（遗传学专业论文）重组克隆技术中植物启动子分析载体的改进研究.pdf

浙江丈学硕上学位论文 摘要 启动子是d n a 链上可以与r n a 聚合酶特异结合的部位。启动子活性分析 是一种非常重要的研究相关基因功能和时空特异性表达特征的手段。我们首先用 传统的酶切克隆方法，基于p c a m b i a l 3 0 3 载体系统，分析了拟南芥1 2 个基因 的1 7 个不同长度的启动子片断的活性。虽然实验成功的占大多数，但也发现了 很多问题。通过对这些启动子序列和转基因植株染色结果的深入分析后发现：基 因5 端非翻译区、启动子片断长度、启动子自身t a t a 盒和起始因子的位置、以 及转录起始和编码区a t g 之间其它的竞争性a t g 的存在与否，都对能否获得染 色结果起着重要的影响。选择标记基因的增强子也干扰着实验的成功与否和精确 性。另外，转基因植物的株系间差异很大，影响启动子功能的深入研究。 为了进行更加高效的植物启动子分析，我们采用了g a t e w a y 重组克隆体系。 鉴于目前通常认为转基因株系差异主要是因为不同插入位置附近的染色质结构 以及各种激活或抑制信号引起了插入基因的表达异常。而绝缘子作为一种中性屏 障，对防止邻近致密染色质和其它基因结构域或调控信号的影响起着重要的作 用，因而在减少转基因位置效应中的应用也越来越广泛。绝缘子在动物，如小鼠， 兔子和培养细胞系等的转基因中应用已经相当广泛和成熟，但它在植物转基因中 的应用也非常有限。于是我们在g a t 创v a y 植物启动子分析载体中加入了果蝇的绝 缘子序列。结果非常令人振奋，该绝缘子显著减少了拟南芥转基因的株系差异。 另外为了缩短g u s 染色时间提高实验效率我们还在该基础上添加了翻译增强序 列，实验结果也与预期相符。最后，为了消除筛选标记基因的增强子对待分析启 动子的干扰作用，我们在绝缘子上下游加入了不同的报告基因，期望插入一定长 度的d n a 片断能削弱并直观观察筛选标记对下游待分析启动予的干扰。 关键词绝缘子；翻译增强序列；g a t e w a y t e c h n o l o g y t = ：启动子分析 浙江大学硕上学位论文 a b s t r a c t p r o m o t e ri sak i n do fd n ar e g i o no rs e q u e n c et h a tc a nc o m b i n ew i t hr n a p o l y m e r a s ea n do t h e rt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t h ep r o m o t e r - a n a l y s i si sav e r yi m p o r t a n t a n de f f i c i e n tm e t h o du s e di ng e n e sf u n c t i o n - a n a l y s i sa n ds p e c i f i ce x p r e s s i o nr e s e a r c h f i r s tw ec o n s t r u c t e d1 7p r o m o t e r - a n a l y s i sv e c t o r so f1 2d i f f e r e n tg e n ep r o m o t e r s u s i n gt h et r a d i t i o n a lc l o n i n gs y s t e mb a s e do i lr e s t r i c t i o nf i n z y m e sa n dl i g a s e t h o u g h m o s to f t h ec o n s t r u c t i o n ss e 踯lt og e ts u c c e s s f u lr e s u l t s w es t i l lf o u n dl o t so f e x i s t e n t a n dp o t e n t i a lp r o b l e m st h r o u g hd e e pa n a l y s i so ft h e s es e q u e n c e sa n dt r a n s g e n i c m a t e r i a l sg u ss t a i n i n gr e s u l t s t h e5 u n t r a n s l a f i o nr e g i o n , s e g m e n tl e n g t h , e s p e c i a l l y t h et a t ab o xa n dt h ep u t a t i v ea t gb e t w e e nt h en a t i v ea t ga n dt h et r a n s c r i p t i o n s t a r ts i t eh a v ei m p o r t a n ti n f l u e n c e so nt h ef i n a ls u c a t 鼯$ t h e2 x 3 5 sp r o m o t e ro ft h e r e s i s t a n tg a n eu p s t r e a ma l s oi n t e r f e r eo u re x p e r i m e n tr e l i a b i l i t y b e s i d e sw ea l s o f o u n dt h a tt h et r a n s g e n i cl i n e sw e r es od i s t i n c t i v et oe a c ho t h e rt h a ti ti sh a r df o rl l st o g e ta nu n i q u ea n dr e l i a b l er e s u l t n o ww eh a v et r a n s f e r r e dt oan e w c l o n i n gs y s t e mc a l l e dg a t e w a yt e c h n o l o g y 衄 i no r d e rt og e tb e t t e re f f i c i e n tp r o m o t e r - a n a l y s i sv e c t o r s w h e r e a st h ef a c tk n o w ns o f a rt h a tt h et r a n s g e nv a r i a t i o nm a i n l yr a i s e db yt h ed i s t i n c tc h r o m a t i ne n v i r o n m e n t s a n dv a r i o u sa c t i v a t eo ri n h i b i ts i g n a l se s p e c i a l l yt h eh c t e r o c h r o m a t i ns u r r o u n d i n gt h e d i f f e r e n ti n s e r t i o ns i t e s ，l l i l ei n s u l a t e ri sak i n do fd n ab a r r i e re l e m e n tt h a t p o s s e s s e sac o r n s i o na b i l i t yt op r o t e c tg e n e sf r o mi n a p p r o p r i a t es i g n a l se m a n a t i n g f r o mt h e i rs u r r o u n d i n ge n v i r o n m e n t s oi ti sw i d e l yu s e di nt r a n s g e n si no r d e rt o m i n i m i z et h et r a n s g e n i ev a r i a t i o n i nf a c t , i th a sb e e nu s e ds u c c e s s f u l l ya n dw i d e l y i nt r a n s g e n i cm o o s e ，r a b b i ta n dc e l ll i n e s h o w e v e rb e c a u s eo f t b el a t e rb e g i n n i n gi n p l a n ti n s u l a t o rr e s e a r c h , i th a sf e wr e p o r t sa b o u tt h ea p p l i c a t i o n so fi n s u l a t o r si n p l a n tn a n s g e n s i nt h i sp a p e r , w ed i ds u c hap a t h b r e a k i n gw o r kb ya d d i n ga d r o s o p h i l ai n s u l a t o rs e q u e n c et oo u rg a t e w a yp r o m o t e r - a n a l y s i sv * t o r t h er e s u l t s a r ev e r yh e a r t e n i n gt h a tt h i si n s u l a t o rs i g n i f i c a n t l yd e c r e a s et h et r a n s g c nv a r i a t i o ni n t r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sa sw ee x p e c t e da n de v e np r o v o k et h eg u se x p r e s s i o n w e n 浙江大学硕士学位论文 a l s oe o u s t r u c ta n o t h e rn e wv e c t o rb ya d d i n gat r a n s l a t i o nl e a d e rs e q u e n c et ot h e5 o f g u sg e n e t h er e s u l t sa l s om e e to u re x p e e t i o n a n da tl a s tw ec o n s t r u c tt h r e eo t h e r n e wv e c t o r sb yi n s e r t i n g 阳p o ng e n e sf l a n k i n gt h ei n s u l a t o rs e ：q l l e n c e ，h o p i n gt h a t t h ei n s e r t i o ns e g m e n tc a nd e c r e a s es u c hi n t e r f e r e n c e , a n dm e a n w h i l ep r o v i d eu s s o m ei n f o r m a t i o na b o u tt h i si n s u l a t o rf u n c t i o ni n a r a b i d o p s i st h r o u g ht h e f l u o r e s c e n c er e s u l i s k e yw o r d s i n s u l a t o r ；, t r a n s l a t i o nl e a d e r ；g a t e w a yt e e h n o l o g y “；p r o m o t e r - a n a l y s i s 珊 重组克隆技术中植物启动于分析载体的改进研究 第一章绝缘子研究进展：种类丰富，功能繁多，机理多样， 应用广泛 摘要研究发现真核细胞基因组上有一类d n a 序列，它们可归类于一种边 界元件，通常处在基因的侧翼区，作为一种中性屏障，对防止邻近致密染色质和 其它基因结构域或调控信号的影响起着重要的作用，故称之为“绝缘 子”( i n s u l a t o r ) 。随着研究的深入，越来越多的绝缘子和更多重要的功能被发现， 它们在转基因和基因治疗等领域的应用也日益广泛。 关键词绝缘子；m t r ：l c r ；增强子阻遏；位置效应 1 1 目前发现的绝缘子 1 1 1 无脊椎动物绝缘子 早先存在增强予活性抑制元件的证据来自果蝇的两个突变株。第一个是由一 种反转录转座元件g y p s y 插入到黄眼基因附近引起的插入突变( g e y 盯a n dc o r c 懋 1 9 9 2 ) 。黄眼基因受到两个分别位于其启动子5 和3 端的不同组织特异性的增强 子调控。研究发现当g y p s y 插入到启动子上游时则抑制了启动子5 端增强子的活 性，而并不抑制启动予3 端增强子的活性；同样当插入到启动子下游时则结果恰 好相反( d o r s c t t1 9 9 3 ) 。第二个是由于位于双胸复合体( b i t h o r a xc o m p l e x ) 的a b d - b 基因边上的突变引起的。该基因受到一系列副节特异性( p a r a s e g m e n - s p c c i f i c ) 增强 子的调控并参与限定各副节发育的独立性( h a g s t r o m c ta 1 1 9 9 6 ；z h o uc ta 1 1 9 9 6 ， 1 9 9 9 ) 。位于i a b - 7 增强子两侧的向6 7 和向嬲两个元件的任何一个缺失或突变都 会干扰i a b - 7 核蛋白复合体的形成和增强子作用域的独立性并导致彳珏口同源基 因的混乱表达( m i h a l ye ta 1 1 9 9 7 ；b a r g e se ca 1 2 0 0 0 ；g a u o n ie ta 1 1 9 9 3 ) 。遗传学研 究结果证实了，白6 - 7 和，备6 名具有增强子抑制功能，它们保障了i a b - 7 顺式调控作 用域的独立性免受邻近的缸6 j ，a b - 6 等调控元件的影响( m i h a l y e ta 1 1 9 9 8 ) 。 第一个被确认的也是研究得比较详尽的绝缘子是果蝇的一种“特化的染色质 结构”( s p e c i a l i z e dc h r o m a t i ns t r u c t u r e ，简称s c s ，u d v a r d ye ta 1 1 9 8 5 ) 。s o s 绝缘子 重组克隆技术中植物启动子分析载体的改进研究 包括s 和s 馏两种元件，它们分别位于果蝇| | l 印7 d 热体克基因的上下游边界。 k e i l u m 和s c h e d l ( 1 9 9 1 ) 通过实验指出这两个元件具有位置依赖的增强子抑制功 能其分析方法是利用舶妇基因作为报讯基因，将s 元件插在两侧，导入果蝇， 观测所产生的转基因果蝇的颜色变化，用以判断整合在宿主基因组的转基因有无 位置效应。实验结果发现s c s 绝缘子能使转基因不受染色体上整合位置的影响， 其表达水平只与它整合的拷贝数有关。随后又将带有s g s 和s c s 元件的d n a 片断装 配在卵黄蛋白i 增强子和h s p z o 启动子- l a c z 融合基因之问，观察到却7 d 启动子对 l a c z 基因的激活作用完全被抑制。这种抑制活性与s g s 元件的方向无关。当s c s 元 件插在增强子上游，则不出现这种绝缘活性( k e l l u me ta 1 1 9 9 2 ) 。这两个分析方 法已成为基因绝缘子测定的经典之作。在结构上s c s 和s c s 元件两端为d n a 酶- i 超 敏感( i l s 谁【点，中间则是一段d n a 酶。i 不敏感的区域。这些h s 区域对s 璐元件的 绝缘子活性非常重要。若将h s 区缩短，会破坏s 元件的绝缘子活性。但如果将 任何一段h s 区的d n a 片断多聚化，则可完全具有绝缘子的活性。由此可见s 鹤绝 缘子应是由几个重复的d n a 序列所组成，并具有特定的排列，可被一些特定的 d n a 结合蛋白识别。 另一种无脊椎动物海胆的s n s 绝缘子是稍后发现的。海胆组蛋白基因是一类 重复基因家族，每5 个组蛋白基因组成一拷贝的重复单位。在早期组蛋白h 2 a 基因的每套重复单元中，在5 端都含有类似增强子的元件，能调节h 2 a 基因的 转录。在众多的组蛋白基因单元组成的家族内，各转录单元之问彼此紧密相连， 何以不会相互影响，是人们一直感到困惑的。最近发现在海胆早期h 2 a 基因的 3 端存在一段d n a 序列，其中分布有许多h s 位点，能阻断增强子的作用( p a l i a o ta 1 1 9 9 7 ) 。这个绝缘子称为“沉默化的核蛋白结构”，简称s n s 。有趣的是s m 既 无种届特异性，也无增强子的特异性，能在各种人细胞株中抑制s v 4 0 增强子的 活性。 1 1 2 脊椎动物绝缘子 首次鉴定的脊椎动物基因绝缘子是鸡肛珠蛋白基因座位5 端边界序列，称为 c h s 4 ( 或5 h s 4 ) 。在这个基因座位上染色质激活的程度可用d n a 酶i 敏感性和组 蛋白乙酰化程度来判定。在b - 珠蛋白基因座位5 端上游2 0k b 处一段序列，存在一 系列对d n a 酶i 的敏感位点( c h u n ge ta 1 1 9 9 3 ) 。在进行转基因时，通常导入的报 2 重组克隆技术中植物启动子分析载体的改进研究 讯基因在各克隆株之间的表达差异非常大。若报讯基因两端与鸡b 珠蛋白基因绝 缘子相连，再去转小r ( w a n g e ta 1 1 9 9 7 ；p o r t se ta 1 2 0 0 0 ；n o c d ac ta 1 2 0 0 1 ；c i a n a e ta 1 2 0 0 1 ) ，兔子( t a b o i t - d a m e r o ne ta 1 1 9 9 9 ) ，培养细胞系c p i k a a r te ta 1 1 9 9 8 ； i n o u ee ta 1 1 9 9 9 ；e m e r ye ta 1 2 0 0 0 ；r i v e l l a 矗a 1 2 0 0 0 ；s t e i n w a e r d e ra n dl i e b e r 2 0 0 0 ) 等，则报讯基因在所有的克隆株之间表达十分接近。因此可以认为该绝缘 子能减少外源基因整合到基因组上时的位置效应。进一步的研究认为该绝缘子是 通过抑制上游的异染色质活性扩散进入珠蛋白基因座从而起到防止基因沉默的 作用( p r i o l e a ue ta 1 1 9 9 9 ) 。 两栖类动物的基因绝缘子是在南非爪蟾r r n a 基因家族各单元的闯区发现 的，称为重复单元形成体( r e p e a to r g a n i z c f ，简称r o ) 。这一绝缘子也能抑制增强 子( r o b i n e t te ta 1 1 9 9 7 ) ，能有效地将头尾成串相连的r r n a 基因分隔成一个个独立 的转录单元最先发现的人类绝缘子是从t 细胞受体( t c r ) 基因座位中鉴定出的 ( z h o n ge ta 1 1 9 9 7 ) 在t c r 基因座位远端有一长2 k b 的d n a 片断处在v 6 基因和j a 启动子之间，能强烈地抑n e 8 增强子。该片断的抑制活性与所处的位置有密切关 系，而与其自身的方向无关。这一人类的基因绝缘子命名为“阻断元件( b l o c k i n g e l e m e n t ) i t 6 - 1 ”。 1 1 3 绝缘子类边界元件 在此我们还必须提到两种边界元件，一种是核骨架依附区( s c a l f f o l d a t t a c h m e n tr e g i o n ，简称s a r ) 或核基质依附区( m a t r i xa t t a c h m e n tr e g i o n ，简称 m a r ) ( n a b i r o c h k i ne ta 1 1 9 9 8 ；n i c k e r s o ne ta 1 2 0 0 1 ) 还有一种叫做基因座位控制 区( l o c u sc o n t r o ll e g i o n ，简称l c r ，u d v a r d y1 9 9 9 ；l ie ta 1 1 9 9 9 2 0 0 2 ) ，因为相当多 的实验结果说明这两种边界元件和绝缘子元件有着非常密切的关联。核基质依附 区顾名思义就是染色质d n a 上与核基质的结合区域，这些区域通常是染色质上 环状回折结构的边界同时还被认为是一种功能边界，它们在基因的长期调控中有 着重要作用。很多m a r 通常位于增强子附近，比如位于小鼠酪氨酸酶和i g h p 增 强子附近的m a r 元件能促进相关增强子的作用( f o r r e s t e r e ta 1 1 9 9 9 ；p o r t e re ta 1 1 9 9 9 ) 。这些m a r 元件可认为是一种增强子的促进元件。另外一种m a r 贝, j 可归入 典型的绝缘子元件中。如鸡溶菌酶基因座位5 端边界的m a r 区域就具有绝缘子 活性( p h i - v a n a n ds t r a t l i n 9 1 9 8 8 ；s t i e f e ta 1 1 9 8 9 ) 。它在转基因d , 鼠( b o n i f e r e t a l 重组克隆技术中植物启动子分析载体的改进研究 1 9 9 0 , 1 9 9 4 ，1 9 9 6 a ，1 9 9 6 b ；m c k n i g h te ta 1 1 9 9 2 ，1 9 9 6 ) ，培养细胞系( p h i - v a ne ta 1 1 9 9 0 ；p r i o l c a uc ta 1 1 9 9 9 ；z a h n - z a b a lc ta 1 2 0 0 1 ) ，和烟草( m l y n a r o v ac ta 1 1 9 9 4 ) d p 都能减少转基因的位置效应。在人类载脂蛋白b 基因的上游边界中也发现了具有 绝缘子性质的m a r 元件。该边界元件与白眼基因相连后转基因发现白眼基因的 表达不受整合位置的影响( n a m c i ue ta 1 1 9 9 8 ) 。这些结果很大程度上支持了下文 中提到的“结构域边界模型”。在对鸡溶茵酶基因座位5 端边界区域和人类载脂蛋 白b 基因的上游边界区域的进一步剖析研究后发现m a r 区域和绝缘子活性区域 是相互独立的( p h i - v a na n ds t r l i n g1 9 9 6 ；a n t e s e ta 1 2 0 0 1 ) ，但是这并不意味着绝 缘子的染色质成环功能和m a r 的核基质依附功能也是相互独立的，至少以上的 研究并没提供仅靠m a r 自身就能够建立或维持染色质域边界的证据，可见绝缘 子和m a r 元件之间的微妙且复杂的关系还有待更进一步的研究 l c r 以其能够强烈增强附近基因的组织特异性和拷贝数依赖性表达而命名， 它的发现是分子生物学和医学联合研究的新成就。最初在研究地中海贫血症时就 发现其p 珠蛋白基因( 为俩p 型) 的表达严重受损。后来对该基因缺失区域进行染色 质结构分析，查出在该基因5 端存在有5 个组织特异性的d n a 酶i 超敏感位置( 分 别称为h s 1 至h s 5 ，g r o u d i n ec ta 1 1 9 8 3 ；t u a ne ta 1 1 9 8 5 ) 。如果将p 珠蛋白基因 两侧与携带有h s 位点的1 5k b 长的l c r 片断连接，导入细胞后，转基因获得高效 表达这时表达仅与整合的拷贝数有关，而与整合的位置无关( g r o s v e l de ta i 1 9 8 7 ) 。以后陆续发现其它几种l c r ，如人t c r 吖8 受体的l c r ；人t 细胞特异的 c d 2 基因座位也存在l c r ，它由3 个h s 组成，位于基因的3 端；在小鼠”与v p r e b l 两种基因座位中，组成l c r 的h s 多位点遍布基因座位之间和两侧( s a b b a r i n ie ta 1 1 9 9 9 ) 。当一个转基因携带着一个完整的l c r 整合到染色体的异染色质区附近， l c r 能完全保护转基因免受异染色质化( h e t e r o c h r o m a t i n i z a t i o n ) 的抑制作用，因而 不受整合位置的影响( m i l o tc ta 1 1 9 9 6 ) 。其他实验室也都相继证明人c d 2 和 t c r c ( 8 受体的两种l c r 也能使转基因不受整合位置的影响( g r e a v e se ta 1 1 9 8 9 ； o r t i zc ia 1 1 9 9 7 ) 。有一种观点已普遍被人们接受，i l p l c r 中所有的h s 位点必须全 部在一起才能发挥作用。这显然是通过一种所谓的“全复合物( h o l o e o m p l e x ) ”进行 的( u d v a r d y1 9 9 9 ) 。但是类似于m a r ，l c r 的绝缘子功能似乎也能和它的其他功 能相分离，如人弘珠蛋白基因的l c r q a 的h s 2 具有典型的增强子特性，而h s 5 4 重组克降技术中植物启动于分析载体的改进研究 则具有增强子抑制功能( f r a s e ra n dg r o s v c l d1 9 9 8 ；l ie ta l 。1 9 9 9 ；h a r d i s o ne ta 1 1 9 9 7 ) 。l c r 不同于沉默子，启动子等局部调控元件，它能够全局性地调控基因 的表达甚至影响附近的染色质环境。所以推测它的功能绝不单是作为基因的绝缘 子，可能还担负着更为复杂的任务，如协调基因在时空上的表达，即在不同发育 阶段、不同组织细胞，表达不同的基因。 1 1 4 绝缘子的广泛存在 看来绝缘子可能广泛存在于动物界，在酵母也可以见到较典型的绝缘子，比如 位于h m r 区的t r n a 的边界元件能有效保护报道基因免受基因沉默( d o n z e1 9 9 9 ， 2 0 0 1 ) 。在植物界虽然尚未见正式报道，但对动物绝缘子在植物转基因中的研究 应用和对植物m a r 元件的功能研究的结果( m l y n a r o v a e ta l ，1 9 9 4 ) 表明应该也存 在这类元件。这种广泛的存在( 表1 1 ) 暗示着绝缘子应该扮演着一类非常重要的角 色。 表1 - 1 若干发现的绝缘子 重组克隆技术中植物启动子分析载体的改进研究 1 2 绝缘子的功能 1 2 1 绝缘子的增强子阻遏功能 就我们现在所积累的知识，我们大致知道真核生物细胞基因组d n a 大部分都 装在转录上沉默的异染色质内。显然，包裹在致密异染色质内的d n a 受到强烈 的抑制。增强子则是转录的关键调节元件，它们能解除异染色质所造成的抑制。 一定程度上可以认为在异染色质引起的抑制与增强子激活转录能力之间的平衡 决定了真核细胞的基因表达水平( d i l l o na n d s a b b a t t i n i2 0 0 0 ) 。增强子激活启动子 的能力不依赖两者之间的距离和方向，除了一些启动子特异性增强子，实验证实 启动子和增强子之间的特异性非常有限并不足以用来解释增强子作用目标和范 围的有限性。于是有人提出染色质的高级结构将基因组d n a 分隔成拓扑学上压 缩的功能独立的许多环状( l o o p ) 结 构。而正是绝缘子保证了这些区域化 环状结构的独立性，限定了各自结构 内增强子的作用范围和目标以及保 护启动子功能不受其它异常增强子 和激发信号的有害影响f f o r r e s t e re t a 1 1 9 8 6 ；o f l d n1 9 9 0 ；b o n i f e re ta 1 1 9 9 1 ) 。和前文提到的果蝇绝缘子 g y p s y - - 样，绝缘子对增强子活性的 抑制普遍具有位置依赖性( 图1 - la ) ， 即只有当增强子和对应的启动子分 处于绝缘子的上游和下游时，绝缘子 才能抑制其上游增强子对其下游 启动子的激活作用，这个也是增 强子阻遏元件区别于沉默子的重 要特征之一( b c l le ta 1 2 0 0 1 ；w e s te ta 1 2 0 0 2 ) 。同时很多研究还发 现某些绝缘子对增强子的活性抑 制还具有极性( 图1 1b ) ，即依赖自 图1 - 1 绝缘子对增强子阻遏作用的图示( a ) e l 和 e 2 分别为在不同组织细胞q a ( c e u ) 和( c e l l 2 ) 起作用 的增强子，只有当绝缘子处在增强子和它作用的启 动子之间时才起剑阻遏作用。( b ) 两个靠的很近的 绝缘子和增强子表现出极性，只有当绝缘子阻遏 开关复合物采取前一种取向才具有阻遏作用。其中 e 代表增强子，i 代表绝缘子，e s 代表阻遏开关。 6 重组克隆技术中植物启动子分析载体的改进研究 身的序列方向。比如d , r , 毛i g f 2 h 1 9 基因座位的i c r 区域的增强子抑制元件正向比 反向具有更好的功能饵d la n df d s e n f e l d2 0 0 0 ；h a r ke ta 1 2 0 0 0 ) 。更加具有说服力 的例子来自于人类脚j 2 启动子上游的元件( r a r a t ae ta 1 2 0 0 0 ) 。绝缘子的这种极 性行为很有可能受到一种增强子阻遏和阻遏开关的复合绝缘子元件的调控k m i t a c ta 1 2 0 0 0 ) ，当绝缘予阻遏开关复合元件中的阻遏开关与启动子相近时，则绝缘 子的阻遏功能被屏蔽，从而使增强子能激活下游启动子，而采取相反的取向时则 该复合元件具有增强子阻遏活性。 1 2 2 绝缘子的抗基因沉默功能 绝缘子的另一种生物学功能是防止基因受到邻近沉默信号的作用，从而显著 减少转基因的位置效应。这类沉默信号来自细胞核内环境中遍布的大量异染色质 的“扩张”或“溢出”。最近几年，人们对异染色质的认识有了长足的进展，发现一 些生化修饰对于异染色质的形成及扩展起到关键作用。这些修饰主要包括组蛋白 的甲基化、乙酰化和d n a 的甲基化等。组蛋白，尤其是组蛋白h 3 和h 4 的低乙酰 化是异染色质的特征( k o m b e r ga n dl o r c h2 0 0 2 ) 。乙酰化水平的提高几乎总是和转 录水平的提高相关，而乙酰化水平的降低和转录的抑制相关( h e n i k o f f 2 0 0 0 ) 。事 实上研究还发现组蛋白h 3 上l y s 9 的乙酰化能阻l ：l y s 9 的甲基化，反之亦然。于 是有人提出了一种异染色质扩散的“步进”模型( b a n n i s t e re ta 1 2 0 0 1 ；l a c h n e rc ta 1 2 0 0 1 ；n a k a y a m ae ta 1 2 0 0 1 ) 。该模型认为异染色质关联蛋f l ( h p l ) 只有在组蛋白 h 3 的l y s 9 q a 基化时才能结合到组蛋白上，同时它和组蛋白甲基转移酶 ( h m t ) s u v 39 h i 作用使组蛋白h 3 的l y s 9 发生甲基化来提供新的h p i 结合位点从 而实现异染色质的扩散( r e ac ta 1 2 0 0 0 ) 。在对出芽酵母的s i r 2 复合体介导的染色 体沉默过程的研究中也发现了组蛋白去乙酰化是异染色质扩散的必要条件 ( g r u n s t e i n l 9 9 8 ；s u k ae ta 1 2 0 0 1 ；p e r r o dc ta 1 2 0 0 1 ) 。以鸡b 珠蛋白基因绝缘子 c h s 4 为例。该基因上游有一段1 6k b 的富含l y s 9 被甲基化的h 3 的致密染色质区 ( l i a da 1 2 0 0 1 b ) ，而在该绝缘子侧翼的核小体h 3 ，h 4 组蛋白则被乙酰化。由此 认为c h s 4 通过提供了一个组蛋白乙酰化中心终结了异染色质的扩散( l i ac ta 1 2 0 0 1a ，b ) 。而像册垤t r n 腿类异染色质阻碍元件很有可能也像c h s 4 绝缘子一 样通过提供一个组蛋白乙酰化中心来阻止异染色质的扩散( d o n z ea n dk a m a k a k a 2 0 0 1 ) 。果蝇8 c $ 和8 c s 元件也具有防止位置效应的功能( k e l l u ma n ds c h e d l1 9 9 1 ) 。 重组克隆技术中植物启动子分析载体的改进研究 利用果蝇眼色基因进行转基因实验，所产生的转基因果蝇通常眼色极不一致。这 是由于眼色转基因的整合位置不同所致。当在眼色转基因两侧连接s c s 和s c s 序 列，则转基因果蝇眼色趋于一致。说明s c $ 和s 耐元件具有防止转基因发生由整合 位置不同而出现株系表达上明显的差异。这就是所谓的“位置不依赖性”( p o s i t i o n i n d e p e n d e n t ) 。随后的研究证明g 踢砂绝缘子也具有同样的功能( r o s e m a n e ta 1 1 9 9 3 ； l ua n dt o w e r1 9 9 7 ) 。当然并非所有的转基因位置效应都是由异染色质引起的， 插入位置附近的增强子，沉默子等激活或抑制信号也是引起转基因位置效应的一 大原因，所以绝缘子的增强子阻遏功能同样能对抗位置效应。对某一转基因株系 来说，究竟是绝缘子的增强子阻遏功能还是抗沉默功能在对抗位置效应中起着主 要作用一方面决定于绝缘子本身，另一方面很大程度上也决定于转基因的物种和 组织( s u ne ta 1 2 0 0 0 ) 。 1 2 3 绝缘子的转录调控功能 原先的观点认为绝缘子只是作为一种固定的边界元件或被动的中性调节元 件而存在。但越来越多的实验证实很多绝缘子功能可以通过修饰或调谐 ( m o d u l a t i o n ) 作用受到改变从而主动参与了基因的转录调控一些调控因子可以 结合到调控位点或绝缘子蛋白来调控绝缘子活性。比如位于e v e n 础勃，甜基因转 录起始位置上游3 0 b p 的序列具有增强子活性抑制功能，突变实验证实g a g a 绑 定蛋白参与了该绝缘子的功能活性( o h t s u k ia n dl e v i n e1 9 9 8 ) 。也有更直接地通过 甲基化绝缘子蛋白的结合位点来抑制绝缘子活性。如i c r ( i m p r i n t e dc o n t r o lr e g i o n ) 就是通过甲基化失去绝缘子活性从而使其下游的增强子激活i g f - 2 的表达( b e l l a n df e l s e n f e l d2 0 0 0 ；h a r ke ta 1 2 0 0 0 ) 。某些绝缘子序列当靠近启动子时能稳定增 强子启动子之阃的作用，而当远离启动子时则能和启动子相关的增强子通过竞 争作用起到抑制转录的功能( o h t s u k ia n dl e v i n e1 9 9 8 ；g a u s ee ta 1 2 0 0 1 ) 。而对 s y p s y - s u ( h w ) 绝缘子体系的研究也证实绝缘子序列上成簇绑定的高浓度的s u ( h w ) 蛋白可能提供了一个具有高度转录活性的区域( s m i t h a n d c 0 1 淄1 9 9 5 ) 。在对 f a b - 7 和f a b 8 的研究中还发现存在一种启动子靶向序列( 盯s ) 也有调控绝缘子功能 的作用，它能够使它上游的增强子缸6 7 越过廊6 碳活4 b d - b ，这种调控机制一方 面解释t f a b - t f f 【l f a b 8 具有的远距离抑制增强子的功能为何无法在天然的染色体 上观察到，一方面也揭示了这些副节特异性的增强子在适当的时候是怎样越过各 s 重组克隆技术中植物启动于分析载体的改进研究 自得绝缘子而相互渗透作用对方的启动子的( z h o ue t a l 1 9 9 6 1 9 9 9 ) 。 1 2 4 绝缘子功能的多样性 研究结果显示很多染色质高级结构域的边界元件具有增强子抑制功能，这似 乎暗示着反过来某些绝缘子可能既有增强子抑制活性又参与了染色质结构边界 的限定。事实上对螂，5 c $ ，和岫的研究证实了这种推测，很多绝缘子的确具备 双重甚至多重功能。$ c , s , s c s 是已知8 7 a 7 热激基因的边界元件( u d v a r d y e ta 1 1 9 8 5 ) ，一方面具有增强子抑制功能另一方面能保护转基因免受位置效应( k e l l u m a n ds c h e d l1 9 9 1 ，1 9 9 2 ) 。而对矗一的研究结果则更是揭示了染色质高级结构，转录 调控和增强子抑制三种功能之间的紧密关联( v a z q u e za n ds c h e d l2 0 0 0 ) 。更有意思 的是去掉t a t a 元件的c h a i 和t e f 2 u a s 的启动子残片断也有防止异染色质扩散 的功能( b ia n db r o a c h1 9 9 9 ) ，这似乎暗示着绝缘子和启动子也存在着远比想象中 微妙得多的关联。最新的研究发现某些绝缘予还具有激活子和沉默子的作用。比 如g y p s y 绝缘子在果蝇幼虫时期作为一种距离依赖性的启动子顺式激活元件，并 且作用的启动子必需具有g a g a 蛋白结合位点( w e ia n d m a r k 2 0 0 0 。另外在特定 情况下它能选择性地抑制白眼基因表达( c a ia n dl e , v i n e1 9 9 7 ) 。特别需要提到的是 s i c e n c e 上两篇文章中提到的现象，他们指出两个并排的g 婀妙绝缘子并不如想象 中的拥有更强的绝缘子功能，相反出乎意料地丧失了绝缘子功能( c a ia n ds h e n 2 0 0 1 ；m u r a v y o v ae ta 1 2 0 0 1 ) ，更令人惊奇的是另一篇文章指出两个并排的g m 吵 绝缘子还具有反式促进增强子的作用( k r a v c h e n k o e ta 1 2 0 0 5 ) 。这些结果一方面说 明我们对绝缘子功能的认识远远不够，还有待更多的发现，另一方面也为揭示绝 缘子的作用机理和模式提供了极其重要的信息。 1 3 存在的各种模型和假说 自从第一个绝缘子发现至今，曾提出过很多各不相同的机理模型，有些甚至 是相互矛盾的。我们尚难断定哪个模型更加符合实际，或者根本就不存在一个适 合于所有绝缘子的统一模型。但是所有模型假说最后都必须阐明绝缘子位置依赖 的作用特性以及绝缘子在染色体结构和基因表达中所扮演的生化角色这两个基 本问题。下面将介绍几个主要的模型假说。 1 3 1 “跟踪”模型和转录诱捕模型 9 重组克隆技术中植物启动子分析载体的改进研究 用来解释绝缘子的增强子抑制功能的模型假说多半建立在目前已知的增强 子作用机理之上，主要有“跟踪”模型( t r a c k i n g m o d e l ，c h u n g e ta 1 1 9 9 3 ) 和转录 诱捕模型( t r a n s c r i p t i o n d e c o y m o d e l ，g e y e r1 9 9 7 ，图1 2 ) 。以目前仅有的对于增强 子作用机理的认识，可以大致认为增强子对启动子的作用有两种可能途径。一种 途径是在沿着r n a 聚合酶靠近启动子的d n a 序列上存在着一系列转录调控因子， 形成一个辅助转录因子链，它们可能通过招募各种特异性因子和转录基本装置或 直接运送聚合酶到启动子区域来激活转录( w i t t s c h j e b e n e ta 1 1 9 9 9 ；t u a ne t a 1 1 9 9 2 ) 。另外一种途径涉及到一种对染色体结构的改变来减少增强子和启动子 之间的实际效应距离的机制。比如在果蝇中就发现c h i p 蛋白就参与了这种过程， 而s u ( h w ) 绝缘子蛋白就是通过干扰c h i p 作用来干扰增强子作用的。在此就不难 理解“跟踪模型和转录诱捕模型。其中“跟踪”模型认为结合在增强子元件上的 转录因子沿d n a 链向它的目 标启动子追逐，此时绝缘子的 特异结合蛋白在中途阻挡转 录因子，使其不能抵达启动子 区域。转录诱捕模型则认为绝 缘子与其特异结合蛋白结合 所形成的复台物可成为捕捉 增强子的笼子，将增强子复合 物吸引。但是这个模型似乎不 能很好解释绝缘子对增强子 阻遏功能的位置依赖特性。还 有其它一些模型解释增强子 如何被绝缘子阻断，如认为绝 缘予能使增强子偏离正常轨 道，或干扰增强子区域的成环 使其不能接近启动子等，但是 很多都缺乏足够的实验 证据，看来还需要更加深入 _ 结构域边界模型( d o m ab o u n d a r rm a l e l ) ： b 。跟蓐”模型( 。t r a c k i m l m d c l ) ： c 转录诱捕模型( t r m z s c r i p t l a n a im d c l ) ： 图l _ 2 三种主要模型图示其中e 为增强子，矾为绝 缘子，p 为启动子 1 0 重组