（遗传学专业论文）拟南芥根系突变体hpa1的基因克隆及功能研究.pdf

硕：b 学位论文：拟南芥根系突变体蛔口，的基因克降及功能研究 致谢 本论文是在导师吴平教授悉心的指导下完成，从选题、设计、方案实 施、结果分析到论文的定稿，都凝聚了导师的大量的心血。两年多来，导 师对治学的严谨求实、对科学的执着追求、勇于奉献的精神以及乐观进取 的生活态度，时刻激励着我；同时实验室浓厚而开放的学术研究氛围、先 进的仪器设备和实验条件、规范而严格的管理制度，使我受益良多。在此 谨向尊敬的导师表达我最诚挚和衷心的谢意! 本人这篇论文的完成得益于课题组各成员的相互信任与齐心合作，课 题组的主要负责人莫肖蓉老师给予了我很大的帮助，在她手把手，耐心细 致的指导下，让我一步一步走入科学的殿堂，同时也离不开李静师姐的帮 助与指导，与你们共同分享实验的喜与忧，一起相处的日子永远难忘。 感谢读研时期寿惠霞老师、陈铭老师、陈新老师、易可可老师、毛传 澡老师、吴忠长老师、李靖老师、段可老师、刘洪家老师、黄方亮老师、 陈汉民老师、吴运荣老师的支持。感谢秦诚、齐小鹏、储俊、王栩鸣、余 晓波、张麝龙师兄，党磊、王学敏、于杰、李想、杜黎明、焦芳婵、周洁、 王芳师姐给予的真诚无私的帮助，同时还要感谢武为、黄红杰、杜冠魁、 丁沃娜、何飞、郑录庆、陈飒、王晓飞、曹军、张忠臣、程龙军等同学一 路上的热心协助。 最后感谢我最爱的家人与朋友，谢谢你们的理解与鼓励。 朱晴羽 2 0 0 6 年5 月于浙江大学紫金港 堡三! j ：堂垡堡苎：型堕茎堡至窒壅堡竺! ! 竺茎鬯壅堕丝些! ! 塑塑 缩略语表 缩写词英文名称 中文名称 a b aa b s c i s i ca c i d脱落酸 w t l r p e m s h p a h y g s s l p w i l dt y p e野生型 l a t e r a lr o o tp r o m i d i u m e t h y l m e t h a n es u l f o n a t e h i s t i d i n o lp h o s p h a t e a m in o t r a n s f e r a s e h y g r o m y c i n s i n m p l es e q u e n c el e n g t h p o l y m o r p h i s m 侧根原基 乙基甲烷磺酸盐 磷酸组氨醇转氨酶 潮霉素 简单序列长度多态性 c a p sc l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i c 。 s e q u e n c e k a n s p a m p d n a b u s p i r n a n t d s d n a a r a b i d o p s i s k a n a m y c l n s t r e p t o m y c i n a m p i c i i l i n d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 8 一g i u c u r o d i d a s p r o p i d i u mi o d i d e r i b o n u c l e i ca c i d n u c l e o t i d e d o u b l e s t r a n dd n a t a r a b i d o p s f sy h e l i a n a 卡那霉素 链霉素 氨苄青霉素 脱氧核糖核酸 0 一d 葡糖醛酸糖苷酶 碘化丙啶 核糖核酸 核苷酸 双链d n a 拟南芥 4 a b s t r a c t h i s t i d i n e ，a ne s s e n t i a li n g r e d i e n tf o rp r o t e i ns y n t h e s i s ，i sr e q u i r e db y a l l1 l y i n go r g a n i s m s i nh i g h e rp l a n t s a l t h o u g hc o n s i d e r a b l ee v i d e n e e s h o w st h a th i s t i d i n ei se s s e n t i a lf o rp l a n tg r o w t ha n ds u r v i v a l ，1 i t t l e i n f o r m a t i o nr e g a r d i n gw h e t h e ri tp l a y sa n ys p e c i f i cr e g u l a t o r yr o l ei n p l a n td e v e l o p m e n ti sa v a i l a b l e h e r ew ep r e s e n te v i d e n c ef o rt h e r e g u l a t o r yr o l eo fh i s t i d i n ei na r a b i d o p s i s ，an o v e la r a b i d o p s i sm u t a n t h p a l ，w a ss e l e c t e db e c a u s eo fi t sr e m a r k a b l es h o r tp r i m a r yr o o tl e n g t h u s i n gm a p b a s e dc l o n i n gm e t h o d ，i ti sf o u n dt h a tt h em u t a t e dp h e n o t y p e w a sc a u s e db yd i s t u r b i n go fo n eo ft h et w oa r a b i d o p s i sh i s t i d i n o l p h o s p h a t ea m i n o t r a n s f e r a s e ( h p a ) g e n e s b i o c h e m i c a la n a l y s i ss h o w st h a t t h i sm u t a n th a sr e d u c e df r e eh i s t i d i n ec o n t e n t a 1 t h o u g ht h em u t a n td i d n o ts h o ws i g n i f i c a n ts y m p t o m so fh i s t i d i n es t a r v a t i o n ，i td i s p l a y e da d r a m a t i cd e v e l o p m e n t a ld e f e c ti nr o o t ，i e u n a b l et om a i n t a i nr o o t m e r i s t e m s o u rd a t as h o w e dt h a tt h ed e f e c t si nt h em u t a n tw e r er e l a t e d t ot h es h i f to ft h ef r e eh i s t i d i n ec o n t e n ti nm u t a n tp l a n t t h em u t a n t p h e n o t y p ec o u l db er e s c u e de i t h e rb ye x o g e n o u sh is t i d i n es u p p l e m e n t a t i o n o rc o m p l e m e n t e db yh p ao v e r e x p r e s s i o n o u rr e s u l t sr e v e a lt h a th i s t i d i n e h o m e o s t a s i sp l a y si m p o r t a n tr o l e si np l a n td e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：a r a b i d o p s f & h p a l ，h p a ，h i s t i d i n e ，r o o tm e r i s t e mm a i n t e n a n c e 硕士学位论文：拟南芥根系突变体如d ，的基因克隆及功能研究 中文摘要 组氨酸是蛋白质合成的必要组分之一，对所有生物来说是不可缺 少的。在高等植物中，已有证据表明组氨酸对植物的生长和发育是必 需的，但是对其在植物生长发育过程中起哪些具体的调节作用还不甚 明了。从研究提供的证据说明组氨酸在拟南芥根部分生组织的正常维 持中起到重要的调节作用。我们发现了一个新的拟南芥突变体，h p a l ， 此突变体表现出十分明显的主根缩短，并且点突变发生在拟南芥中编 码磷酸组氨醇氨基转移酶的基因( h p a ) 上。生化分析显示此突变体 体内游离组氨酸的含量降低了2 7 6 。虽然助a 并没有显示出十分 严重的组氨酸饥饿特征，但是在根的发育上表现出明显的缺陷，根部 分生组织遭受严重破坏。通过外源添加组氨酸或者转入h p a 超表达基 因可以回复h p a l 的突变特征，该结果证明组氨酸在植物发育过程中 起到重要的调控作用。 关键词：磷酸组氨醇氨基转移酶拟南芥组氨酸根分生组织 硕士学位论文：拟南芥根系突变体如a ，的基因克隆及功f t b , 珂f 究 1 组氨酸的生物合成 第一章文献综述 氨基酸是蛋白质的基本组分，对人类等高等动物来说，组氨酸作为一种必需 氨基酸来自我们的日常食物摄入，植物和微生物能够自身合成所有的2 0 种必需 氨基酸。 组氨酸的生物合成是以a t p 作为底物，需要经过一系列复杂的生化过程。组 氨酸的合成耗费了对细胞来说大量的能力。这一过程与核酸的代谢息息相关。不 仅如此，组氨酸被认为是比较原始的分子，可能是最早的氨基酸，因为它不仅可 以直接从r n a 催化而来，也是很多酶的激活位点。 整个合成从a t p 的嘌呤环n 1 与p r p p 核糖基c 1 缩合开始的( w i n k l e r ，1 9 8 7 ： m i f a n oe ta 1 1 9 9 6 ) 。p r p p 为组氨酸生成提供5 个c 原子，a t p 的腺嘌呤为组氨 酸咪唑环生成提供n 和c 各一原子。咪唑环的另一n 原子来自谷氨酰胺侧链。整个 过程经历1 1 个步骤共有1 0 种酶参与( c a r l o m a g n oe ta 1 1 9 8 8 ) 。 在真菌和一些低等真核生物中组氨酸的合成广泛存在( w i n k l e r1 9 8 7 ) 。比如 说，在大肠杆菌( e s c h e r i c i ac o l i ) 中，组氨酸生物合成途径中的1 1 个活性酶 由8 个基因所编码，这8 个基因又被整合在一个单独的操纵子中( c a r l o m a g n oe ta l 1 9 8 8 ) 。另外，在酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 中，组氨酸的生物合 成由分散在各个染色体中的7 个基因所控制( m o r t i m e re ta 1 1 9 9 4 ，a 1 i f a n oe t a 1 1 9 9 6 ) 。这些差异是由多功能酶( h i s 4 和h i s 7 ) 引起的。h i s 4 蛋白可以分成3 个亚结构域，h i s 4 a ，h i s 4 b 和h i s 4 c ，各自分别地与h i s i e 和h i s d 相对应( d o n a h u e e ta 1 1 9 8 2 ) 。h i s 瑾因编码两种不同功能的酶：谷氨酸氨基转移酶( h i s h ) 和 环化酶( h i s f ) ( k u e n z l e re ta 1 1 9 9 3 ) 。与此相反，h i s b 在大多数的真菌中包 含两种酶活性：i m i d a z o l eg l y c e r o lp h o s p h a t ed e h y d r a t a s e ( h i s 2 ) 和 h i s t i d i n o lp h o s p h a t ep h o s p h a t a s e ( h i s 3 ) ( c a r l o m a g n oe ta 1 1 9 8 8 ) 。 在植物中，参与组氨酸生物合成途径的基因组成与酵母类似。具体组氨酸合 成途径见图1 。 9 0 年代初，在大麦，燕麦和豌豆的地上组织提取液中发现 硕= 匕学位论文：拟南芥根系突变体如a l 的基因克隆及功能研究 a t p p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e ( e c2 4 2 1 7 ) ，i m i d a z o l eg l y c e r o l p h o s p h a t ed e h y d r a t a s e ( i g p d ) ( e c4 2 1 1 9 ) 和h i s t i d i n o lp h o s p h a t e p h o s p h a t a s e ( e c3 1 3 1 5 ) 三种酶，它们分别催化合成途径中的第一，第七和 第九步。目前，除了组胺醇磷酸酶( h i s t i d i n o lp h o s p h a t ep h o s p h a t a s e ) ( h p p ) 所有的组氨酸生物合成相关基因的c d n a 克隆均已得到。两个拟南芥异构酶 a t a t p p r t l 和a t p r t p r t 2 ，催化组氨酸合成途径的第一步( o h t ae ta 1 2 0 0 0 ) 。 ec o i lh i s l 突变体p r a c h 活性缺乏，通过互补实验证实t a t - i e 蛋白酶具有两种 不同的功能，p r a p h 和p r a c h ，各自催化组氨酸合成途径的第二步和第三步 ( f u j i m o r ia n do h t a1 9 9 8 a ) 。从丘c o i lh i s a 突变体系h f r g 6 的互补试验中，获 得b b m i i ( n7 - ( 5 一 p h o s p h o r i b o s y l ) 一f o r m m n o 一5 - a m i n o i m i d a z o l e 一4 一c a r b o x a m i d e r i b o n u c l e o t i d e ) 异构酶，它能将b b m i i 转换为b b m i i i ，参与了第四步的合成 ( f u j i m o r ie ta 1 1 9 9 8 ) 。从表达序列标签( e s t ) 克隆中鉴别出的彳f c d n a ， 与sc e r e v i s i a eh i s 瑾因相似，编码具有两种不同功能的酶，谷氨酸氨基转移 酶和环化酶( g l u t a m i n ea m i d o t r a n s f e r a s e c y c l a s e ) ，分别参与合成的第五步 和第六步( f u j i m o r ia n d0 h t a1 9 9 8 b ) 。i g p d ( i m i d a z 0 1 e g l y c e r 0 1 p h o s p h a t e d e h y d r a t a s e ) 催化i g p 通过脱水反应生成i a p ，即组氨酸合成途径的第七步。该酶 的c d n a 来自于拟南芥，是通过包含厅，s 尉反媾位基因的ec o l is b 3 9 3 0 互补试验得 到( t a d ae ta 1 1 9 9 4 ) 。来自烟草n c o t i a n at a b a c u z 郇j c d n a 编码磷酸组胺醇氨 基转移酶( h i s t i d i n o lp h o s p h a t ea m i n o t r a n s f e r a s e ) & d h p a ，参与组氨酸合成 的第八步，它是从ec o t ih i s 铰变体的互补实验中得到的( e 1m a l k ie ta 1 1 9 9 8 ) 。h d h ( h i s t i d i n o ld e h y d r o g e n a s e 组胺醇脱氢酶) 催化合成途径的最后 两步，编码此酶的c d n a 序列来自b r a s s c ao e r a c e a ( n a g a ie ta 1 1 9 9 1 ) 。 氨基酸生物合成的调节有两种途径，即由反应系统最终产物对催化第一步反 应的酶起别构或反馈抑制作用，从而有效地抑制氨基酸合成反应；第二条就是通 过同工酶起调控作用。 组氨酸对植物来说是至关重要的，利用组氨酸合成途径中的一些特定的抑制 子可以对组氨酸的合成进行研究，例如抑制i g p d 活性的t r i a z o l eh e r b i c i d e s 完全阻碍组氨酸的合成会导致植株死亡( m o r ie ta 1 ，1 9 9 5 ：g u y e re ta 1 ， 硕士学位论文：拟南芥根系突变体切日，的基因克隆发功能研究 1 9 9 5 ) 。n i c o t i a n ap l u m b a g n i f o l i a 组氨酸缺陷突变体h i s l 一，在h p a 基因处发 生点突变，其只能在外源添加组氨酸的情况下才能存活( e 1m a i ma n dj a c o b e s 。 2 0 0 1 ) 。拟南芥t - d n a 插入突变体a p g l o ，其a p g l 0 基因编码b b m i i 异构酶，表 型显示子叶与真叶呈黄绿( n o u t o s h ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。除了参与蛋白质合成，组 氨酸在一些代谢的交叉途径中也起着一定的作用( g u y e re ta 1 ，1 9 9 5 ：n o u t o s m e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。例如，在拟南芥中，利用t r i a z o l eh e r b i c i d e s 抑制组氨酸合 成会导致其他氨基酸合成途径中的基因增强表达( g u y e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 i - ”m m ”n r t ”，t r i ，k m n b o n ， ”6 m “”， l ：器“。m pm l 岫“n l ：j ：嚣：皇：= = = = ：嚣 ” tr t o 挑e l 仳i d t o | 。一。一。一 卜= 一一斗器器：警lq 1 t m i l 雠0 1 e 口1 y c a z o 王p h o b 计璩t o l 卫t 池z 0 1 e c e t o l 】灿明曲晶t e l i 黧鬈盥= ：尝， li - h i b t i d i l 】啦o g d h a t o z - i b t 土l i n 0 1 j r - 一一- 一“畸一。t 一， i 一耳土# 七t d 童n a l i “n i m l d n “i 。 l e i b t 工d i n o 图l a ：参与工c e r e v i m a e 和最c o l i 组氨酸合成途径中的酶及相关基因 9 颂：l 学位论文：拟南芥根系突变伴如口，的基因克隆及功能研究 囡 二p - o _ _ 照。谶h 加。k 型 o h o h o h o h 0 o h 0 h o ho h 图l b ：组氨酸合成早期途径 0 硕士学位论文：拟南芥根系突变体如d ，的基因克隆及功能研究 l - l i j s n d i m 图i c ：组氨酸合成后期途径 硕士学位论文：拟南芥根系突变体如日，的基因克降及功能研究 2 植物中h p a 基因的发现 磷酸组胺醇氨基转移酶( h p a ) ( e c2 6 i 9 ) 作为组氨酸合成酶的种，在 微生物中早已被发现，此酶催化反应的第八步，转移谷氨酸的氨基基团到 i m i d a z o l a c e t o l ep h o s p h a t e 从而形成磷酸组胺醇( h i s t i d i n o lp h o s p h a t e ) 。 在细菌中，此酶h i s 馑因编码( g r i s o l i av e ta 1 1 9 8 5 ) ，在酵母中，相应 的基因为h i s 5 ( h a r a s h i m as ，e ta 1 1 9 8 1 ) ，它的转录活性受到体内氨基酸合 成的调控( n i s h i w a k ike ta 1 1 9 8 7 ：h i n n e b u s c ha ge ta 1 1 9 8 8 ) 。 h p a 的催化机制在s a l m o n e l l at y p f l i m u r i u m 中已经被阐明( a l b r i t t o nw le t a 1 1 9 7 0 ；m a r t i n r ge ta 1 1 9 7 0 ) 。同大多数氨基转移酶采用的机制相似， 此酶通过穿梭或乒一乓原理进行转氨作用( b r a u n s t e i na ee ta 1 1 9 7 3 ) 。 第一个在植物中编码h p a 蛋白的c d n a 的发现即来自烟草。从烟草 p l u m b a g i n i f o l i a 单倍体原生质体中分离出一个组氨酸营养缺陷型突变体h i s l 一，编 码h p a ( e c2 6 1 9 ) 的基因发生点突变导致其h p a 的缺乏( n e g r u t i u ie ta 1 1 9 8 5 ； n e g r u t i uie ta 1 1 9 9 2 ) 。该突变体只能生长在外源添加组氨酸培养基上。 3 植物的根系发育及其影响因素 根是植物的地下营养器官，将植物固定在土壤中并对地上部分起支持作用； 根是吸收水、养分的主要器官：能合成氨基酸、植物碱和激素等：还具有贮藏、 繁殖和输导、分泌的功能。高等植物的根系统主要由三个部分组成：主根，侧根 和不定根。主根的分生组织在胚胎形成时期就形成了。而侧根和不定根的发生则 是胚胎后事件，并且随着植物的年龄和环境因素的变化而变化。大量实验表明， 各类激素在根系发育过程中起到十分重要的作用。 3 1 植物主根的发生及结构 主根是由种子的胚根发育而成的。植物的根从其尖端到着生根毛的段，称 为根尖。根尖是根生命活动最活跃的区域，根尖从其尖端向后依次可分为根冠、 分生区、伸长区和根毛区( 成熟区) 四个区。根冠( r o o tc a p ) 由薄壁细胞构成 的圆锥帽状体结构，套在生长锥的外面，起保护作用，是根部感觉重力的部位。 硕士学位论文：拟南芥根系突变体切口，的基因克隆及功能研究 根冠原始细胞位于生长锥的先端，产生新细胞，补充磨损的细胞，保持根冠一定 的厚度和形状。外围的细胞能分泌粘液，起润滑作用。根冠的淀粉体沉淀起向地 性的指导作用。分生区( m e r i s t e m a t i cz o n e ) 长约i m m ，是根顶端分生组织( 原 分生组织+ 初生分生组织) 所在地。原分生组织来源于胚，保持分生能力，后端 叫做初生分生组织，这部分组织有分裂与分化作用，包含半球形的静止中心。伸 长区( e l o n g a t i o nz o n e ) 近分生区端有分裂能力，成为根尖深入土层的动力， 远离分生区端的细胞伸长，增加根的长度，具有环纹导管，个别出现筛管。成熟 ( 根毛) 区( m a t u r a t i o nz o r e ) 表皮细胞形成根毛，吸收水分养分的部位，成 熟区细胞停止生长，分化成各种成熟组织，寿命从几天到1 0 2 0 天。 3 2 植物侧根的发生 3 2 1 侧根形成的起始 侧根的发生起始于特定的中柱鞘细胞，这些细胞通常都是位于根的成熟区， 且正对木质部或韧皮部射线。它们与其他部位细胞的不同之处在于细胞长度明显 变短，且处于细胞分裂的g 2 期，细胞内含有复制的染色体。尽管中柱鞘细胞在结 构上都是相似的，但并非所有这些细胞都参与侧根的形成，只有少数能够行使此 功能，它们被称为建成细胞( f o u n d e rc e l l ) ( m a l a m ya n db e n f e y ，1 9 9 7 a ) 。 侧根发生的起始标志是建成细胞的第一次垂周分裂，即中柱鞘的一个细胞非 对称地分裂成上下两个细胞。这次细胞分裂可由生长素诱导发生，将其视为侧根 形成的第一步( m a l a m ya n db e n f e y ，1 9 9 7 b ) 。但是，生长素虽然能诱导细胞分 裂，但这一通路的具体过程至今尚不清楚。 3 2 2 侧根原基的形成 一旦起始信号被接受，中柱鞘分裂成的两个细胞就能经过几次平周分裂和垂 周分裂，形成穹隆状的侧根原基( m a l a m ya n db e n f e y ，1 9 9 7 c ) 。研究发现，在 生长素缺失的情况下，只有具有3 5 层细胞的细胞团才能发育成侧根，少于此数 目的细胞团不能发育成侧根。这说明，3 5 层细胞生长成为侧根，要么不需要生 长素的，要么是可以自我供应所需要的生长素。 3 2 3 侧根原基发育 研究发现，在侧根原基穿越表皮阶段，可以很清楚地观察到其外层细胞，在 硕士学位论文：拟南芥根系突变体助d ，的基因克隆及功能研究 根原基扩张并突破表皮的过程中，外层细胞数目并没有增加，只是基部细胞伸长 了许多( c h e n ge ta 1 ，1 9 9 5 ) 。这说明侧根原基突破根表是通过细胞伸展而不 是细胞分裂，直到原基突破根表后顶端细胞才开始增加。 原基细胞突破表皮，就形成肉眼不可见的小侧根。对异常侧根形成突变体 ( s t f 3 一) 的研究发现，如果没有外源生长素的话，其侧根的发生将在其刚刚突 破表皮后停止。这一停止的发育能在施加外源i a a 或者吲哚乙酸的情况下得到挽 救( c e l e n z aj re ta 1 ，1 9 9 5 ) 。这说明，在侧根原基形成并突破根表皮后，仍 然需要生长素的供应。而a t f 3 一，正是因为失去了自我合成生长素或无法将其转 运到侧根原基处的能力而导致表型的突变的。 3 3 影响根系发育的因素 调节植物根系发育的途径主要有两条：1 、内源途径。这一途径决定特定物 种的根系结构特征，限定了其可塑性的范围；2 、应答途径。这一途径通过利用 外源信号修饰内源途径达到调节的目的。 3 3 1 影响主根发育的因素 在高等植物中，根尖分生组织( r o o ta p i c a lm e r i s t e mr a m ) 的活性直接决 定了整个主根及根系的发育( d o l a ne ta 1 ，1 9 9 3 ：s c h e r e se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。分 生组织的形成是在胚胎发生期，在种子萌发后开始形成各种特定的细胞和器官 ( j t l r g e n s ，1 9 9 5 ：s c h e r e se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。在胚后发育阶段，分生组织细胞的分 裂和分化受到高度的调控，随着根的生长分生组织一直维持着其特定的细胞构 成。 拟南芥根尖分生组织的细胞构成包含了四个中心细胞，即静止中心 ( q u i e s c e n tc e n t e rq c ) ，在其周围的是干细胞( i n i t i a lc e l l ) ( d o l a ne ta 1 ， 1 9 9 3 ) 。q c 不具有分裂活性，干细胞具有很强的分裂能力。在胚后发育阶段，每 个贴近q c 的于细胞会进行一次平周分裂( d o l a ne ta 1 ，1 9 9 3 ) ，这是一次非对称 分裂，产生两个姐妹细胞，其中贴近q c n 保持原先干细胞活性，另一个则根据所 处的位置分化成各种具体的细胞( v a nd e nb e r ge ta 1 ，1 9 9 5 ) 。n q c 被激光消 融，紧贴的干细胞便失去其特有的分裂能力，同姐妹细胞一样的方式进行分化 ( v a nd e nb e r ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。这就表明q c 在维持根尖分生组织活性上极其重 硕士学位论文：拟南芥根系突变体如口，的基因克隆及功能研究 要。 通过对拟南芥突变体的研究分离出几个与分生组织正常维持相关的基因。 例如刚啪卜肋，( 5 冉回和5 翻膨甜移( 5 仂磅基因的发现，它们在拟南芥根发育中控 制各种组织形态的构成( b e n f e ye ta 1 ，1 9 9 3 ：s c h e r e se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。这两 个基因的突变会导致只有一种组织形态存在，表明它们在干细胞的非对称平周分 裂中至关重要。在s 硖变体中残余分裂后细胞层仍旧保持着内外皮层的分化能 力，说明s c r 仅仅对细胞的分裂是必需的( s c h e r e se ta 1 ，1 9 9 5 ：d il a u r e n z i o e ta 1 ，1 9 9 6 ) ；在s h r s 突变体中内皮层分化能力消失，说明s h r 对细胞的分裂和 分化都是必需的( b e n f e ye ta 1 ，1 9 9 3 ) 。s h r 异位表达会导致额外的细胞分裂和 根分生组织中异常形态细胞出现。同时研究证明s h r 对s c r 表达的维持十分重要， s h r 能够上游调控s c r ( y r j oh e l a r i u t t ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。另一个拟南芥突变体 矗，发芽后q c 功能消失，表现出根部分生组织在细胞层面上遭到严重破坏，分生 组织的活性降低，对h l r 基因研究表明其对维持根尖分生组织的细胞组构和正常 活性是必需的( m i n a k ou e d ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。此外生长素输出载体p i n 4 突变体 中q c 特异标记表达和根尖分生组织细胞组构均受到破坏( f r i m le ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 某些多肽的缺乏也会引起根系发育异常。拟南芥突变体册，根尖分生组织活 性丧失，根部的细胞分裂停止。研究发现r m l i 基因编码g s h 合成途径中的第一个 酶，r g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h e t a s e 。突变体的表型可以通过外源添m h g s h 被回 复( t e v av e r n o u xe ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 3 3 2 影响侧根发育的因素 外源氮与水分信号是影响侧根原基形成、突破表皮和分生组织激活的重要的 外源因素。 而细胞周期调节子，植物激素等都是影响侧根形成的重要内源因素。 在生长素( a u x ) 、细胞分裂素( c t k ) 、脱落酸( a b a ) 、赤霉素( g a ) 和乙烯五 大类经典植物激素中，外源生长素能够促进侧根与不定根的发生；外源细胞分裂 素及脱落酸抑制侧根与不定根的发生；赤霉素影响甚微；乙烯则通过调控生长素 的代谢而起作用。 3 3 2 1 生长素对侧根形成的影响 生长素被认为是调控植物根系构成的主要激素。大量的实验证明生长素参与 硕士学位论文：拟南芥根系突变体加口，的基因克隆及功能研究 调控侧根发生的起始。首先，较高浓度的外源生长素几乎可以刺激所有与木质部 射线对应的中柱鞘细胞增生成为侧根原基的一部分，这种表型可以在拟南芥突变 体s 和，沙中看到，而这些突变体的内源i a a 含量远远高于野生型( c sv a nd e n b e r ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 。过量表达生长素合成基因的转基因植物也同样能够发生更 多的侧根。其次，生长素抗性突变体a 肘，a x f 4 , a u x f 和i a a 2 8 的侧根数目显著 低于野生型( l u i s ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。有的突变体，比如a l f 4 不能通过施加外源 生长素得到回复，说明侧根的发生不仅仅受生长素的控制( 儿c e l e n z aj re ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。 另外叶源和根源生长素对侧根发生起始具有不同影响。利用生长素极性运输 抑制剂抑制地上部合成的生长素向根部的运输，会抑制侧根的形成。切除地上组 织可以抑制侧根的发生，说明地上部合成的生长素向根部的运输对侧根的发生是 重要的。另一方面，c a s i m i r o 等利用s t i n 7 突变体的研究表明，地上部生长素向根 端的运输可能并非是侧根起始所必需的，因为s t i n 7 缺乏顶端分生组织，不能形成 叶原基，但其侧根的发生和伸长与野生型没有明显差异，且根部顶端组织的i a a 水平正常( c a s i m i r oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。不过也存在着这种可能，即s t m 突变体 根部的i a a 来源于胚轴。近期的研究表明，根源i a a 向基部的运输是侧根发生起始 所必需的。 3 3 2 2 脱落酸( a b a ) 对侧根发生的影响 a b a 对侧根形成具有抑制作用。曾经认为a b a 对侧根发生的抑制作用是通过生 长素途径起作用的。l y e 等人( s m e te ta i ，2 0 0 3 ) 建立了一系列拟南芥突变体 系，在不同的a b a 浓度培养基中，观察这些株系的侧根发生情况。实验结果揭示 了一条有关侧根形成的不依赖于生长素的a b a 信号途径。首先，外源施加生长素 或提高内源生长素表达并不能减小或消除a b a 对侧根的抑制作用。其次，被认为 编码生长素依赖的信号途径中关键基因的突变并不影响侧根对a b a 的应答。第三， a b a 和a l f 3 1 并不在同一发育点起作用。由此推知，a b a 在侧根发生过程中起到的 抑制作用是独立于生长素途径的，而且需要新的a b a 信号元件介导。 3 3 2 3c t k 对侧根发生的影响 细胞分裂素在植物生长和发育的各方面均有十分重要的作用，其促进细胞分 裂，植株地上部的起始和生长，还参与叶片的衰老及光的形态建成。在植物中， 硕：f ：学位论文：拟南芥根系突变体切口，的基因克隆及功能研究 c t k 与a u x i n 的比例决定着体外培养的愈伤组织的分化方向( s k o o ga n dm i l l e r ， 1 9 5 7 ) 。同时，c t k 还可以影响源库关系、种子发芽、管状组织的形成和子叶的伸 展( m o ka n dm o k ，1 9 9 4 ) 。天然存在的c t k 类物质均为腺嘌呤的衍生物，包括 t r a n s - z e a t i n 、k i n e t i n 、b e n z y l a d e n i n e ( b a ) 、t h i d i a z u r o n 等。 近年来，对c t k 信号转导途径的研究颇多，大多认为c t k 信号途径是一个磷酸 化过程，类似于细菌的“双元响应系统”( t w o c o m p o n e n ts y s t e m s ) 。 在c t k 与侧根发生的关系上，有研究表明，外源施加6 一b a 会使t a c t u c a s a t i v a 侧根的数目减少5 0 ( z h a n ga n dh a s e n s t e i n ，1 9 9 9 ) ；增强表达c t k 生物合成基因的转基因烟草植株也表现出了对根生长的抑制( h e w e l te ta j ， 1 9 9 4 ) 。也就是说，c t k 对侧根的形成有抑制作用。h o h a re t a - ( 2 0 0 4 ) 以a r r s ： g u s 为m a r k e r 基因，发现在拟南芥侧根原基发育的最早时期初始细胞分裂 阶段并未检测到a r r 5 基因的表达，之后，在侧根原基基部发现了a r r 5 基因的高 效表达，而在侧根的继续发育阶段，a r r 5 基因会持续的表达。表明侧根的起始 是伴随c t k 早期响应基因的局部抑制的。故而推断c t k 对侧根的抑制是作用在原 初细胞分裂阶段的。这是第一个被报道的在c t k 抑制侧根原基上发挥作用的基 因，但其结论是间接的推断。 4 组氨酸缺乏对植物根系发育的影响 组氨酸作为植物体内不可缺少的氨基酸，在植物体中具有重要作用。在催化 植物体合成组氨酸1 1 个步骤的各种酶中，任何一个酶的缺失或突变都可能造成组 氨酸的缺陷，从而导致植物生理性状的改变。 我们得到一个拟南芥突变体，该突变体体内游离组氨酸含量与正常相比下降 了3 0 ，基因定位结果表明 嘲基因缺陷，我们将其定名为h p a l 。这一突变体 与野生型相比根部构型发生了很大的改变并且对a b a 和高浓度n o 。一抑制侧根发生 的作用表现出一定的不敏感性。我们就是利用该突变体对h p a i 基因的功能和表 达调控，以及组氨酸缺乏对根系发育的影晌进行研究。 硕士学位论文：拟南芥根系突变体h p a i 的基吲克隆及功能研究 第二章材料与方法 1 实验材料 植株：c o l ( c o l u m b i a ) 型拟南芥l e r ( l a n d s b e r ge r e c t a ) 型拟南芥 e m s 诱变种子( c o l 背景) h p a l 突变体 菌株：农杆菌e h l 0 5 型大肠杆菌d h 5 型 质粒载体：p u c m tp c a m b i a l 3 0 ip b s s k 工具酶： e c o r l e c o r vp s t ib a m h ls m a l 等限制性核酸内切酶 骀口d n a 聚合酶t 4 d n a 连接酶t 4 d n a 聚合酶等 2 实验试剂 试剂：d n a 提取液质粒抽提液：s o l u t i o n i s o l u t i o ni i s o l u t i o ni i i t r i z o l乙醇异丙醇r n a 酶水溶液酚一氯仿抽提液氯仿异戊醇 抽提液及各种缓冲液 培养基或培养液：1 2 m s 基本培养基拟南芥营养液1 2 m s 浸润液y e p 培养 液l b 培养液 3 拟南芥的培养及突变体的筛选 3 1 突变体的筛选 将经过e m s 诱变处理的c o l 型拟南芥种子播种在基本培养基上，挑选表型异 常的突变体，移栽到1 2 m s 培养基上壮苗后，再移入土壤中种植。收种子。鉴定， 确认突变性状。经过筛选，我们得到了一个拟南芥突变体系，它具有一系列于野 生型拟南芥表型显著不同的表型特征。 研究发现该突变体是组氨酸合成相关基因h p a i 突变体，所以将其命名为 h p a l 。 硕士学位论文：拟南芥根系突变体h p a i 的摹因克隆及功能研究 3 2 拟南芥的培养 3 2 1 拟南芥种子的灭菌 1 ) 将大约0 5 m l 拟南芥种子放入1 5 m l 离心管中，加入l m l 9 5 乙醇和次氯 酸钠的混合液( 次氯酸钠终浓度8 - 1 0 ) ，振摇8 - l o m i n 。 2 ) 吸出洗涤液，加入l m l 无水乙醇，振摇2 m i n 。 3 ) 重复操作2 ) 四次。 4 ) 将灭好的种子在超净台里吹干，放置待用。 3 2 2 拟南芥的培养 首先根据不同的需要将拟南芥种子点播在不同的培养基上，放于培养箱内。 若盆栽，1 5 2 0 天后，将幼苗移栽进花泥中，并放置于生长室。期间要注意不 同株系间的隔离，以防异花授粉。 拟南芥培养条件： a 、培养箱： 温度控制：白天( 1 4 小时) 2 0 2 2 ；晚上( 1 0 小时) 1 8 。c 光照时间：7 ：0 0 2 1 ：0 0 光照强度：2 0 0 p m o l m s 1 b 、生长室： 温度控制：白天2 2 ；晚上2 0 光照时间：7 ：0 0 2 1 ：0 0 光照强度：1 5 0 p m o l m s 。1 拟南芥营养液每隔一周加一次。 各种拟南芥培养基及培养液配方： a 1 2 m s 培养基配方 试剂 每升溶液中的含量 m s 大量元素( 2 0 ) 2 5 m l m s 微量元素( 2 0 0 ) 5 m l 铁盐 1 0 m l 肌醇 1 0 m l 硕士学位论文：拟南芥根系突变体h p a l 的基因克隆及功能研究 烟酸0 5 m l 吡哆醇0 5 m l 硫胺素1 0 u 1 甘氨酸 2 m l m e s 0 5 9 蔗糖( 1 5 ) 1 5 9 k h ：p 0 4 ( 2 0 ) l m l ( 浓度为2 5 i _ t m ) a g a r ( 琼脂) ( 0 8 )8 9 $ 使用时，先定容调节p h 值至5 7 ，灭菌后倒平板。 b 拟南芥营养液配方： a 大量元素( 2 5 2 5 9k n o 。，2 4 6 5 9m g s o 。7 h ：0 ) 溶解，加水至5 0 0 m l 配成 1 0 0 母液i ； b 2 3 6 9c a ( n 0 3 ) 2 4 h 。0 溶解，加水至5 0 0 m l ，配成1 0 0 母液i i ； c 铁盐0 6 9 9f e s o 。7 h ：0 、0 9 3 9e d t a 2 n a 两种药品分别溶解，混合定 容至5 0 0 m l ，配成1 0 0 母液i i i d 微量元素母液( 母液) ( 1 0 0 0 x ) l 药品h ，b o 。 m n c l2 4 h 2 0z n s 0 4 7 h