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复旦大学博j ：论文拟南芥e s $ 突变体定位克隆及遗传分折 摘要 一、e s s 突变体的定位克隆及遗传分析 花药发育涉及植物发育中最为复杂的生物学过程，花药发育的研究对于理 解植物个体发育各个方面都有重要借鉴意义。花药发育研究进展得益于花药突变 体的遗传分析，尤其是对模式材料拟南芥雄性不育突变体的分析。花药发育突变 体的基因己被克隆的为数不多，任何一个新突变体的鉴定及相关基因的克隆必然 代表着花药发育过程一个新节点的发现，f 是这些节点勾勒出植物发育的轮廓。 目前在几种作物中克隆的c m s 雄性不育恢复基因，他们都是核基因，却编码一 个线粒体定位p p r 蛋白，参于线粒体基因r n a 的加工或翻译调节。e s s 也是一 个p p r 蛋白，e s s 突变体的研究不仅对了解花药发育提供线索，而且对理解线粒 体参于的经由p p r 类蛋白调节的植物雄性育性的研究提供参考。e 镕基因的同 源比较表明其并非一个代谢途径或细胞中的结构组分，可能是一类调节基因或调 节基因辅助成分，因此对于e s s 的研究可能为人为控制雄性育性提供帮助。雄 性不育一直是备受关注的生物学问题，深入的了解雄性不育的机制便于生产上的 利用。生物进化的保守性，使得模式植物中取得的进展很快就能在作物中得到印 证和利用。图位克隆是发现新基因的重要手段。近几年拟南芥图位技术取得重大 突破，形成了标准化的定位程序。国内也有许多实验室从事拟南芥的定位研究， 但是利用c a p c 数据资源进行定位尚未见报道。我们不仅利用c a p c 数据资源 进行定位，而且还发展了近3 0 个新分子标记，在分子标记的检测方面发展了异 源双螺旋分析技术。我们的工作还为定位克隆研究者提供了一个可供参考的操作 程序，丰富了拟南芥的定位技术。 在e m s 诱变处理的m 2 群体中分离了一个早期果荚短小的突变体e s s ，通过 对e s s 突变体的形态分析和显微观察，发现e s s 突变体有以下特点：早期果荚短 小，果荚总数增多，种子量减少。花期推迟，主茎次级分枝高达主茎，成熟期次 生生长弱于野生型。解剖结构发现传粉时花粉量减少，花丝短，花药外观呈褐 色，稀见花粉粒，雌蕊及柱头外观正常。花粉萌发未见异常。杂交结果证实e s s 突变体雌蕊发育f 常，属雄性生殖异常的突变体。在花药不同发育时期的显微观 测中发现，花药发育s t a g e l l 期可见异常小孢子，s t a g e l 4 期花药药室壁塌陷、 表皮下形成空洞且可见败育花粉。果荚变短、种子量的减少均源于花粉量不足造 成的。至于e s s 基因通过何种途径引起主茎优势减弱，主茎侧枝高至主茎以及 成熟期次生生长减弱还不得而知，可能是e s s 基因多效性的一个方面，其分子 机制尚待进一步的研究。 经过图位分析将e s s 突变体定位于第一染色体f 1 2 k 1l 克隆的右端与f 4 h 5 克隆的左端大约6 7 k b 的范围内，位于分子标记u n 2 0 1 ( 2 0 0 0 5 4 1 b p ) 和 u n 6 7 ( 2 0 6 7 8 4 4 b p ) 之间。此突变体定位在基因一突变表型序列图( g m p s m ) 中 a t l 0 6 1 5 0 ( e m b l 4 4 4 ，l8 6 7 1 2 8 7 3 6 9 6 b p ) 和a t l 9 0 8 0 6 0 ( m o m , 2 5 0 1 7 3 9 - 1 1 0 8 1 b p ) 表 型标记之间。这些结果显示e s s 突变体是一新的突变体，可能代表了花药发育的 l i i 复丑大学博i 论文 拟南芥e s s 突变体定位克隧及遗传分析 一个调节途径。此侯选区蚓包括2 4 个基因，其中a t i 9 0 6 7 1 0l 基因注释显示该 基因同矮牵牛育性恢复基因具有一定的同源性。通过l e r 和e s s 测序比较发现e s s 突变体a t l g 0 6 7 1 0 1 基因( 2 8 4 l b p ) 第2 6 8 3 位的鸟嘌呤突变为腺嘌呤( g a ) ，突 变引起所编码p p r 蛋白( 9 4 7 a a ) 的第8 9 5 位的谷氨酸突变为赖氨酸( e k ) 。电 子分析表明a t l 9 0 6 7 1 0 1 蛋白具有1 0 个p p r 结构域，可能通过调节类似b i c o i d 蛋白的m r n a 的加工而实现对花药发育的控制，该过程可能涉及到线粒体。 关键词： p p r 蛋白定位克隆分子标记花药发育连锁分析拟南芥突变体诱变 二、寒优湘晴杂交稻亲本花药培养后代的分子鉴定 a f l p 是选择性的扩增相距适合于p c r 扩增的限制性内切酶识别位点i n j 的d n a 序列，它具有r f l p 的可靠性及p c r 技术高效性的优点。不受组织和器官种类、发 育阶段、生境条件等因素的影响，因此a f l p 是用于种质鉴定、种质亲缘关系及种 质分类研究的理想标记。a f l p 指纹分析不需要预知一定的d n a 序列或材料的背 景，检测位点多，可靠性好等优点而受到广泛应用，因此可以尝试利用这一技术 检查寒优湘晴杂交稻亲本花培后代的纯合度和混杂率，为种质提纯提供指导。 寒优湘晴杂交稻亲本花药后代a f l p 分析表明寒丰a 群体纯合性好，寒丰b 的 变异较大，湘晴4 1 4 4 介于二者之间。寒丰b 作为保持系存在较大的问题，应该作 为纯化重点。在寒优湘晴杂交稻亲本鉴定中，5 个引物对配合使用完全可以将这 三个亲本区分玎。p 1 p 5 引物对均可将湘晴4 1 4 4 亲本同不育系寒丰a n n 保持系寒 丰b 区分开。p 5 引物对具有不育系寒丰a 显著的特异扩增条带p 5 8 。不育系寒丰a 和保持系寒丰b 的共有扩增条带中p 4 2 差异最显著。在我们的试验中有多种组合 可以将不育系和保持系区分丌，如p 4 和p 5 引物对组合。综上所述，利用我们所建 立的银染- a f l p 技术可以满足寒优湘晴杂交稻亲本的纯合度的鉴定，也可以满足 这三个亲本的彼此鉴别。 关键词： a f l p 寒丰a 寒丰b 寒优湘晴杂交稻花药培养湘晴4 1 4 4 种子纯度 复旦大学博士论文拟南芥c s s 寒变体定位克隆搜遗传分析 a b s t r a c t 1 p o s i t i o n a lc l o n ea n dg e n e t i ca n a l y s i so ft h ea r a b i d o p s i st h a l i a n ae s sm u t a n t a n t h e rd e v e o p m e n ti si n v o l v e di nt h em o s tc o m p l e xp a t h w a yi np l a n tg r o w t h ，t h e r e s e a r c h i n gr e s u l t so fw h i c hc o u l dg i v ei n s i g h ti n t ot h eo t h e ra s p e c t so ft h ep l a n t d e v e l o p m e n t t h ep r o g r e s si na n t h e rd e v e l o p m e n tr e s e a r c hh a sb e e na c c e l e r a t e db y t h eg e n e t i ca n a l y s i so ft h o s ea n t h e rm u t a n t s t h o u g haf e wg e n e sc l o n e df r o mt h o s e a n t h e rm u t a n t s ，d o e si tm e a nt h a tan e ws t e po fa n t h e rd e v e l o p m e n tb eu n c o v e r e d w h e n e v e ra n yn o v e lm u t a n t sw e r ef o u n dr e l a t e dt oa n t h e rd e v e l o p m e n ta n dt h e c o r r e s p o n d i n gg e n e sw e r ec l o n e d t h eo u t l i n eo fa n t h e rd e v e l o p m e n ti sj u s tf i g u r e d w i t ht h o s es t e p sb yt h i sw a y i nr e c e n t ，s e v e r a lr e s t o r e rf e r t i l i t yg e n e sw e r ec l o n e d f r o mc r o p s ，w h i c hc o u l dr e s t o r et h ec m sm a l es t e r i l i t ya n da l lb e l o n gt on u c l e a rg e n e ， t h e s eg e n e st r a n s l a t ei n t op r o t e i nc o n t a i n i n gp p rm o t i f sl o c a t i n gi n t om i t o c h o n d r i a a n dr e g u l a t et h em i t o c h o n d r i ar n a p r o c e s s i n go rp o s t t r a n s l a t i o ni n v o l v e di nc m s b e c a u s et h eg e n ee s si sj u s tt h i sk i n do fp r o t e i nc o n t a i n i n gp p rm o t i f s ，t h es t u d y i n g o fe s sm u t a n tm u s tb r i n gi n t os o m ec l u e sa b o u ta n t h e rd e v e l o p m e n ta n da l s om a k ea p r o g r e s si nu n d e r s t a n d i n gt h ep l a n tm a l es t e r i l i t yi n v o l v e di nm i t o c h o n d r i aa n dp p r p r o t e i n u n c o v e r i n gt h ef u n c t i o no fe s sg e n em a y b eg i v es o m eh e l p si nt h ea r t i f i c i a l c o n t r o lo nm a l ef e r t i l i t yb e c a u s et h ed a t ao fh o m o l o g o u sc o m p a r i n ga n a l y s i si n d i c a t e t h a te s sg e n en o tb eap r o t e i nt a k i n gp a r ti nm e t a b o l i s mo rab l o c ki nc e l ls t r u c t u r e ， b u taf a c t o ro rc o f a c t o ri ns o m ek i n do fr e g u l a t o r s m a l ef e r t i l i t yi sa l w a y sf o c u s e d a t t e n t i o nu p o no n l yb e c a u s es o m eo ft h es t u d y i n gc a nb eu s e di nc r o p sp r o d u c t i o n t h ef i n d i n g se a r n i n gf r o mt h em o d e lp l a n ts u c ha sa r a b i d o p s i sc a nb eu s e di nc r o p s s m o o t h l yb e c a u s eo f t h ee v o l u t i o nc o n s e n s u s p o s i t i o n a lc l o n ei sa ni m p o r t a n tm e t h o d f o rd i s c o v e r i n gn o v e l g e n e s t h e r e i sap r o m i n e n tb r e a k t h r o u g hi n a r a b i d o p s i s m a p p i n g ，w h i c hm a k eas t a n d a r dp r o t o c o l f o rp o s i t i o n a lc l o n ei n a r a b i d o p s i s a l t h o u g hs e v e r a li n l a n dl a b sh a v ec a r r yo u ta r a b i d o p s i sm a p p i n gr e s e a r c h ，t ot o d a y t h e r ei sn o tr e p o r t e dt h a tm a p p i n gu s i n gc a p ci n f o r m a t i o nw a sp u b l i s h e di nt h e c o u n t r y i no u rs t u d y i n g ，w en o to n l yu s e dt h ec a p cd a t ai np o s i t i o n a lc l o n e ，b u ta l s o d e v e l o p e d a b o u t3 0n o v e lm a k e r sb a s e do nc a p ca n dn e wp r o t o c o lo f h e t e r o g e n e o u sd o u b l eh e l i xa n a l y s i sf o rs n p so rs m a l li n d e l s o u rm a p p i n gw o r k a l s og i v e sae x a m p l ef o rh o wt od op o s i t i o n a lc l o n ei na r a b i d o p s i s t h em u t a n te s ss e l e c t e df r o me m sm u t a n tg e n e s i sp o p u l a t i o n t h er e s u l t so fe s s p h e n o t y p ea n a l y s i sa n dc h a r a c t e r i z i n gb yl i g h tm i c r o s c o p ea r et h ef o l l o w i n g ：t h e v 复日大学博i ：论义 拟南芥c 站突变体定位克隆及遗传分析 e a r l ys i l i q u e sa r es h o r t e r ，s i l i q u en u m b e r si n c r e a s ea n dt h es e e d sp r o d u c t sr e d u c e t h e f l o w e r i n gp e r i o di sd e l a y e d ，t h es e c o n d a r yb r a n c ho fm a i ns t e mi sj u s ta sh i g ha sm a i n s t e m ，a n dt h es e c o n d a r yg r o w i n gi sw e a k e n e di nr i p e n e s s i nt h eo p e n i n gf l o w e r ，t h e f i l a m e n t sa r es h o r t e r ，t h ea n t h e r sa r eb r o w n ，p o l l e n sr e d u c es h a r p l y ，b u tt h ec a r p e l s a r en o r m a l p o l l e ng e r m i n a t i o ni sn o r m a l t h ee s sm u t a n ti sd e f e c ti nm a l er e p r o d u c t i o n b e c a u s et h es i l i q u eb e c o m en a t u r a lw h e np o l l i n a t i n gw i t hn o r m a lp o l l e n a b n o r m a l m i c r o s p o r e sa r ef o u n di ns t a g e11 i ns t a g e14 ，a n t h e rw a l li sc o l l a p s e da n de r i m p l e d ， t h ec a v i t i e sa r ef o u n du n d e re p i d e r m i sa n dt h es t e r i l i t yp o l l e n sa r eo b v i o u s t h e c h a r a c t e ro fs h o r ts i l i q u e sa n dr e d u c e ds e e d si sc a u s e db yf e wo f p o l l e n s b yp o s i t i o n a lc l o n e ，t h em u t a n te s sw a sl o c a l i z e do nt h er i g h to fb a cc l o n eo f f 1 2 k 11 a n dt h el e f to ff 4 h 5b e t w e e nt h em a k e r u n 2 0 1 ( 2 0 0 0 5 4 t b p ) a n d u n 6 7 ( 2 0 6 7 8 4 4 b p ) i nt h ec h r o m o s o m el ，t h er e g i o nc o m e sc r o s sa b o u t6 7 k b i nt h e s e q u e n c e b a s e dm a po fa r a b i d o p s i sg e n e sw i t hm u t a n tp h e n o t y p e s ，e s si sb e t w e e n a t l 0 6 15 0 ( e m b l 4 4 4 ，1 8 6 7 1 2 8 7 3 6 9 6 b p ) a n da t l 9 0 8 0 6 0 ( m o m , 2 5 0 1 7 3 9 1 1 0 8 1 b p ) a l lt h ed a t ai n d i c a t et h a te s sb ean o v e la n t h e rm u t a n t ，w h i c hs h o wan e wp a t h w a yi n a n t h e rd e v e l o p m e n t t h e r ea r e2 4c a n d i d a t eg e n e si nt h i sr e g i o n ，o n l yt h en o t eo ft h e a t l9 0 6 710 1 g e n eg i v eac l u er e l a t e dt om a l es t e r i l i t y t h es e q u e n c e dr e s u l tp r o v e d t h a tt h e r ei sam u t a n to fgt oaa t2 6 8 3 ”n ti nt h ea t i g 0 6 7 1 0 1 ( 2 8 4 i n t ) w h i c h i n d u c et h a t8 9 5 “g i u ( e ) c h a n g st ol y s ( k ) i nt h et r a n s l a t i o np r o t e i n ( 8 9 5 a a ) d a t a f r o mh o m o g e n o u sa n ds t r u c t u r e a n a l y s i sm e a nt h a ta t l 9 0 6 7 1 0 1b eap r o t e i n c o n t a i n i n g 10p p rm o t i f s ，a n dc o n t r o lt h ea n t h e rd e v e l o p m e n tb yr e g u l a t i n gt h e p r o c e s s i n go fs o m ek i n do fu n k n o w nr n a l i k eb i c o i dr n ao rp o s t t r a n s l a t i o ni nt h e t r a n s l a t i o no f u n k n o w np r o t e i n s k e y w o r d s ： a n t h e rd e v e l o p m e n t ，a r a b i d o p s i s ，l i n k a g ea n a l y s i s ，m o l e c u l a rm a k e r ， m u t a n t ，m u t a n tg e n e s i s ，p o s i t i o n a lc l o n e ，p r o t e i nc o n t a i n i n gp p rm o t i f s 2m o l e c u l a rc h e c k i n go i lt h eo f f s p n n go ft h ep a r e n t sf r o ma n t h e rc u l t u r eo f h a n f e n g - x i a n g q i n gh y b r i dr i c e a f l pn a m e df r o m _ a m p l i f i e dr e s t r i c t i o n _ f r a g m e n t ! e n g t h1 2 0 l y m o r p h i s mi so n eo f t h em o s te f f e c t i v e ，s t a b i l i z i n ga n dc r e d i b l em e t h o d si nd n af i n g e r p r i n t i n g a f l pc a n b e u s e di n m a n ya s p e c ts u c ha sp l a s m ac h e c k i n g ，r e l a t i v ea n a l y s i s ，s e e dq u a l i t y m o n i t o r i n g o f f s p r i n go f t h ep a r e n t sf r o ma n t h e rc u l t u r eo f h a n f e n g - x l a n g q i n gh y b r i d 复旦犬学博士论文 拟南芥c s s 突变体定位克隆及遗传分析 r i c ew e r ec h e c k e du s i n gt h i sm e t h o d t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ev a r i a t i o nr a t eo f h a n f e n g a i sl o w e s t ，t h er a t eo fh a n f e n g bi sm o s th i g ha n dv a r i a t i o nr a t eo f x i a n g q i n 9 4 1 4 4 i sb e t w e e nt h e m s e e dp u r i f i c a t i o nm a y b ef o c u so nh a n f e n g b t h ep a r e n t so fh a n f e n g - x i a n g q i n gh y b r i dr i c ec a nb e e nd i s t i n g u i s h e df r o me a c h o t h e ru s i n gt h e5p r i m e rp a i r s e a c hp r i m e rp a i r sa l lc a nd i s t i n g u i s hx i a n g q i n 9 4 1 4 4 f r o mh a n f e n g aa n dh a n f e n g bt h ep r i m e rp a i rp 5h a v eo b v i o u sd i f f e r e n tp c rr e s u l t a th a n f e n g ap a r e n tf r o mt h eo t h e r s p 4 2i st h es a m ep c rs t r i p eo fh a n f e n g aa n d h a n f e n g bw h i c hi s d i s t i n c td i f f e r e n tt ? o mx i a n g q i n 9 4 1 4 4 t h e r ea r em a n yc h o i c e w h i c hc a nb e u s e di nc h e c k i n gt h ed i f f e r e n c eo f 胁咖n 鲋a n dh a n f e n g b ，s u c ha sp 4 a n dp 5p r i m e rp a i r su s i n gt o g e t h e r k e y w o r d s ： a f l p , a n t h e rc u l t u r e ，h a n f e n g a ，h a n f e n g b ，h a n y o u x i a n g q i n gh y b r i dr i c e ， s e e dp u r i f i c a t i o n ，x i a n g q i n 9 4 1 4 4 复且丈学博十论文 拟南芥c s s 突变体定位克隆及遗传分析 名词缩略表 1 3n u e l e o t i d ei n s e r t i o n d e l e t i o ns i n d e l ( s m a l ll n d e l ) a m p l i f i e dr e s t r i c t i o nf r a g m e n t a f l p l e n g t hp o l y m o r p h i s m a r a b i d o p s i st h a l i a n a a t h c e r e o na r a b i d o p s i sp o l y m o r p h i s mc o l l e c t i o nc a p c c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c ec a p s c o l u m b i a - 0 ( a t hc o l u m b i ae c o t y p e ) c o l - 0 c o r m e e t i v ec d e r i v e dc a p sd c a p s e n d o t h e c i u me n e p i d e r m i s e e t h y l m e t h a n es u l f o n a t e e m s l n s e r t i o n d e l e t i o ni n d e l l a n d s b e r ge r e c t a ( a t hl a n d s b e r ge c o t y p e ) l e r m a l es t e r i l em s m i c r o s p o r em s p m i d d l el a y e rm l p e n t a t r i c o p e p t i d er e p e a t p p r p o l l e ng r a i n sp g p o l l e nm o t h e rc e l lp m c s e p t u m s m s e q u e n c e - b a s e dm a po fa r a b i d o p s i sg e n e sw i t h g m p s m m u t a n tp h e n o t y p e s s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s i n g l e n u c l e o t i d ea m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m s p o r o g e n e o u sc e l l s s t o m i u m s t o m i u mr e g i o n t a p e t u m t e t r a d s t h ea n t h e rc e l ll a y e r so f t h es t a m e np r i m o r d i a t h ee a r l ys i l i q u e sa r es h o r t e r v a s c u l a rr e g i o n s s l p s n p s n a p s p s t s t r t t d s l l ，l 2 ，l 3 e s $ v 拟南芥 连接组织 花约内肇 表皮 甲基磺酸乙酯 雄性不育 小孢子 中层 花粉粒 花粉母细胞 药隔 基冈突变表型 序列图 造孢细胞 开裂孔 开裂带 绒毡层 四分体 花药原基细胞层 微管柬 v i l l 复旦大学博0 ：论文拟南芥e s s 突变体定位克隆及遗传分析之花药发育4 i 雄性育性的研究进j f 芝 第一章花药发育和定位克隆技术 第一节花药的发育研究进展及雄性育性 显花植物个体发育中有两个重要事件即减数分裂和双受精，籍此完成配子体 ( n ) 和孢子体( 2 n ) 间的世代交替。茎端分生组织属性的决定与分化控制花序、花及 4 轮花部的发生，已有诸多论述( i r i s hv f ，1 9 9 8 ：t h e i b e ng a n ds a e d l e rh ， 2 0 0 1 ：l i l j e g r e ns j a n d a n o f s k y tm f ，1 9 9 5 ：c o e ne ，2 0 0 1 ：j a c kt ，2 0 0 1 p i d k o w i c hm s ，e ta l ，1 9 9 9 ：r u n n i n gm p a n dh a k es ，2 0 0 1 ：白书农， 2 0 0 3 a ) 。花之各部的形成有着严密的协调性，但原基一经形成各自则沿着相对独 立的途径完成自身的的发育，最终长成形态迥然功能迥异的雌蕊、雄蕊、花瓣与 萼片等结构。雄蕊是负责雄性生殖的器官，隶属于花的第三轮，包括花药和花丝 等结构。花药位于花丝顶部，起源于雄蕊原基顶部一群分裂活跃的细胞，经过决 定、分化和特化形成具有4 个花粉囊的花药。位于花粉囊中央的孢原细胞，经平 周分裂形成初生壁细胞和初生造孢细胞。前者最终发育成花药壁后者经有丝分 裂、分化最终形成小孢子母细胞，然后经减数分裂形成小孢子，小孢子经过1 2 次有丝分裂、分化发育成成熟的花粉。花药壁有表皮、内壁、中层及绒毡层构成， 在整个花药发育中其形态发生显著改变，参与雄配子体的发生。在小孢子母细胞 减数分裂期间，中层细胞就开始变化，首先储藏物质减少，细胞变得扁平，然后 趋于解体直至被吸收。高度发育的绒站层细胞具腺细胞特征，细胞质浓厚、液泡 少而小。在小孢子母细胞减数分裂接近完成丌始出现退化现象，在小孢子向花粉 转化的过程中逐步趋于解体，在花粉成熟时仅留残迹或已不复存在。等到花丌时， 花药开列释放出成熟的花粉，为传粉和双受精做好准备。虽然不同植物花药的个 体发育有所不同，但是一般来讲花药的发育大致如此( 胡适宜，1 9 8 2 ；许智宏， 刘春明。1 9 9 8 ：盂金陵，1 9 9 5 a ：白书农，2 0 0 3 a ：s a n d e r sp m ，e ta l ，1 9 9 9 ： g o l d b e r gr b ，e ta l ，1 9 9 3 ) 。通过细胞学的研究基本上弄清了花药发育过程 中细胞群的谱系，花药发育中各个时期所发生的重要的细胞学事件( 胡适宜，1 9 8 2 许智宏，刘春明，1 9 9 8 ；孟金陵，1 9 9 5 a ；白书农2 0 0 3 a ) 。不仅如此，在花药发 育的进程中，涉及到植物发育中最为复杂的生物学过程，如细胞决定、分化、细 胞调亡、有丝分裂、减数分裂，细胞间的通讯、不同组织的协调及倍性不同细胞 群的关系等，花药发育的研究对于理解植物个体发育的各个方面都是有重要借鉴 意义。雄性生殖异常导致可遗传的完全不育或育性降低是被子植物十分显著的现 象，因而早在1 7 世纪术就有桑树不育现象的记录。从功能上将雄性不育分为结 构性、孢子发生性及功能性三种不育类型，孢子发生性的雄性不育由于小孢子囊 和小孢子的发生异常造成的，占整个不育类型的6 7 ( 孟金陵，】9 9 5 b ) 。由于这 类变异个体是特定基因改变造成的，所以此类突变的分析对于揭示花药发育的遗 传控制十分重要。近年来，花药发育研究所取得的进展得益于模式植物遗传学的 发展，特别是拟南芥花药发育突变体的分析。此外，随着分子生物学的发展，克 隆了很多花药特异表达基因，不仅对花药发育的理解提供线索，也为利用反向遗 传学研究花药发育提供必不可少的背景资料。因此我们将从以下两个方面讨论近 复q 人学陴j 论文拟商芥e s s 突变体定位觅隆发遗传分析之花药发育弛匪性育性的研究进展 年来花药发育所取得的进展，大致描绘近年来花药发育遗传控制的轮廓，促进对 花药发育的理解。 1 拟南芥花药的形态发生和遗传控制 l 1 花药的形态发生 在模式植物拟南芥中已经详细的研究了花药的形态发生，将其分为1 5 个时 期( s t a g e l ，每一个时期都有详尽的描述和重要的细胞学特征为标志( 表1 ) ( s a n d e r s r m ，e ta l ，1 9 9 9 ) 。虽然这些时期的划分主要依据是组织形态特征，并不代表发 育过程中的停滞，但是人为划分的各时期的花药各细胞群的功能确实存在着分化 上的差异。对于模式材料花药发育时期划分的标准化有利于突变体的鉴定和基因 功能的研究。烟草的花药发育以减数分裂完成及四份体小孢子产生为界分为两相 ( p h a s e l 和p h a s e 2 ) ，相1 ( p h a s e l ) 包括( 一7 ) 至( 一t ) 期( s t a g e ) ，主要发生雄蕊原 基细胞的决定、组织分化及减数分裂和小孢子产生；相2 包括1 至1 2 期，主要 涉及花粉成熟、花丝延伸、花药膨大及花药开裂等( g o l d b e r gr b ，e ta l ，1 9 9 3 ) 。 其期l ( s t a g e l ) 相当于拟南芥的6 7 期( s l a g e 6 7 ) 。我们认为在拟南芥花药发育中 有四个比较明显的阶段，第一是花药全部组织的形成即t 至5 时期，雄蕊原基中 l 1 、l 2 和l 3 层细胞决定、分化产生花药壁各层细胞、造孢细胞、药隔、微管系 统和连接组织，花药横切面具备典型的全部组织类型。第二个阶段是减数分裂期， 伴随中层的降解，绒毡层特化。包括6 、7 和8 三个时期，该阶段结束时中层消 失，绒毡层细胞显现出典型分泌细胞的形态，产生小孢子。第三个阶段主要是小 孢子发育成花粉粒，涉及绒毡层降解和药隔的分化与降解。第四个阶段是成熟花 粉的释放，主要涉及花丝延伸、花药丌裂孔丌裂等。 t a b l e1 m a j o re v e n t sd u r i n ga r a b i d o p s i sa n t h e rd e v e l o p m e n t ( c i t e df r o ms a n d e r sr m ，b u ia q ，w e t e r i n g sk ，e ta l 19 9 9 ；m o d i f i e dal i t l l e ) a n t h e r m a j o re v e n t sa n dm o r p h o l o g i c a lm a r k e r s t i s s u e s f l o w e rp o l l e n 吾 善 p r e s e n t s t a g es t a g e ( a ) 饵) ( c ) l r o u n d e ds t a m e np r i m o r d i ae m e r g e l i ，l 2 ，l 3 5 2a r c h e s p o r i a lc e l l sa r i s ei nf o u r c o r n e r s o fl 2 l a y e r c h a n g ei ns h a p eo fp r i m o r d i at om o r eo v a l e a r 3 f o u rr e g i o n so fm i t o t i ca c t i v i t y 1op a r i e t a la n d1 。 s p o r o g e n o u sl a y e r sd e r i v e df r o ma r c h e s p o r i a lc e l l s e 。2 。p , s p 7 勺f u r t h e rd i v i s i o n so f e a c hl a y e rg e n e r a t et h e2 。 ， p a r i e t a ll a y e r sa n ds p o r o g e n o u sc e l l s ，r e s p e c t i v e l y o 4 f o u r l o b e da n t h e rp a t t e r nw i t ht w od e v e l o p i n ge ，e n ， 8 s t o m i u mr e g i o n s ( “n o t c h ”) g e n e r a t e d v a s c u l a r m l ，t ，s p ， r e g i o ni n i t i a t e d c v 5 f o u rc l e a r l yd e f i n e di o e u l e se s t a b l i s h e d a l la n t h e re ，e n ， c e l lt y p e sp r e s e n ta n dp a t t e r no fa n t h e rd e f i n e d m l ，t ， 9 3 m i c r o s p o r em o t h e rc e l l sa p p e a r m m c ，c ， v 复q 大学博t ：论文 拟南芥e s s 突- 变仲定位克隆及遗传分析之花药发育与雄性育性的研究进展 6 m i c r o s p o r em o t h e rc e l l se n t e rm e i o s i s m i d d l e e ，e n ， l a y e ri sc r u s h e da n dd e g e n e r a t e s t a p e t u mb e c o m e s m l ，t ， v a c u o l a t e da n dt h ea n t h e ru n d e r g o e sag e n e r a lm c ，c ，v 勺 i n c r e a s ei ns i z e ， 器 n7 m e i o s i sc o m p l e t e d t e t r a d so f m i c r o p s o r e sf r e ee ，e n ， 4 一 w i t h i ne a c h