i al i n n ) 植物的统称。1 7 5 3 年林奈为了纪念德国医生及植物学家l e o n h a r dr a u w o l f i a 而将一种新属的 夹竹桃科植物以其名命名建立萝芙木属。该属中的大多数种类多分布于热带与亚热带地区。 目前该属植物的分类和命名尚不十分明确，其中根据 ：中国植物志记录，该属在全世界约 有1 3 5 种，我国有9 种，多分布于我国西南、华南及台湾地区，民间用其根来治疗高烧、 失眠眩晕，用其鲜叶治疗毒蛇咬伤和跌打损伤。 人类对萝芙木属植物的利用有很悠久的历史。中国很早就应用萝芙木治疗多种疾病，但 本草书籍中未见记载。壮族和瑶族中常用它来治疗高血压、眩晕、高烧、毒蛇咬伤、跌打损 伤等疾病。印度萝芙木( 蛇根木) 的根数百年前就已经被用来治疗精神混乱、癫痫、失眠等 多种疾病【l 】。印度在阐明了利血平降压作用机制后于2 0 世纪5 0 年代初开发出了降血压新药 “寿比南”。鉴于进口药物价格昂贵，我国于2 0 世纪6 0 年代初利用我国本土的萝芙木资源， 以萝芙木总生物碱研发了治疗高血压药物“降压灵”。利血平因其降压效果温和而缓慢、作