（遗传学专业论文）鲸类actin基因内元和鲚属线粒体dna序列变异分析.pdf

i 类a c t i 莲医内元和鲚属线粒体d 黻痒藏变异分析 顾舒荣 枣京师范大学生命移学学院遗捷资源磷究爨，露衷2 1 0 0 9 7 摘要 引用b a k e r 等已发表的核脱动鬣白( a c t i n ) 蒺因的内元( i n t m n ) 引镌，使用 p c r 技术扩增了江豚纛个不同地理种群及其它部分鲸类核a c t i n 赭因内元序列江 豚援端妇麓因内元彦列变异煞分据黢示，江驱穆爨蠹郊翦遗传多襻性摄低；纛个不 同种群乏闯的分析绪粜表明江豚的长波种群和黄海种群具有较邋的亲缘关系，i 酊和 南海种群的亲缘关系较远，推测在妖江和黄海之间发生过种群的迁移行为缩合 g e n b a n k 检索褥到鲍耱荚寒残，共德戮鲸类6 辩1 7 耪2 2 今个体熬a c t i n 基爨i n t m n 序列，分析表骥f 霹科物种一般聚为单系，支持淡水豚的非单系麓生的观点。分析还 提示喙鲸国须鲸类的弓汰鲸具有较逝的亲缘关系。 弱瘸鼗攫蘩物逶用葶 携扩璞了鲮瓣餐分令髂瓣线粒傣d n a 嚣1 2 sl 黜醴蒸毽、 1 6 sr r n a 蔟因和细胞色素b ( c y t b ) 旗因序列，结合下载的部分鲚属个体的嗣源序 列进行分析比对，结果液明鲚属各种种内的遗传多样性水平极低分析支持太湖湖 蘩彝刀鲮逶没骞选裂嚣分薤势瓣囊发；分耩还支挎黢颁鲮纛刀翳失翳一匏饕戆滋熹。 鲚属中七熬鲚与其余种的遗传差异最火，风鲚和太湖湖鲚种内的遗传多样性稍商 关键词；敬豚，鲸类，a c t i n 基因内党，鲚晨，线糨体d n a ，系统发生 v a r i a b i l i t yo ft h en u c l e a r a c t i ni n t r o no fc e t a c e a n s a n d m i t o c h o n d r i a id n ao fc o 姐i a s h u - r o n gg n l m t i t m e o f g e n e t i c r e s e m c e s , c o l l e g e o f l i f e s c 耙- u c e s , h a n j i a g n m m a i u n i v e r s i t y , m n j i n g 2 1 0 0 9 7 c h i m p r i m e r sf o ra m p 龋t i n gt h eo e t a c e a na c t i ni n t r o ns e q u e n c e sw e r ec o m ef r o mb a k e re t c w i t ht h e s ep r i m e r s , t h ep a r t i a la c t i ni u t m ns e q u e n c e s 缱f i n l e s sp o r p o i s e s ( n e o p h o c a e n a p h o c a e n o i d e s ) c o l l e c t e df r o mc h i n 粼w a t e r sa n do t h e rc e t a c e a n sw a m p l i f i e db y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n0 c r t h er e s u l t ss u g g e s t e d 鑫v e r yl o wl e v e lo fs e q u e n c e v a r i a t i o na tf i n l e s sp o r p o i s ea c t i ni n t r o ns e q u e n c e s ；t h e s er e s u l t sa l s os u g g e s t e dt h et w o s 珏b s p e c i e s 蠹髓y e l l o ws e aa n dt h ey a n g t z er i v e rh a d 鑫r e l a t i v e l yc 耗瞎嚣a f f i n i t y t h e s u b s p e c i e sf r o ms o u t hc h i l l as e aw i t ht h et w os u b s p e c i e sh a dar e l a t i v e l yf l e r t h c l a f f i n i t y t h i ss u g g e s t e df i a l e s sp o q o i s e sf r o my e l l o ws e aa n dt h ey a n g t z er i v e rh a dam i g a r a t i o n i nt h e h i s t o r y i nc o m b i n a t i o nw i t hs o m er e l e v a n ts e q u e n c e sf r o mg e n b a n k , 2 2 i n d i v i d u a l so fc e t a c e a n si n c l u d i n g1 78 p e a ：i f so f s i xf a m i h e sw c r ei n c l u d e di nt h ep r e s e n t a n a l y s i s t h ep h y l o g e n e f i cr e c o n s w a c t i o ns u p p o r t e dt h a ts p e c i e sf r o mt h es a m ef a m i l y c o n s t i t u t e dr e s p e c l i v em o n o p h y e f i cg r o u p s , a n dp r o p o s e dt h en o n - n 持n o p h y l e t i c 撕g l 鑫o f f i v e rd o l p h i n s t h er e s u l t sa l s os u g g e s t e db e a k e dw h a l e s ( z i p h i i d a e ) a n db o w h e a dw h a l e ( b a l a e n am y s 觑t u s ) h a dar e l a t i v e l yc l o s e ra f f i n i t y w i t ht h eu n i v e r s a lp l i m e 辩o fv e r t e b r a t e , t h e 弘i m 破t h r e em t d n ag e n e ( 1 2 sr r n a g e u e , 1 6 sr r n ag e n ea n d 铹bg e n e ) s e q u e n c e so fc o i l i s 螂。a m p l i f i e db yu s i n g p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 嗍i nc o m b i n a t i o n1 j i ，i t l is o m er e l e v a n ts e q u e n c e sf r o m g a n n a n g , t h es e q u e n c e sv a r i a t i o na n a l y s ms u g g e s t e d 鑫v e r yl o wl e v e la tc o i h am t d n a s e q u e n c e s t h ea n a l y s i ss u p p o s e dt h ev i e wt h a tt h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nc o i l i ae c t e n e s t a i h u e n s i sa n dc o a d 瓤豁h a v en o tr i s e n 垂ds i l b s p e 豳l e v e lt h ea n a l y s i s 籼 s u p p o r t e dt h ev i e wt h a tc o i l i ab r a c h y g n a t h u sa n dc o i l i ae c t e n 黜a r et h es a m es p e c i e s c o i l ag r a y f lw i t ht h e 妇s p 翻嚣o fc o i l i ah a dar e l a t i v e l yf u r t h e ra f f i n i t y c o o - as r a y u 嚣 a n dc o i l i ae c t e n e st a i t m e n s i jh a d h i g h e rg e n e t i cd i v e r s i t y k e y w o r d s ：f m l e s sp o r p o l s e s , c e t a c e a n s ，a c t i ni n t r o n , c o i l i a , m t d n a , p h y l o g e n y h i 论文独创性声明 本人郑重声明： l 、坚持以“求实创新一的科学精神从事研究工作。 2 ，本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成 果。 3 本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经 发表或撰写过的研究成果 s 、其他同志对本研究所傲的贡献均已在论文中作了声明并表示了 谢意。 作者签名：叠鲢 日 期：垒q ：兰：2 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留，使用学位论文的规定学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版 和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入 学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有 权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在解密后适用本 规定 作者签名：垒签整 日 期：兰9 ：三：塾 第一章鲸类分子系统学研究中不同遗传标记的应用概述 引言 自上世纪年代以来，随着分子生物学的迅猛发展，涌现出一批分子进化和种群 遗传分析方法和技术。如同工酶( a l l o z y m e s ) 分析、分子杂交( m o l e c u l a r h y b i i d i z a f i o n ) 、限制性片段长度多态性( r i s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， r p l p ) 等。而聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技术的诞生则给 分子生物学及其相关学科带来了一场革命以p c r 技术为基础，发展出随机扩增多 态d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o y m o q ) h i cd n a ，r a p d ) 、扩增片段长度多态性 ( a m p l i f i e d 打a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) ，微卫星( m i c r o s a t e u i t e ，m s ) 等分析方法和技术这些方法和技术与传统方法相比具有一些独特的优势，因而很 快便在生物学各个领域特别是种群遗传研究中得到广泛应用随着不同研究领域的 交叉和渗透，它们很快被引入到鲸类学的有关研究中通过分析某一基因片段序列， 如线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i a l d n a 。m t d n a ) 控制区( m i t o c h o n d r i a l c o n o lr e g i o n ) 、 细胞色素b ( c y t o c h r o m eb ，c y t6 ) 、核基因( 如核肌动蛋白基因，a c t i ng e n e ) 等来 研究鲸类的遗传变异、种群结构和系统发育等( 杨光，周开亚，1 9 9 7 ；r o s e l le ta 1 ， 1 9 9 9 ；m a l i k e t a l ，2 0 0 0 ；d a l e b o u t e t a l 2 0 0 1 ；y a n g ge t a l ，2 0 0 2 ；a i l l a s o n e t a l 1 9 9 4 ；b a k e r e t a l ，1 9 9 8 ；m i l i n k o v i t c h ，1 9 9 7 ) 此外，r a p d 、a f l p 、r f l p 、 d n a 指纹图谱技术( d n af i n g e r p r i n t i n g ，d n a f p ) 等也在鲸类学有关研究中得到 了广泛应用分子标记技术的产生和发展，为鲸类的研究和保护带来了前所未有的 广阔前景 技术手段多种多样，但在选择遗传标记时，则还是蛋白质、线粒体d n a 和核d n a 这三种不过在鲸类研究中几种遗传标记中运用线粒体d n a 标记较多，而用核d n a 标记的相对较少线粒体基因由于具有母系遗传、进化较快及易于分离等特点，在 鲸类系统进化研究中得到广泛应用；同时人们也注意到核遗传信息十分丰富，因而 也渐渐在鲸类系统学研究中得到应用。由于几种遗传标记在单独使用时都有自身的 相对局限性，所以近来有许多研究更倾向与将几种遗传标记结合在一起使用，并将 不同遗传标记的分析结果加以比较和相互印证，以期获得更为客观的分析结果。 等位酶( a l l o z y m e ) 属于蛋白质，可以说是种群水平的研究中最早使用的分子标 记在对等位酶等蛋白质的多态性进行评价时，要注意区别差异是由于遗传变异还 是由其他因素引起的，此外有些蛋白质成分不一定是基因的直接产物( m a r k e t e t a l ， 1 9 5 9 ) 基于此，在鲸类的分子系统学研究中用蛋白质作为遗传标记的并不多见 本文主要介绍鲸类的分子系统学研究中，线粒体d 1 峨和核d n a 标记的应用及两者结 合使用的概况 1 线粒体埘叮a m t d n a 用作分子标记有其多方面的优点，如分子结构简单( b i b b e t a l ，1 9 8 1 ) 、 严格的母系遗传( o y h e n s t e n e t a l ，1 9 8 5 ) 、无重组( c a n e t a l ，1 9 8 7 ) 、与核基 因组无共同序列( b e a l e 甜a 1 ，1 9 8 4 ) 、进化速率快( v a w t e r e t a l ，1 9 8 6 ) 、多拷 贝( b e a l e d a l ，1 9 8 4 ) 等。因此，m t d n a 分析方法一经使用，便迅速渗入传统的 分类、系统进化、群体遗传及人类学等研究领域，并逐步取代了以往以分析蛋白质 特性为基础的同工酶和免疫学实验方法，成为目前这些学科重要的研究工具由于 技术条件的限制，早期应用m t d n a 的工作主要是对m t d n a 进行限制性片段长度多 态( r f l f ) 分析，自从聚合酶链式反应( p c r ) 技术出现以及d n a 序列测定技术推 广以来，使得对m t d n a 的分析更加简便，特别是非损伤性d n a 分析技术的建立克服 了以往取样的困难 m t d n a 的d 1 0 0 p 调控区为非编码序列，所以在鲸类的进化过程中经受的选择 压力较小，其变异位点较为丰富，因此常披作为鲸类分子系统学研究的分子标记 除了d l o o p 调控区外，线粒体基因组中的1 2 sr d n a 、1 0 sr 吒a 等螺n a 基因、细胞 色素6 ( c y t6 ) 和n d 4 ( n a d h 脱氢酶亚基4 ) 等蛋白质编码基因也常被选作分子 标记( y u e t a l ，2 0 0 0 ；n a g a t a e t a l ，1 9 9 5 ) 其中以c y t 6 基因的应用较为广泛 1 1 非编码的线粒体d n a 控制区 m t d n a 控制区在鲸类研究中得到广泛应用( b a k e r e ta l ，1 9 9 3 ；w a l t o n ，1 9 9 7 ； y a n go 甜a 1 ，2 0 0 2 ) ，主要是因为其具有快速进化，高度变异和母系遗传的特点 m t d n a 控制区的序列变异分析可用于现生鲸类两大类型的系统发生关系的探讨 h o e l z e l 等( 1 9 9 1 ) 曾比较了齿鲸类和须鲸类的m t d n a 控制区( c o n t r o lr e g i o n ) 序 2 裂，发瑗了凌鲸亚嚣( o d o n t o c e t i ) 窝须鲸亚鑫( 鹣拶瞳o c 畦) 乏麓畜着较褒鹣窿舞 相似性。从而暗示了现嫩鲸类的单系起源 m t d n a 控制区的序歹i j 变异分柝还被用于科内的分子系统发生研究s i z o b 等 ( 1 9 9 6 ) 滚进对线粒俸d n a 挖翻嚣豹分耩把缳繇辩豹b 。e d c n i 糕分隽个体较夺熬枣 布氏鲸( b e d e n i ) 与个体较大的布氏鲸( 置b r y d e i ) ，但两者并不组成单系关于海 豚科的分子系统发生，最系统的研究怒l e d u c 等( 1 9 9 9 ) 的工作。l e d u c 等遄过灏 定纛分凝海稼释拜个袋豹3 3 令蘩耱耱m t d n a 撩裁区垒彦翻，瓣海骡鬟静系统学 关系提出丁修改意见避些修改意见舷要包括；把虎鲸属o r c 跏u s 从g l o b i c e p h a l i n a e 亚科中独积出来，成立虎鲸亚科o r c h l i n a e ，褥把灰海豚属g r a m p u s 震予 g l o b i c e p h a l _ i n a e 下；愁簸臻海骡覆l a g e n o r h y n c h u s 麸海躲委辩d e l p h i n i n a e 巾去豫， 而把驼海豚属s o u s a ( 以前置于s t e n o n i n a e ) 置于海豚亚科下l a g e n o d o , n c h u s 是一 个多系的( p o l y p h y l e t i c ) 属，其中厶a l b i r o s t r s 与厶4 c l l t 淞以及同属的其它种之阃 没骞壹接瓣紊缘关系，瘛恕a c t m t i 5 置予s a g m a t i a s 演孛。短渤海嚣震翡箕家毒拿 种与l i s s o d e l p h i s 和c e p h a l o r h y n c h u s 属关系较近上述3 个麟获同组成修订过的 l i s s o d d p h m i n a e 亚科程海豚亚科，冀海豚属d e l p h i n u s 的两个种，原海豚属s t e n e l l a 豹sc 瓣, n e ，f w n t a u s ，$ c o e r u l e o a l b a ，致及簸蠢海嚣豹a d u n c u 鍪( 毒溉蠢海豚) 以较高的自引导值组成一支如果接受这一竞燎一个单系的话，那么就得接受 s t e n e l l a 和t u r s i o p s 属都是多系的。不过，这些结论仍需要得到黑多的基因数搬和更 深入懿形态学支寒分援豹支持。 m t d n a 控制区的炎异分析还更多用于鲸类种群水平的研究中。y a n g 等( 2 0 0 2 ) 通过m t d n a 控制区序列分析，发现中国水域江豚总体的种群结构水平较高，但这 箨嫠擒圭簧遗瑗在寿潜秘群专长江释湃及褰海秘爨奄黄海静群之溺，嚣长茳耱群每 黄海种群之间的结构水平较低，提永长江种群与黄海种群之间w 熊存在某种稷度的 迁移和基因流。另一个侧予是关于糕鼻海豚( t u r s i o p s ) 的研究。长期以来，瓶鼻 海骣戆努类在整赛蔻嚣疼存在广泛豹参议。焦熹在警zl ，w n c a t u $ 豹秀令形态滋熬底 是两个独_ 妲的种，还魑同一物种下的两个亚种或地理种群( r o s se ta 1 ，1 9 9 0 ) 但 从w a n g 等( 1 9 9 9 ) 发现了中国水域瓶鼻海豚的t r u n c a t s 型和a d u n c u s 型在m t d n a 控裁嚣黟瓣之溺显萋嚣稳定戆差舅鬣，有关t u r s i o p s 惫括嚣令耪瓣争议君鏊零鹰一 3 段落 1 2 线粒体d n a 的c y t b 基因等编码序列 1 2 1c y t b 基因 c y t b 基因也被用于现生鲸类两大类型的系统发生关系的探讨在鲸类的不同 类群中，抹香鲸( p h y s e t e rm a c 龇p h a l 惜) 与其它类群的关系始终是一个充满争议 的焦点虽然传统的分类学观点将抹香鲸置于齿鲸亚目下，但自从m i l i n k o v i t c h 等 提出抹香鲸( 抹香鲸科p h y s e t e r i d a e 和小抹香鲸科k o g i i d a c ) 与须鲸类的关系更近 的观点以后，引发较大的争议a m a , n 和g u l l b e r g ( 1 9 9 6 ) 通过所有鲸类科级阶元 的线粒体d n a 的c y tb 基因全序列分析，把现生鲸类划分为5 个主要的支系，分别 是须鲸类，恒河豚科( p l a t a n i s t i d a e ) ，抹香鲸类，喙鲸类，及海豚类( 海豚总科 ( d e l p h i n o i d e a ) + 亚河豚( 1 n i ag e o 栅i s ) + 弗氏海豚( p o n t o p o r i ab l a i n v i u e i ) ) ， 并不支持抹香鲸和须鲸类之间较近的亲缘关系 印b 基因还被用于淡水豚类的系统发生分析研究。杨光和周开亚( 1 9 9 9 ) 首次 在淡水豚类的系统发生分析中包括了淡水豚类的所有现生种类，根据3 0 7 b p 的 m t d n ac y tb 基因的部分序列的研究结果提示，恒河豚( p l a t a n i s t a ) 最早从淡水豚 类中分化出来但另外3 个属组成一个单系则与后来的大多数分子系统发生分析结 果不一致。y a n g 等后来( 2 0 0 2 ) 基于m t d n a c y tb 基因全序列的系统发生分析结果 与h a m i l t o n 等( 2 0 0 1 ) 和c a s s e n s 等( 2 0 0 0 ) 的结果基本一致，也支持淡水豚类是 非单系发生的。同时，y a n g 等的研究还专门讨论了淡水豚类科及总科级阶元的划分， 特别是为白爨豚科的成立提供了分子水平的证据 1 2 2 其他线粒体d n a 编码基因 杨光等( 2 0 ) 通过对淡水豚类的1 2 sr r n a 基因的序列变异进行研究，发现 淡水豚类的4 个代表属【白黑豚( l i p o t e j ) ，恒河豚( p l a t a n i s t a ) 、弗西豚( p o n t o p o r i a ) 和亚河豚( i n i a ) 】m t d n a1 2 sr r n a 基因的序列差异水平，高于其他齿鲸类科问的 差异，特别是远远高于海豚总科内的科问差异。研究结果支持它们应归属于不同的 科，即白爨豚科( l i p o t i i d a e ) 、恒河豚科( p l a t a n i s t i d a e ) 、弗西豚科( p o n t o p o r i d a e ) 和亚河豚科( i n i i d a e ) 。恒河豚科是鲸类中最早分化出来的独立支系，而其余3 个淡 水豚科组成一个单系，作为海豚总科的姊妹群。淡水豚类的发生是多系的但对白 4 鬃豚科、亚河豚科和弗西豚科是否隶属于同一总科并未做出结论 在随后( 杨光等，2 0 0 0 ) 对淡水豚类的m t d n a1 6 sr r n a 基因序列变异分析中， 同样支持将现生淡水豚4 个属归入不同的科，系统发生分析显示淡水豚类由白爨豚 + 恒河豚和弗西豚+ 亚河豚两个单系组成，但两个单系之间并无姊妹关系，提出淡 水豚类是并系发生的这与他们使用其他m t d n 分子标记所得出的结果基本相同。 但他们也发现1 6 sr r n a 基因的系统发生树与m t d n a 细胞色素6 基因和1 2 sr r n a 基因的系统发生树并不完全一致，认为这种差异一方面可能反映了不同的基因树间 的差异，也可能与分析的1 6 sr r n a 基因片段中变异位点数和简约信息位点数较少 有关 1 3 几种m t d n a 标记的结合使用或分析m t d n a 的全序列 当几种m t d n a 标记结合在一起对鲸类进行系统发生分析时，有时几种分析结 果可以相互印证，但有时也会产生不太一致的分析结果不一致的原因可能有多个 方面，如使用的某个遗传标记中交异位点数较少，或样本数太少等等。m e s s e n g e r 和m c g u i r , ( 1 9 9 8 ) 结合使用了2 0 7 个形态学性状和3 个m t d n a 基因( 1 2 , 5r r n a ， 1 6 sr r n a 和c y i6 ) 序列资料进行鲸类的系统发生分析时，虽然使用不同的数据组 合和聚类方法的结果并不完全一致，但基本上支持一角鲸科( 一角鲸m o n o d o n m o n o c e r o s 和白鲸d e l p h i n a p t e r u sl e u c a s ) 最早从海豚总科中分化出来。 r o s e l 等( 1 9 9 5 ) 测定鼠豚科包括2 个亚科( 鼠豚亚科p h o c o n e n i n a e 和拟鼠豚 亚科p h o c o e n o i d i n a e ) 4 属6 种( r i c e ，1 9 9 8 ) 的m t d n a c y tb 基因和控制区部分序 列，结果表明，鼠豚亚科的黑鼠豚( p h o c o e n as p i n i p i n n i s ) 和加湾鼠豚( 只s i n u a ) 关系较近，两者又与眶鼠豚( a u s t r a l o p h o c a e n ad i o p t r i c a ) 关系较近，而根据最近的 形态学分类( b a r n e s ，1 粥5 ) ，后者应与拟鼠豚( p h o c o e n o i d e sd a l l i ) 共同组成拟鼠 豚亚科而实际上，眶鼠豚一开始是被置于鼠豚属下的( l a h i l l e ，1 9 1 2 ) 。此外，r o s e l 等( 1 9 9 5 ) 的研究还发现，江豚( n e o p h o c a e n a p h o c a e n o i d e s ) 代表了鼠豚科中最基 部的分支不过，可能由于序列饱和的原因，r o s e l 等通过控制区序列的分析除了 关于黑鼠豚、加湾鼠豚和眶鼠豚的分析结果与c y t b 基因相同外，并没有很好地解决 其它种类之间的关系r o s e l 等工作提示，目前关于鼠豚科的亚科划分可能是无效 的，因此，在开展进一步的工作之前，最好不要再使用鼠豚亚科p h o c o n e n i n a e 和拟 5 鼠豚亚科p h o c o c n o i d i m c 的划分 根据h i h i s ( 1 9 9 6 ) 和g r a y b c a l ( 1 9 9 8 ) 的观点，增加分类单元数比增加性状 数更能解决复杂而有争议的系统发生问题，h a m i l t o n ( 2 0 0 1 ) 对2 9 种齿鲸的3 个 线粒体基因序列( c y t b 基因全序列，以及1 2 s 和1 6 sr r n a 基因的部分序列) 进行 合并分析，结果支持淡水豚类是多系发生的他把淡水豚类四个属划分为p l a t a n i a t a ， l i p o t e s 及i n i a + p o n t o p o r i a 等3 个齿鲸进化中独立的古老支系恒河豚科与除抹香 鲸类外的其它齿鲸类构成姐妹群，但是置信度较低其余的淡水豚类( 亚河豚，弗 西豚和白爨豚) 并系地位于海豚总科( 一角鲸科+ 鼠豚科+ 海豚科) 分支的基部。系 统学分析提示亚河豚与弗西豚都为单系发生类群，并一起构成海豚总科姐妹群分 析结果还表明这3 种淡水豚是从进化为海豚总科主干中分出的早期支系中的代表， 并支持它们分别属于独立的科 a m a s o n 和c m l l b e r g ( 2 0 0 0 ) 等测定了抹香鲸( p h y s e t e r m a c r o c e g i m l u s ) m c d n a 基因组全序列，并和之前测定的两种须鲸即长须鲸( b a l a e n o p t e r ap h y s a l u s ) 和蓝鲸 ( b a l a e n o p t e r a m u a c u l u a ) 及其他几种偶蹄日动物( 包括河马，牛，绵羊，羊驼和猪) 的m t d n a 全序列做比较，进行了系统发生分析，研究结果支持以下种系发生关系： 外群( ( 猪，羊驼) ，( ( 牛，绵羊) ，( 河马，( 抹香鲸，( 须鲸) ) ) ) ) 分析结果有力支 持了鲸类和河马具有姐妹群关系 2 核d n a 分子标记 核d n a 作为遗传标记，在没有p c r 技术做支持时，主要是限制性片段长度多 态性( r i s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 等手段p c r 技术诞生后， 以p c r 技术为基础，发展出随机扩增多态d n a ( r a n d o n d ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a ，r a id ) 、扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n ti e n 霉山p o y m m p u i s m ，a f l p ) ， 徽卫星( m i c r o 咖l l i 2 e ，m s ) 等分析方法和技术此外，还有各种特定核基因的外元 ( e x o n ) 或内元( i m r o n ) 的序列扩增与分析。因为核基因组的碱基组成巨大，所以 其中蕴藏了比m t d n a 更为丰富的遗传信息，因此近年来核d n a 分子标记已在鲸类 的分子系统发生中得到广泛运用 2 1 徽卫星d n a 微卫星d n a ( m i c t o s a t c l l i t ed n a ) 是基因组中一些包含不同数量的简单串联重 6 复序列，重复单元的长度一般为1 - 6b p 由于微卫星重复序列的两侧序列保守。故 而可以据此设计引物并应用p c r 技术进行分型微卫星标记以其丰富的多态性，分 析技术的简便性以及对实验样品和仪器设备的要求较低等特点，已成为鲸类分子系 统学研究中使用最广泛的分子遗传标记技术之一 a s n a s o n 和b e s t ( 1 9 9 1 ) 分析了所有须鲸类的3 个互不关联的微卫星座位的特 征和分布其中的一个微卫星为不同鲸类( 包括齿鲸类和须鲸类) 共有，可以作为 鲸类单系起源的证据( a m a s o ne ta 1 ，1 9 8 4 ) 。另两个微卫星分别为须鲸d n a 重卫 星( h e a v y m i c r o s a t e l l i t e ) 和轻卫星( h g h tm i c r o s a t e l l i t e ) 重卫星座位主要出现在须 鲸类，但在严格意义的露脊鲸科( b a l a e n i d a e ( 包括小露脊鲸( c a p e r e am a r s z n a t a ) ) 中的组织形式不同于所有其它须鲸类轻卫星则不分布于b a l a e n i d a e 科，但在其它 须鲸种类中均存在因此，a m a s o n 和b e s t ( 1 9 9 1 ) 的研究表明，须鲸中最早的分 化发生在露脊鲸科与其他种( 包括小露脊鲸) 之间随后对不同鲸类共有的微卫星 座位的d n a 序列的分析，也支持了露脊鲸科最早从须鲸类中分化出来的观点在 通过c y l b 基因进行的须鲸类系统发生分析中，也支持须鲸中最早分化出来的是露脊 鲸科而原来归属于露脊鲸科的小露脊鲸却包含在其余9 种须鲸组成的单系中，从 而支持了基于解削学把小露脊鲸从露脊鲸科独立出来自成一科小露脊鲸科 t n e o b a l a e n i d a e 的观点在其余9 种组成的系统树分支中，小露脊鲸是最早分化出来 的一支此外，灰鲸( e s c h r i c h t i u s r o b u s t u s ) ( 虽然与须鲸属b a l a e n o p t e r a 有明显的 形态学差异) 被包含在由须鲸属组成的支系中灰鲸与须鲸属较近的亲缘关系还得 到微卫星座位和控制区序列分析( a m a s o n ，1 9 9 1 ：1 9 9 3 ) 的支持 2 2 咖和l i n e 短散在元件( s h o r ti n t e r s p e r s e de l e m e n t s ，s i n e ) 和长散在元件( 1 0 n gi n t e r s p e r s e d e l e m e n t s ，l i n e ) 为来源于转座予复制机制的重复序列，在人类s 矾e 长约1 0 0 - 4 0 0 b p 之间，l i n e 长约5 - 6 k b 之间，它们也被用来探讨鲸类的分类与系统发生关系n i k a i d o 等( 2 0 0 1 ) 通过2 5 个短散在元件( s i n e ) 信息位点的分析认为，发现齿鲸类是单系 起源的；他们还推算出现生鲸类大约在距今2 , 8 0 0 - 3 , 3 0 0 万年前快速辐射分开 ( h a m i l m ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 这一时闻与化石记录十分吻合此外，通过分析他们还 发现淡水豚类是多系发生的，同属南美洲的亚河豚与弗西豚具有姐妹群关系，并明 7 确的将恒河豚科淡水豚类中分离出来，但是所提示的恒河豚的发生位置与前人有所 不同恒河豚在分化时间上比喙鲸早，但比抹香鲸晚。另外根据s i n e 侧翼序列分析 发现白紧豚与南美洲的两种淡水豚( 亚河豚+ 弗西豚) 组成一个单系群，这与杨光 和周开亚( 1 9 9 9 ) 的结论相符 2 3 m h c 除了上述两种标记外，其它一些标记，如主要组织相容性复合体( m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 的应用在鲸类的系统发生研究中也受到关注。 c 是脊椎动物体内与免疫密切相关的遗传系统与一般功能基因不同的是，m h c 在平衡选择( b a l a n c i n g s e l e c t i o n ) 的作用下，保持了极高的多态性一般认为，m h c 遗传背景的差异是个体之间抗寄生虫能力及自身免疫疾病易感性不同的基础m h c 多样性的降低可导致种群抗病能力单一，对突发性的传染性病原体的易感性增高， 生存力下降( h e d r i c k ，1 9 9 4 ) 该基因系统己越来越多地用于鲸类的系统发生研究 北大西洋的露脊鲸( e u b a l a e n ag l a c i a l i s ) 种群数量已由1 1 世纪的1 20 0 0 头降至 本世纪的约3 0 0 头，w a l d i c k 等( 2 0 0 2 ) 用1 3 个徽卫星座位对其研究发现，现有露脊 鲸的遗传多样性水平明显低于其近缘物种e u b a l a e n aa u s t r a l i s ，稀有的低频等位基因 暗示该种群的遗传变异性一直在减少 严洁等( 2 0 0 3 ) 测定了4 5 个克隆的白爨豚( l 驴o t e sv e x i l l i f e r ) m h c i i 类基因d o b 座位第二外元1 7 2b p 的核苷酸序列，共获得1 5 种序列，发现了2 2 个变异位点。核苷 酸的非同义替换明显多于同义替换，并造成了1 5 个氨基酸的改变氨基酸的替换趋 于集中在假定的与抗原的选择性识别相关的位点附近。白累 豚d o b 基因的核苷酸 和氨基酸序列与文献报道的白鲸( d e l p h i n a p t e r u sl e u c a s ) 和一角鲸( m o n o d o n 删挑憎r ) d o b l 序列具有较高的同源性氨基酸序列不具备人及其它一些灵长类 动物d q b 2 基因所共有的基序( m o t i f ) ，而与牛d q b l 基因的基序相近，说明得到 的白黑豚m h c 序列应属于类- d q b l 基因。同一个体出现了多种序列的情况，提示白 黑豚的d q b 基因可能存在着座位重复。白黑豚的类d q b l 座位的序列中存在多种基 序的不同组合，他们推测是由于基因转换造成的 2 4 其他核基因标记 郭丽等( 2 0 0 6 ) 利用聚合酶链式反应，首次从白疑豚基因组d n a 中扩增和克隆 8 到脑源神经营养因子的编码区在该段序列中含有一个长为7 4 7b p 的开放阅读框，无 内含子，编码一个由2 4 8 个氨基酸组成的蛋白质。其中包括由1 8 个氨基酸残基组成的 信号肽区，1 1 1 个氨基酸残基组成的前肽区及1 1 9 个氨基酸残基组成的成熟区他们 对序列分析结果表明，白霸豚脑源神经营养因子基因编码区的核苷酸序列与其它哺 乳动物相似性超过9 0 ，而与猪牛相似性相对较高( 分别为9 5 和9 4 7 ) 。氨基酸 序列比较发现，白紧豚b d n f 前体蛋白的氨基酸序列与其它哺乳动物具有 9 4 5 9 9 5 的相似性，显示了极高的保守性。通过邻接法进行的系统发生分析中， 鲸目和食肉目的物种分别聚为单系；与其它哺乳动物相比，鲸类与有蹄类的牛和猪 的亲缘关系相对较近，这与鲸类和有蹄类之间具有相对较近的亲缘关系相符 b a k e r 等( 1 9 9 8 ) 通过对大翅鲸、蓝鲸和弓头鲸等a c t i n 基因内元( i n t x o n ) 和m t d n a 部分序列的比较，发现i n t r o n 序列并不像m t d n a 的控制区序列有明显大的差异；大 翅鲸和蓝鲸的序列差异度仅为3 ，而大翅鲸和弓头鲸的序列差异度也只有4 ，由 此说明a c t i ni n t r o n 在鲸类中的演化速率还是比较慢的d a l e b o u t 等( 2 0 0 4 ) 测定了 2 1 种喙鲸个体的m t d n a 的控制区和c y , b 序列以及核a c t i n 基因i n t r o n 序列，通过这 些数据的种系发生比较，从分子水平上探讨了喙鲸科的分类，得出了几个重要的结论， 并且纠正了从形态学上对喙鲸的错误分类。这说明a c t i n 基因i n t r o n 序列对鲸类的系 统发生分析是非常有用的 3m t d n a 与核d n a 标记的结合使用 目前，越来越多的分子生物学家把m t d n a 与核d n a 标记的结合使用，来探 讨鲸类的分子系统发生g r a u r 和m g g l n ( 1 9 9 4 ) 通过5 个线粒体基因和1 1 个核编码 基因的序列分析为鲸类与有蹄类之间较近的亲缘关系提供了分子证据，并认为应把鲸 类置于有蹄目之下o f a u r 和h i g g i n 的研究还发现，儡蹄目中的反刍亚耳( r u m i n a n t i a ) 比其它亚目与鲸类有更近的亲缘关系，从而使传统上认为的偶蹄目的3 个亚目组成一 个单系群的观点受到了强有力的挑战。 c a s s e n s 等( 2 0 0 0 ) 分析了1 9 个鲸类物种的3 个线粒体基因序列( c y tb 基因全 序列，以及1 2 s 和1 6 sr r n a 基因的部分片段) 与两个核基因片段的序列，构建的 n j ，i m p 及m l 系统发生树提示现生的淡水豚类不是一个单系群，并认为现生的4 种 淡水豚是因适应了淡水环境而得以在海洋环境巨变及海豚类的竞争下生存和保留下 9 来秘孑遮携擎争。毪髑捂窭，生活手鬻荚溯豹嚣静浚零嚣( 耍簿联稳弗秀嚣) 麴蔽海瓤 总科的姐妹群，自鬻豚则与 p u l a f i o n ) ， s s ：南海种群( s o u t hc h i n as e ap o p u l a t i o n ) 1 3讨论 本研究显示，对于江豚的核a 继因的第一个内元，在扩增出的2 0 1 的短片段中 未找到一个变异位点，而在8 8 3b p 的片段中也只发现了4 个变异位点，变异位点仅约 占总碱基的0 4 5 。这说明江豚的遗传多样性程度是相当低的 杨光和周开亚( 1 9 9 7 ) 曾测定了中国水域江豚长江种群、黄海种群和南海种群 共1 2 头个体的2 个长度分别为3 1 7b p 帛 2 4 5b p 的m t d n a 控制区序列。并以此分析了 江豚种群的遗传变异。将两序列合并分析，发现其中含7 个变异位点，约占总碱基的 1 2 5 他们的研究结果表明：中国水域江豚各种群的控制