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鲮原种群体的遗传多样性评价 鲮原种群体的遗传多样性评价 专业：遗传学 硕士生：朱彩艳 导师：许新萍副教授 摘要 鲮( c i r r h i n u sm o l i t o r e l l a ) ，俗称土鲮、鲮公，属鲤形目( c y p r i n i f o r m e s ) 、 鲤科( c y p r i n i d a e ) 、野鲮亚科( l a b e o n i n a e ) ，是我国南方特有种，两广地区四大家 鱼( 鳙、草、鲢、鲮) 之一。近年来，过度捕捞、增殖放流和人工培育苗种的逃 逸不可避免地影响了鲮的种质。搜集保存鲮野生原种并对其种质特征与遗传背景 进行分析是对其进行种质保护的重要措施。广东省鲮鱼原种场从西江流域肇庆江 段采集并保存了一批鲮野生原种，饲养中发现该批鲮原种存在体色及生长速率差 异。为了解该鲮原种群体的遗传多样性水平，评价其作为原种的遗传性能，我们 在观察其外部形态特征、测量其生长特性的基础上，对其进行了r a p d 分析、 a f l p 分析、s s r 分析及线粒体d - l o o p 区序列测定分析，从核基因组分子标记层 面和母系遗传层面综合考察了该批原种的遗传背景，为西江流域肇庆江段鲮的种 质资源保护提供了基础性资料，将为鲮原种种质的利用提供依据。具体研究成果 如下： 1 鲮原种群体的r a m ) 分析 从鲮原种2 个子群体( h 、q ) 中各取2 4 个个体共4 8 个个体进行r a p d 分析。 2 0 条随机引物扩增共获得了1 7 9 条清晰稳定的条带，其中多态性条带8 2 条，多态 位点百分比为4 5 8 ，子群体h 与子群体q 的多态位点数分别为7 7 和6 6 ，多态位 点百分比分别为4 3 0 2 和3 6 8 7 ；原种群体内遗传距离为o 1 2 3 2 ，遗传多样性 指数为0 1 2 8 1 ，子群体h 与子群体q 的遗传距离分别为0 1 1 5 l 、0 1 0 1 0 ，遗传多样 性指数分别为0 1 2 4 8 、0 1 1 6 4 。该结果表明子群体h 的遗传多样性水平高于子群体q 。 2 鲮原种群体与养殖群体的a f l p 分析 从鲮原种2 个子群体( h 、q ) 中各取2 9 个个体，从3 个不同区域的养殖鲮 群体中共取3 2 个个体( 子群体z s 、p y 、z q ) ，进行a f l p 分析。从2 5 对a f l p 引物组合中选取6 对扩增条带丰富、带型清晰、有差异性条带的a f l p 引物用于 中山大学顺士学位论文朱彩艳 进一步分析。6 对引物共产生1 7 3 条扩增条带，其中多态位点数为7 4 ，多态位点 百分比为4 2 5 。予群体q 、h 、z s 、p y 、z q 的多态位点数分别为6 1 、7 0 、4 8 、 3 5 、4 8 ，多态性位点百分比分别为3 5 1 1 、4 0 4 3 、2 7 6 6 、2 0 2 l 、2 7 6 6 。 在扩增条带中，有一条在子群体h 中的出现频率远远高于其在子群体q 中的出现 频率( 7 2 4 2 0 6 ) ，编号为e 2 m 4 一l 。遗传多样性分析结果表明，鲮原种 群体遗传多样性指数高于养殖群体( 0 1 2 5 4 o 1 1 0 1 ) ：子群体h 的遗传多样性 指数高于子群体q ( 0 1 3 6 7 0 0 9 9 8 ) 。 3 鲮原种群体的s s r 分析 利用4 种鲤科鱼类的1 4 对微卫星引物对鲮基因组d n a 进行p c r 扩增，对扩增 片段的克隆测序发现引物m f w l 、m f w 2 、m f w l 5 、m f w l 7 、c c 7 、c c l l 、b g o r t 2 2 扩增出的产物含有微卫星序列。进一步对鲮的微卫星位点m f w l 、m f w 2 、c c 7 重新设计引物，将其分别命名为c m l 、c m 2 、c m 3 ，新引物对鲮的扩增特异性增 强。采用引物c m l 、c m 2 、c m 3 、c o l l 、m f w l 5 、m f w l 7 、b g o n 2 2 对鲮原种群 体5 9 个个体进行遗传多样性分析。结果表明，引物m f w l 5 、c c l l 无多态性，引 物c m l 、c m 2 、c m 3 、m f w l 7 、b g o n 2 2 在取样群体中扩增图谱带型丰富，随引 物不同，各标记在群体中检测到的等位基因数为2 1 6 个。各微卫星座位的期望杂 合度( h e ) 与观察杂合度( h o ) 范围分别为0 o 9 0 3 8 和0 1 ，平均值分别为0 6 8 8 1 ( 0 1 8 1 9s d ) 和0 7 7 7 2 ( 0 1 9 3 1s d ) 。座位连锁分析显示c m l 与b g o n 2 2 之间存在 显著性水平连锁关系( p 2 0 6 ) b a s e do no u ra f l p d a t a ，w ef o u n dt h a tt h eg e n t i cd i v e r s i t yo fo r i g i n a lp o p u l a t i o nw a sh i g h e rt h a nt h a to f c u l t u r e dp o p u l a t i o n ( 0 1 2 5 4 o 11 0 1 ) ：a n di nt h eo r i g i n a lp o p u l a t i o n t h eg e n e t i c d i v e r s i t yo fs u b s t o c khw a sh i g h e rt h a nt h a to fs u b s t o c kqf 0 13 6 7 o 0 9 9 8 ) 3 g e n e t i cd i v e r s i t ya n a l y s i so fo r i g i n a lp o p u l a t i o no fm u dc a r pb ys s r m e t h o d g e n o m ed n a so fm u dc a r pw e r ea m p l i f i e d b yp c ru s i n g 1 4 p a i r so f m i c r o s a t e l l i t ep r i m e r si s o l a t e df r o mf o u rs p e c i e so fc y p r i n i d a e t h eb a n d sw e r e c l o n e da n dt h e ns e q u e n c e d ，s h o w i n gt h a tt h ep r o d u c t so f p r i m e rp a i r sm f w l ，m f w 2 ， m f w l 5 ，m f w l 7 ，c c 7 ，c c l1a n db g o n 2 2c o n t a i n e dm i c r o s a t e l l i t es e q u e n c e s t h e 鲮原种群体的遗传多样性评价 p r i m e r sf o rl o c im f w l ，m f w 2 ，a n dc c 7w e r er e d e s i g n e da n dn a m e da sc m l ，c m 2 a n dc m 3 ，r e s p e c t i v e l y t h en e wp r i m e r sg a v em o r es p e c i f i ca m p l i f i c a t i o ni nm u d c a r p t h ea p p l i c a b i l i t yo f p r i m e rp a i r sc m l ，c m 2 ，c m 3 ，c c 7 ，m f w l 5 ，m f w l 7a n d b g o n 2 2o nw i l dm u dc a r ps a m p l e sf r o mx i j i a n gr i v e rw a se x p l o r e d ，a n dt h eg e n e t i c d i v e r s i t yo f t h ew i l ds a m p l e sw a sa n a l y z e d i tw a ss h o w e dt h a tt h ed e t e c t e dn u m b e r s o f a l l e l e sw i t h i nt h es a m p l e sf o re a c hp r i m e rp a i rr a n g e df r o m2t o1 6 e x c e p tf o rt h e p r i m e rp a i r sm f w l 5 ，c c l l ，t h ea m p l i f i e dp r o f i l e so f o t h e rf i v e ( c m l ，c m 2 ，c m 3 ， m f w l 7a n db g o n 2 2 ) s h o w e d h i g hp o l y m o r p h i s m t h er a n g e o fo b s e r v e d h e t e r o z y g o s i t i e sa n de x p e c t e dh e t e r o z y g o s i t i e sw e r ef r o m0t o1 ( h o ) a n d0t oo 9 0 3 8 ( h e ) w i t h a l l a v e r a g eo f 0 7 7 7 2 ( s d = 0 1 9 3 1 ) a n do 6 8 8 1 ( s d = o 1 8 1 9 ) r e s p e c t i v e l y s i g n i f i c a n t ( p 0 1 1 0 1 ) 。半个世纪以来，由于 人工繁殖技术的成功，许多重要养殖种类不再是从江河捕捞的野生鱼苗，而是人 工繁育的子一代、子二代甚至更多代。事实上，由于长期的定向选育和不同于野 生生活环境的高密度人工养殖，养殖群体已经产生了不同于野生原种遗传结构的 变异【1 2 6 1 。进行了人工养殖的水域和设施，其中的养殖鱼类都有可能通过各种渠 道逃逸进入野外水域，特别是洪水暴发之年，从水池塘堰和大小湖泊进入野外水 域的养殖鱼类更是不计其数。养殖群体的逃逸已经不可避免的影响了野生资源的 种质【1 2 5 】。因此，应进一步采取措施加大西江流域肇庆江段鲮野生原种的保护和 保存力度，尽量避免养殖群体对原种的基因库造成污染，尽可能完整地保存原种 丰富的基因库。 对鲮原种群体2 个子群体遗传多样性分析表明，子群体h 的遗传多样性水平 高于子群体q ，2 个子群体间的遗传分化较为明显。这一结果与笔者此前采用 r a p d 方法研究的结果一致。 鲮原种群体的遗传多样性评价 鉴于a f l p 标记可以产生高密度的信息位点，因此有可能在表型不同的2 个 鲮原种子群体问筛选出具有群体特异性的分子标记。夏军红等采用a f l p 方法从 3 6 对引物组合中筛选到一对长江江豚性连锁分子标记的引物组合，找到一个与 性别相关的标记性位点【3 踟。本研究从2 5 对引物组合中选取了6 对扩增中显示出 有差异条带的引物组合对该批鲮原种的2 个子群体进行扩增，获得了1 条在子群 体h 中的出现频率绝对高于子群体q 的条带，未获得群体特异性条带。进一步扩 大筛选范围，采用更多引物组合做进一步研究有希望获得2 个子群体间的特异性 分子标记。 。i t 山大学硕= = 学位论文朱彩艳 第5 章鲮微卫星位点的 分离鉴定及鲮原种群体的微卫星分析 5 1 材料 2 0 0 5 年7 月，从广东鲮鱼原种场取子群体q2 9 尾，编号为1 2 9 ，子群体h 3 0 尾，编号为3 0 一5 9 。剪尾鳍保存于9 5 的乙醇中，4h 后更换一次9 5 的乙 醇，保存用于总d n a 的抽提。 5 2 主要仪器及试剂 5 2 1 主要仪器 p c r 仪：b i o m e t r au n o t h e r m o b l o c k 型德国 核酸定量仪：b i o m e t r a 德国 台式高速冷冻离心机：s i g m al a b o r a t o r yc e n t r i f u g e s 3 k 3 0 德国 稳压稳流水平电泳仪：b i or a dp o w e r p a c3 0 0 型德国 垂直电泳仪：b i or a dp o w e r p a c3 0 0 0 型德国 凝胶成像系统：s y n g e n e 德国 数码相机：柯达美国 脱色摇床：z d 8 8 0 1 型广州市正一科技有限公司 恒温水浴锅：h h 一4 型江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 生化培养箱：s p x 型智能生化培养箱宁波江南仪器厂 无菌超净操作台：苏州净化设备有限公司 立式自动电热压力蒸汽灭菌器：l d 2 x 一4 0 c i 型上海申安医疗器械厂 台式恒温空气浴摇床：t h z c 型太仓市华美生化仪器厂 电热恒温干燥箱：g z x d h 型上海铁通医疗器械厂 微量有机分析专用超纯水机：颐洋企业发展有限公司 电子秤：a l 2 0 4 型m e t t l e rt o l e d o 公司 通风柜：深圳市利龙湖实业有限公司 5 2 2 主要试剂 5 2 2 1d n a 提取试剂 同3 2 2 1 5 2 2 2 琼脂糖凝胶电泳试剂 同3 2 2 2 鲼原种群体的遗传多样性评价 5 2 2 3p e r 反应试剂 e x t a qd n a e o l y m e r a s e 含d n t p m i x t u r e 套装：t a k a r a 公司生产。 微卫星引物：由博亚生物工程公司合成。 t 4 。d n a 连接酶：t a k a r a 公司生产。 5 2 2 4 微卫星片段克隆试剂 ( 1 ) 液体l b 培养基 胰蛋白胨1 0g ，酵母提取物5g ，n a c i5g ，加双蒸水至1 0 0 0 m l ，调p h7 4 ， 灭菌。 ( 2 ) 固体l b 培养基 在液体l b 基础上添加入1 3 1 5 琼脂粉，灭菌后，待培养基降温至 5 0 6 0 。c 后，加入抗生素( 一般为5 0m g m l a m p ，临用时按lul i n l 加入培 养基) 倒平板。 ( 3 ) x - g a l 储存液( 2 0 m g m l ) x g a l0 2g ，二甲基甲酰胺1 0m l ，装于玻璃或聚苯烯管中锡纸包裹，2 0 。c 保存。 ( 4 ) i p t g 溶液( 2 0 0m g m l ) i p t g 2 9 溶于8 m l 水，定容至1 0 m l ，分装，- 2 0 保存。 ( 5 ) a m p 储存液( 5 0m g m l ) 用无菌水配制。 ( 6 ) p c r 产物纯化试剂盒：杭州维特洁公司生产。 5 2 2 5p a g e 胶电泳试剂 同4 2 2 4 5 2 2 6 银染试剂 同4 2 2 5 其余试剂除特别注明外均为国产分析纯。 5 3 方法 5 3 1 基因组d n a 的提取 同3 3 1 s 3 2d n a 标准化 同3 3 - 2 山大学硕十学位论文来彩艳 5 3 3 微卫星引物的来源 选取鲤科鱼类已发表的微卫星引物序列1 4 对( 见表5 - 1 ) ，委托上海博亚生 物技术公司合成，引物稀释成1 0p m 备用。 表s - l 实验所用微卫星引物 t a b 5 - 1m i c r o s a t e n i t ep r i m e r su s e di nt h es t u d y 物种s p e c i e s 微卫星座位m i c r o s a t e l l i t el o c u s 鲤c y p r i n u sc a r p i o 喀拉囱巴c a t l ac a r l a 隹巴b a r b u sb a r b u s 高背四须鲤 b a r b o d e sg o n i o n o t u s m f w l 、m f w 2 、m f w 9 、m f w l l 、 m f w l 5 、m f w l 7 、m f w 2 4 1 1 3 9 i c c 7 、c c i l 、g 1 、c 3 1 1 4 0 1 b a r b 5 4 1 1 4 1 i b g o n l7 、b g o n 2 2 【6 9 l 5 3 4p c r 扩增及检测 反应总体积2 0 皿，其中1 0 x7 幻b u f f e r2 止，r t a qp o l y m e r a s e ( 5u 此) o 1b l d n t p s ( 2 5 m m e a c h ) 0 5p l ，正反向引物( 1 0 p m ) 各2 皿，模板d n a 5r t l ( 2 5 0 n g ) ，d d h 2 08 4 l a l 。扩增条件为：9 4 预变性3 m i n 后，再进行p c r 循环，循环参数为：9 4 变性3 0s ，各引物最适退火温度下退火3 0s ，7 2 延 伸3 0s ，循环4 0 次，最后7 2 充分延伸7 m i n 。 p c r 产物经1 5 琼脂糖凝胶水平电泳检测后，通过6 0 变性p a g e 电泳 分离，银染技术检测( p r o m e g a 公司产品说明书) 。应用软件l a b i m a g e ( v e r 2 6 ，b y k a p e l a n ，h t t p ：w w w 1 a b i m a g e d e ) 相对于分子量标记1 0 0b p d n a l a d d e r 确定等位 基凶大小。每个微卫星座位至少被重扩一次以保证结果的准确性。 5 3 5p c r 产物回收 为了验证筛选得到的微卫星引物在鲮原种群体中的p c r 扩增产物中是否含 有微卫星重复序列，对部分引物的p c r 扩增产物经1 5 琼脂糖凝胶胶分离后， 用刀片挖取目的片段，采用琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒纯化。 鲮原种群体的遗传多样性评价 5 3 6 克隆与测序 5 3 6 1 感受态细胞的制备及p c r 产物的连接与转化 ( 1 ) 感受态细胞的制各 取冻存菌液5 0 此，加入2 0 0 此l b 中，1 5 0r p m m i n 约2h 后，将其分为4 管，每管加lm ll b ，继续摇约3h ，将菌液冰浴1 0r a i n ，于4 以4 0 0 0r p m 离 心1 0r a i n ，干超净工作台上去上清，并加入3 0 0 儿o 1 m e a c h ，轻轻悬浮后， 4 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，于超净工作台上弃上清，加入5 0 0l a l 新鲜冰冷0 1m c a c h ；悬浮后冰浴3 0m i n 后，4 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，于超净工作台上弃上清， 加入1 0 0i t l 新鲜冰冷0 1mc a c h 。保存：4 水浴可保存一周。 ( 2 ) 连接 纯化p c r 产物l o 一5 0n g ，t 4d n a 连接酶2 3w e i s su n i t s ，1 0 连接缓冲 液l 此，补超纯水至总体积1 0 皿，1 6 过夜。 ( 3 ) 转化 将5 0 止感受态细胞j m l 0 1 于冰浴上解冻。每管感受态加入4 1 0 灿连接产 物，冰浴3 0m i n ，4 2 热激9 0s ，冰浴3 5m i n ，加入4 0 0 止预冷的l b ( 不加 抗生素) ，3 7 ，1 2 5r p m 摇4 5 6 0 m i n 。离心，弃部分上清后取7 0 2 0 0 此菌 液在l b 固体培养基( + a m p i p t g x g a l ) 上涂布平板，自然干燥5 1 0r a i n 。置 3 7 ，倒置培养过夜( 1 2 1 6h 1 后挑克隆。 ( 4 ) 鉴定 挑白色菌落，接种到液体l b ( 含抗生素) ，培养至对数晚期。以2 此菌液作 为模板进行p c r 扩增进一步鉴定。 ( 5 ) 送样与测序 提供1 0 0 乩以上新鲜菌液，交由联合基因生物工程公司进行测序。 5 3 7 鲮原种群体微卫星扩增产物的电泳分析 同4 3 3 2 4 3 3 4 5 3 8 数据分析 采用p o p g e n e ( v e r s i o n3 1 ) 1 3 1 】软件进行数据处理，计算遗传杂合度等参数 并采用g e n p o p 软件( v e r s i o n3 4 ) 1 4 2 1 进行哈迪温伯格平衡检测及座位连 山大学颂十学位论文朱彩艳 锁分析，其中重复取样次数为1 0 0 0 次。采用l a b i m a g e 软件( v e r s i o n2 6 ， h t t p ：w w w 1 a b i m a g e d e ) 估算各微卫星等位基因的分子量大小。 5 4 结果 5 4 1 微卫星引物的筛选及鲮微卫星位点的鉴定 本研究首先利用1 个鲮基因组总d n a 样本对4 种鲤科鱼类共1 4 对微卫星 引物( 见表5 一1 ) 进行了p c r 筛选。琼脂糖凝胶电泳分析显示除引物m f w 9 、 m f w 2 4 、g 1 无扩增产物外，其余】1 对微卫星引物均有1 3 条清晰明亮的条带。 将所有扩增产物大小在1 0 0 3 0 0b p 的片段进行克隆测序，发现引物m f w l 、 m f w 2 、m f w l 5 、m f w l 7 、c c 7 、c c l l 、b g o r d 2 对鲮基因组的扩增产物中含有 微卫星序列，测序获得的序列见附录3 ，其重复序列、大小及最佳退火温度见 表5 2 。 表5 - 2 鲮微卫星座位的序列、大小及最佳退火温度 t a b 5 - 2t h es e q u e n c e ，s i z ea n do p t i m u ma n n e a lt e m p e r a t u r eo f t h em i e r u s a t e l l i t el o c u s 5 4 2 微卫星引物的改良 由于采用其他鱼种适用的微卫星引物对鲮基因组d n a 进行p c r 扩增，扩增产物 中有非目标带，引物特异性不强，所以为了得到合适的鲮基因组微卫星p c r 扩增引 物，本研究进步根据以上测序结果，重新设计了位点m f w l 、m f w 2 、c c 7 在鲮中 的引物序列，分别命名为c m l 、c m 2 、c m 3 。使用新引物对鲮基因组d n a 进行p c r 扩增，发现3 对新设计微卫星引物扩增产物中杂带减少，特异性明显增强( 见图5 1 ) 。 新引物序列及其适用退火温度见表5 3 。 鲮原种群体的遗传多样性评价 表5 - 33 对新引物的序列及最佳退火温