（遗传学专业论文）里氏木霉xyn2基因在毕赤酵母中的表达及应用研究.pdf

1，j1 目录 摘要i 英文摘要i i i l 弓i 言1 1 1 研究的目的及意义1 1 2 文献综述2 1 2 1 木聚糖的应用及研究进展2 1 2 2 毕赤酵母表达系统研究进展7 1 3 本论文的主要研究内容1 1 2 材料与方法1 2 2 1 实验材料j 1 2 2 1 1 菌株及质粒。1 2 2 1 2 试剂1 2 2 1 3 培养基。1 3 2 1 4 引物13 2 。2 实验方法1 4 2 2 1 载体构建。1 4 2 2 2 木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达。1 5 2 2 3 重组木聚糖酶酶学性质的研究。1 6 2 2 4 毕赤酵母重组菌摇瓶发酵条件的研究17 2 2 5 木聚糖酶酶解产物分析。l8 3 结果与分析1 9 3 1 载体构建1 9 3 1 1 毕赤酵母表达载体p g a p h a x y n 2 的构建1 9 3 1 2 毕赤酵母表达载体p g a p r h a x y n 2 的构建2 0 3 1 3 毕赤酵母表达载体p g a p h i n u x y n 2 的构建2 3 3 1 4 毕赤酵母表达载体p g a p h a m x y n 2 的构建2 4 3 1 5 毕赤酵母表达载体p g a p h a e x y n 2 的构建2 6 3 2 木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达3 0 3 2 1 毕赤酵母表达载体的性线化3 0 3 2 2 毕赤酵母的电击转化3 0 3 2 3 木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达31 3 2 4 木聚糖酶的蛋白分析3 2 3 3 重组木聚糖酶酶学性质的研究3 3 3 3 1 木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达3 3 3 3 2 最适p h 的测定3 3 3 3 3 热稳定性的测定3 4 东北农业大学理学硕l j 学位论文 3 3 4 酸碱稳定性的测定3 5 3 3 5 金属离子对酶活力的影响3 6 3 4 毕赤酵母重组菌摇瓶发酵条件的研究3 7 3 4 1 初始p h 对产酶的影响3 7 3 4 2 培养温度对产酶的影响3 7 3 4 3 培养时间对产酶的影响3 8 3 4 4 装液量对产酶的影响3 9 3 4 5t r i t o n 添加量对产酶的影响4 0 3 4 6 e d t a 添加量对产酶的影响。4 0 3 5 木聚糖酶酶解产物分析4l 2 i 讨论4 2 4 1 启动子的选择。4 2 4 2 信号肽的选择4 2 4 2 1 菊粉酶信号肽的选择4 2 4 2 2 a f a c t o r 信号肽的改选4 2 4 3 毕赤酵母的转化方式。4 3 4 4 毕赤酵母转化子的鉴定4 3 4 5 发酵条件对产酶的影响4 3 5 结论。4 4 5 1 表达载体的构建4 4 5 2 木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达。4 4 5 3 重组木聚糖酶的酶学性质4 4 5 4 毕赤酵母重组菌摇瓶发酵条件的研究。4 4 5 5 木聚糖酶酶解产物分析4 5 j g 【谢z 1 6 参考文献4 7 附录5 l 攻读硕士学位期间发表的学术论文5 2 、 一 c o n t e n t s c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i i i 1i n t r o d u c t i o n 1 1 1p u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c eo ft h er e s e a r c h 1 1 2n a t i o n a la n da b r o a dr e s e a r c hs u m m a r i z a t i o n 2 1 2 1a p p l i c a t i o na n dp r o g r e s so f x y l a n a s e 2 1 2 2p r o g r e s so f p i c h i ae x p r e s s i o ns y s t e m 7 1 3m a i nc o n t e n to f t h i sr e s e a r c h 11 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d l ：1 2 1 e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 1 2 2 1 1s t r a i n sa n dp l a s m i d 1 ：1 2 1 2 r e a g e n t s 1 2 2 1 3m e d i u m 1 ：； 2 1 4p r i m e r s 1 3 2 2e x p e r i m e n tm e t h o d s 1 4 2 2 1v e c t o rc o n s t r c u t i o n 1 4 2 2 2 e x p r e s s i o no fx y n 2i np i c h i ap a s t o r i s 1 5 2 2 3r e s e a c ho fr e c o m b i n a n tx y l a n a s ec h a r a c t e r 1 6 2 2 4r e s e a r c ho rf e r m e n t a t i o n 17 2 2 5a n a l y s i so fe n z y m o l y s i sp r o d u c t 18 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 1 9 3 1v e c t o rc o n s t r c u t i o n 1 9 3 1 1c o n s t r u c t i o no f p i c h i a p a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o rp g a p h e t - x y n 2 1 9 3 1 2c o n s t r u c t i o no f p i c h i a p a s t o r 妇e x p r e s s i o nv e c t o rp g a p r h a x y n 2 2 0 3 1 3c o n s t r u c t i o no f p i c h i a p a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o rp g a p h i n u x y n 2 2 3 3 1 4c o n s t r u c t i o no f p i c h i a p a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o rp g a p h a m x y n 2 2 4 3 1 5c o n s t r u c t i o no f p i c h i a p a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o rp g a p h a e x y n 2 2 6 3 2e x p r e s s i o no f x y n 2i np i c h i a p a s t o r i s 3 0 3 2 1l i n e a r r i z a t i o no f p i c h i a p a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o r 3 0 3 2 2e l e c t r o t r a n s f o r m a t i o no f 尸i c h i a p a s t o r i sg s ll5 3 0 3 2 3e x p r e s s i o no f x y n 2i np i c h i a p a s t o r i s 3l 3 2 4p r i t e i na n a l y s i so f x y l a n a s e 3 2 3 3r e s e a c ho fr e c o m b i n a n tx y l a n a s ec h a r a c t e r 3 3 3 3 1m e n s u r a t i o no fo p t i m a lt e m p e r a u r e 3 3 3 3 2m e n s u r a t i o no f o p t i m a lp h 3 3 3 3 3m e n s u r a t i o no ft h e r m a ls t a b i l i t y 3 4 3 3 4m e n s u r a t i o no fa c i ds t a b i l i t y j ) 3 3 5e f f e c t so f m e t a li o n so nt h ex y l a n a s ea c t i v i t y 3 0 3 4r e s e a c ho f f e r m e n t a t i o n a lc o n d i t i o n 3 7 3 4 1e f f e c to fi n i t i a lp ho nx y l a n a s ea c t i v i t y ”3 7 3 4 2e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nx y l a n a s ea c t i v i t y 3 7 3 4 3e f f e c to ft i m eo nx y l a n a s ea c t i v i t y 3 8 3 4 4e f f e c to fl i q u i dv o l u m eo nx y l a n a s ea c t i v i t y 3 9 3 4 5e f f e c to fa d d i t i o n a lt r i t o n0 1 1x y l a n a s ea c t i v i t y 4 0 3 4 6e f f e c to fa d d i t i o n a le d t a 。4 0 3 5a n a l y s i so fe n z y m o l y s i sp r o d u c t 4 l 4d i s c u s s i o n 。4 2 4 1t h ec h o i c eo f p r o m o t o r 。4 2 4 1t h ec h o i c eo f s i g n a lp e p t i d e 4 2 4 2 it h ec h o i c eo fi n us i g n a lp e p t i d e 4 2 4 2 2t h eo p t i m i t a t i o no fa - f a c t o rs i g n a lp e p t i d e 4 2 4 3t h et r a n s f o r m a t i o nm o d a l i t yo f p i c h i a p a s t o r i s 4 3 4 4i d e n t i f i c a t i o no f p i c h i a p a s t o r i sc o n v e r t e r 。4 3 4 5t h ee f f e c to ff e r m e n t a t i o n a lc o n d i t i o no nx y l a n a s ea c t i v i t y 4 3 5c o n c l u s i o n 4 4 5 1v e c t o rc o n s t r c u t i o n 4 4 5 2e x p r e s s i o no f x y n 2i np i c h i a p a s t o r i s 4 4 5 3r e s e a c ho f r e c o m b i n a n tx y l a n a s ec h a r a c t e r 。4 4 5 4r e s e a c ho ff e r m e n t a t i o n a lc o n d i t i o n 4 4 5 5a n a l y s i so f e n z y m o l y s i sp r o d u c t 4 5 a c k n o w l e d g e m e n t 4 6 r e f e r e n c e s 4 7 a p p e n d i x 5 1 p u b l i s h e da r t i c l ed u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r 5 2 研究生学位论文独创声明和使用授权书 曼曼曼曼兰曼曼曼曼! 曼曼! 苎曼曼曼! 曼曼! ! 曼曼曼! 曼! ! 皇曼曼曼蔓曼i。i 曼! 皇鼍曼曼曼! 曼曼曼曼曼! ! 曼量曼曼曼曼曼皇! 曼曼鼍曼曼曼曼 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 。 学位论文作者签名：暴瑚 日期：肼多月他日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 日期：搠年多月护日 日期：如胗年钼o 日明彩 z基籼钐 名 名 签者 签 作 文 论 师 位学 导 摘要 摘要 木聚糖酶( 1 ，4 - 1 3 一d x y l a nx y l a n o h y d r l a s e ，e c3 2 1 8 ) 通过内切方式水解木聚糖分子中 的b 一1 ，4 木糖营键，水解产物以木二糖和木三糖为主，及少量的木糖和阿拉伯糖。以木二糖、 木三糖为主的低聚术糖以其良好的低热性、稳定性、保湿性、双歧杆菌增殖作用等保健作用 广泛应用于食晶领域。目前，低聚木糖主要通过酶法降解木聚糖制备。筛选和制备高活性和 高底物特异性的木聚糖酶组分，以获得二糖、三糖比例高，单糖比例低的水解产物是生产低 聚木糖的技术关键。传统的方法是通过菌种筛选和发酵控制获得高木聚糖内切酶活性、低木 糖= 茴：酶活性的木聚糖酶，但是结果不够理想。采用基因工程手段表达木聚糖酶将是解决这一 问题的有效手段。 本文以实验室前期构建的p p i c 9 x y n 2 载体为基础，从启动子和信号肽的替换入手，构建 新型的表达载体，为木聚糖酶在毕赤酵母中的安全高效分泌表达探讨新的方法，并对重组木 聚糖酶的酶学性质、摇瓶发酵条件和酶解产物进行了研究，以期为重组木聚糖酶的应用提供 参考。研究内容及结果如下； 1 构建新型表达载体 以p p i c 9 x y n 2 载体为基础，从启动子和信号肽的替换和改造入手，设计和构建了毕赤酵 母表达载体p g a p h a - x y n 2 、p g a p r h a - x y n 2 、p g a p h i n u - x y n 2 、p g a p h a m - x y n 2 、 p g a p h a e x y n 2 。在这一系列载体中，x y n 2 均由g a p 启动子调控，引导外源蛋白分泌表达的 信号肽分别为酿酒酵母的a f a c t o r 信号肽、菊粉酶基因信号肽i n u 以及优化设计的n - f a c t o r 信号肽，在后两个载体中则加入了增强子。 2 木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达 以毕赤酵母菌株g s i1 5 为受体菌，采用电击转化法分别将表达载体p g a p h a - x y n 2 、 p g a p r h a - x y n 2 、p g a p h i n u x y n 2 、p g a p h a m x y n 2 、p g a p h a e x y n 2 转化毕赤酵母，获 得毕赤酵母重组转化子。随机挑取转化子，子y p d 培养基中振荡培养7 2 h 后，d n s 法测定 酶活，各重组卣株的酶活依次为9 2i u m l 、1 0 4i u m l 、8 5t u m l 、1 6 8i u m l 、1 2 8 i u m l 。结 果表明，g a p 启动动子能够实现外源基囚的表达，i n u 信号肽和改造后的c 【f a c t o r 信号肽均 能够引导外源蛋白的分泌，增强子能够起到增强g a p 启动子的作用。s d s p a g e 分析表明， 重组术聚糖酶的分子大小约为21 k d a 。 3 重组木聚糖酶酶学性质的研究 将木聚糖酶分别置于不同的温度、p h 、阳离子等条件下，研究木聚糖酶的最适温度、最 适p h 、热稳定性、酸碱稳定性、以及金属离子对木聚糖酶活性的影响。结果表明，木聚糖酶 作用的最适温度为5 0 ( 2 ，最适p h 为5 0 ，热稳定性为6 0 c 以下稳定性较高，以上稳定性很 差，酸碱稳定性为p h 7 以下时稳定性较高，7 以上很差，到9 则失活，金属离子的影响为f e 2 + 、 m 9 2 + 、 z n 2 + 、c u 2 + 、 f e 3 + 对木聚糖酶的酶活力有不同的促进作用，m n 2 + 对木聚糖酶的酶活 力则有抑制作用。 4 毕赤酵母重组菌摇瓶发酵条件的研究 将重组菌g s l l 5 p g a p h a - x y n 2 分别置于不同的条件下培养，探讨p h 、温度、装液量、 东北农业大学理学硕士学位论文 培养时间、t r i t o n 、e d t a 对酶产量的影响，确定适合重组菌摇瓶发酵的条件，为工业化生产 提供依据。结果表明，重组菌在以下的条件下发酵较为理想：初始p h 为5 0 ，培养温度为2 8 。c ， 培养时间为1 2 0 h ，装液量为2 5 0 m l 装7 5 m | ，t r i t o n 添加量为0 0 1 或e d t a 添加量为5 r a m 。 在此条件下，重组菌的发酵酶活可达1 6 5 i u m l 或1 5 3 i u m l 。 5 木聚糖酶的酶解产物分析 用重组木聚糖酶水解木聚糖，采用t l c 法分析酶解产物。实验表明，木聚糖酶的酶解产 物为木二糖和木三糖及少量的木糖。说明重组木聚糖酶适用于低聚木糖的生产。 词木聚糖酶；g a p 启动子：信号肽：发酵条件；酶解产物 n a b s t r a c t x y n 2 f r o mt r i c h o d e r m a r e e s h ii np i c h i ap a s t o r i sa n d a p p l i c a t i o nr e s e a r c h a b s t r a c t x y l a n a s eh y d r o l y z e s1 ，4 - 1 3 - d x y l o s i d eb o n db yi n t e r n a l l yt a n g e n t i n ga n dt h eh y d r o l i z a t i o n p r o d u c t sa r ex y l a na n dh e x - x y l a nm o s t l y t h ep o l y x y l o s ew h i c hc o n t a i n sx y l o h i o s ea n dx y l o t r i o s e a p p l i c a t e df o o d sd o m a i nf o rh e a l t hc a r ea f f e c to fl o w - g r a d ef e v e r 、s t a b i l i t y 、m o i s t u r ea n dp r o p a g a t e b a c i l l u sb i f i d u s t h ep o l y x y l o s ew a sm a d eb ye n z y m i cd e g r a d a t i o n t h ek e yp o i n to fp r o d u c i n g p o l y x y l o s ew a sg a i nm o r ex y l o h i o s ea n dx y l o t r i o s eb u tl e s sx y l o s eb ys c r e e n i n gx y l a n a s ew h i c h h a sh i g h e ra c t i v i t ya n dh i g h e rs u b s 仃a t es p e c i f i c i t y t h et r a d i t i o n a lg a i nx y l a n a s ew h i c hh a sh i g h e r e n d o x y l a n a s ea c t i v i t y b u tl e s s x y l o s i d a s ea c t i v i t yw a ss c r e e n i n gs t r a i na n dc o n t r o l l i n gt h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ，t h er e s u l tw a sd i s s a t i s f a c t o r y t h ee f f e c t i v em e t h o dw a se x p r e s s i n g x y l a n a s eb yg e n e t i ce n g i n e e r i n g i nt h i sp a p e r , b a s i n go np p i c 9 - x y n 2v e c t o r , w ed e s i g na n db u i l dan e wt y p eo fe x p r e s s i v e v e c t o rb yr e p l a c i n ga n dt r a n s f o r m a t i n gt h ep r o m o t e ra n ds i g n a lp e p t i d e ，a n dt h i sw i l l e s t a b l i s ht h e f o u n d a t i o nf o re f f i c i e n t l ye x p l o r en e wm e t h o d so fah i i g h - l e v e le x p r e s s i o ni np i c h i ap a s t o r i s ，t h e n a t u r eo fx y l a n a s ee n z y m e ，a n dt h ec o n d i t i o n so fs h a k e f l a s kf e r m e n t a t i o n ，t h er e s e a r c hc o n t e n t s a n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 v e c t o rc o n s t r u c t i o n b a s i n go np p i c 9 一x y n 2v e c t o r , w ed e s i g na n db u i l dp g a p h a x y n 2 、p g a p r h c t - x y n 2 、 p g a p h i n u x y n 2 、p g a p h c 【m - x y n 2 、p g a p h a e x y n 2b yr e p l a c i n ga n dr e f o r m i n gt h ep r o m o t e r a n ds i g n a lp e p t i d e i nt h i ss e r i e so fv e c t o r s ，x y mw a sr e g u l a t e db yg a pp r o m o t e r , t h ee x p r e s s i o n o fe x o g e n o u sp r o t e i ns e c r e t i o ns i g n a lp e p t i d ew a sa - f a c t o rs i g n a l p e p t i d eo fs a c c h a r o m y e e s c e r e v i s i a e ，i n ua n do p t i m u md e s i g n e ds i g n a lp e p t i d e ，t h e na d de n h a n s e ri nt h el a t t e rt w ov e c t o r 2 e x p r e s s i o no fx y n 2i np i c h i ap a s t o r i s w ec l o n e dp g a p h a - x y n 2 、p g a p r h c t - x y n 2 、p g a p h i n u - x y n 2 、p g a p h a m - x y n 2 、 p g a p h c t e - x y n 2v e c t o r i n t op i c h i a p a s t o r i sb yu s i n ge l e c t r o p o r a t i o n m e t h o da n do b t a i n t r a n s f o r m a n t s 。t r a n s f o r m a n t sw e r ep i c k e dr a n d o m l y ,a n dc u l t u r e di ny p d a f t e rc u l t u r e i n g 7 2 h ，d e t e r m i n a t e d t h e a c t i v i t y o f e n z y m eb yd n s , t h ee n z y m a t i ca c t i v i t y o fd i f f e r e n t r e c o m b i n a t e d s t r a i ni s9 2i u m l 、10 4i u m l 、8 5i u m l 、16 8i u m l 、l2 8 i u m 1 t h er e s u l t ss h o wt h a t 。 g a pp r o m o t e rc a ne x p r e s st h ee x o g e n o u sg e n e ，i n us i g n a lp e p t i d ea n dt h et r a n s f o r m e ds i g n a l p e p t i d e sa r ea b l et og u i d et h es e c r e t i o no ff o r e i g np r o t e i n ，a n dt h ee n h a n c e rc a ns e r v et os t r e n g t h e n t h eg a et h ea n a l y s i so fx y l a n a s e - - s d s - p a g es h o w st h a tt h es i z eo fm o l e c u l a ro fx y l a n a s ei s i i i 东北农业大学理学硕士学位论文 2 l k d a 3 r e s e a c ho f r e c o m b i n a n t ) 哆l a f l a s ec h a r a c t e r x y l a n a s ew e r ep l a c e di nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，p h ，c a t i o na n do t h e rc o n d i t i o n st os t u d yt h a t h o wo p t i m u mt e m p e r a t u r e ，p h ，t h e r m a ls t a b i l i t y , a c i d b a s es t a b i l i t y , m e t a li o n sw o r ko nx y l 舢e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s5 0 ，t h eo p t i m u mp hi s5 0 ，t h e r m a ls t a b i l i t yi s b e t t e rw h e nt e m p e r a t u r ei sb e l o w6 0 ，a c i ds t a b i l i t yi sb e t t e rw h e np hi sb e l o w 7a n di tw i l l d e v i t a l i z ew h e np hi s9 t h e r ei sp r o m o t i n ga f f e c t i o no nt h ea c t i v i t yo fx y l a n a s eb yf e h 、m g + 、 z n 2 + 、c u 2 + 、 f e 3 + ，o nt h eo t h e rh a n d ，i n h i b i t i o no fx y l a n a s eb ym n 2 + 4 r e s e a c ho ff e r m e n t a t i o n a lc o n d i t i o n t h er e c o m b i n a n tb a c t e r i aw e r ec u l t u r e du n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s ，s u c ha sp h ，t e m p e r a t u r e ， l i q u i dv o l u m e ，i n c u b a t i o nt i m e ，t r i t o n ，e d t a ，t of i n das u i t a b l ef e r m e n t a t i v ec o n d i t i o n 。a n dt h i s w i l lp r o v i d eab a s i sf o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a tt h er e c o m b i n a n tb a c t e r i ai sa ta i d e a l l yf e r m e n t a t i v ec o n d i t i o n i nt h e f o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：t h e i n i t i a lp h5 0 ，i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r eo f2 8 ，c u l t u r et i m eo f12 0 h , l i q u i dv o l u m eo f2 5 0 m ll o a d e d7 5 m l 。t r i t o na d d i n g a m o u n to f 0 0 1 ，e d t aa d d i n ga m o u n to f 5 m m 5 a n a l y s i so fe n z y m o l y s i sp r o d u c t t h ee n z y m ep r o d u c to fx y l a n a s ei sa n a l y s e db yt l c t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ee n z y m e p r o d u c t so fx y l a n a s ea lex y l o h i o s e ，x y l o t r i o s ea n da s m a l la m o u n to f x y l o s e k e yw o r d sx y l a n a s e ；g a pp r o m o t e r ；s i g n a lp e p t i d e ；c o n d i t i o no ff e r m e n t a t i o n ；p r o d u c to f e n z y m e i v c a n d i d a t e ：b a ol i j u a n s p e c i a l i t y ：g e n e t i c s s u p e r v i s o r ：l ij i e 引言 1 引言 1 1 研究的目的及意义 木聚糖是主要由吡喃木糖通过1 3 1 ，4 糖苷键连接而成的多聚糖，是半纤维素的主要成 分，广泛存在于植物细胞壁中，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源( t e c h a p u ne ta l ， 2 0 0 3 ) 。木聚糖酶( 1 ，4 - 1 3 一d x y l a nx y l a n o h y d r l a s e ，e c3 2 1 8 ) 通过内切方式水解木聚糖分子 中的d 1 ，4 木糖苷键，水解产物以木二糖和木三糖为主，及少量的木糖和阿拉伯糖( n e e t a e ta