壬基酚和双酚A检测方法.doc

壬基酚检测方法1目的建立该程序为规范壬基酚和双酚A测定提供指导性文件。2 适用范围本规程适用于婴幼儿食品及食用植物油和包材等双酚A、壬基酚含量的液相色谱-串联质谱法测定。 3 原理3.1试样中(婴幼儿乳粉及粉状原料）的壬基酚和双酚A经乙酸乙酯-环己烷（体积比按1:1）提取后，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。3.2样品（油类）经过凝胶渗透色谱法（GPC）除脂净化（乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v）超声提取），同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。3.3样品（膜）经过正己烷浸泡提取，氮吹（42）至干，用1ml甲醇定容后，同位素稀释高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测，与标准系列比较定量。4 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为色谱纯，水为GB/T 6682规定的一级水。4.1 乙酸乙酯4.2 环己烷4.3 壬基酚和双酚A 及其同位素内标（NP-d4、BPA-d4）4.4 甲醇4.5 氨水（分析纯）4.6 乙腈4.7 标准溶液4.7.1 壬基酚和双酚A标准储备液（0.2mg/ml）：分别称取壬基酚和双酚A的标准品0.02g（精确到0.1mg），溶于甲醇中，用甲醇定容到100ml容量瓶中，放置于4冰箱中。4.7.2 壬基酚和双酚A标准中间夜（2ug/ml）：分别吸取1ml壬基酚和双酚A标准储备液，用甲醇定容至100mL。4.7.3 壬基酚和双酚A标准工作液：分别吸取壬基酚和双酚A标准中间夜10l，25l，50l，75l，100l，150l，250l，然后分别加入50l壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液，最后加甲醇定容至1ml，配制成工作液浓度分别为20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml，200ng/ml，300ng/ml，500ng/ml。4.8 内标物溶液4.8.1 壬基酚和双酚A同位素内标物标准储备液（0.2mg/ml）：分别称取壬基酚和双酚A的同位素内标物0.02g（精确到0.1mg），溶于甲醇中，用甲醇定容到100ml容量瓶中，放置于4冰箱中。4.8.2 壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液（2ug/ml）：分别吸取1ml壬基酚和双酚A的同位素内标物标准储备液，用甲醇定容至100mL。5 仪器和设备5.1 天平：感量为0.1mg。5.2 涡旋振荡器5.3 氮吹仪5.4 低温低速离心机5.5 超高效液相-质谱联用仪5.6 凝胶渗透色谱仪6 分析步骤6.1 试样处理6.1.1婴幼儿乳粉及粉状原料称取试样1g（原料根据实际情况酌情减少称样量）精确到0.1mg于50ml干燥的玻璃离心管中，向样品中分别加入50l壬基酚和双酚A的同位素（200ng/ml）内标物（NP4-n-NP-d4和BPA-d4）,加入8ml乙酸乙酯-环己烷溶液（体积比按1:1），涡旋振荡30s，离心10min（1000转/min）。然后再重复上述操作进行第二次提取，将两次的上清液合并至同一个试管中。然后将上清液转移到氮吹管中，进行氮吹（42），吹干后用1ml甲醇进行定容，用0.22有机滤膜过滤后上机，同时做试剂空白试验。6.1.2包材 准确裁取一定面积（15*30cm）的包材，然后进行塑封，向其中加入100ml的正己烷进行浸泡，向浸泡液中分别加入50l壬基酚和双酚A的同位素（1ug/ml）内标物（NP4-n-NP-d4和BPA-d4）.浸泡5小时，每隔半个小时摇晃一次。取出20ml浸泡液于干净的试管中进行氮吹（42），吹干后用1ml甲醇进行定容，同时做试剂空白试验。用0.22有机滤膜过滤后上机。6.1.3食用植物油 称取食用植物油样品0.4 g于GPC样品管中，向样品中分别加入50l壬基酚和双酚A的同位素内标物标准中间液（200ng/ml）,加入5 mL乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v），2000 rpm涡旋混合1 min，用于GPC净化。GPC分离采用苯乙烯树脂Biobead SX-3 (300 10 mm)凝胶色谱柱，流动相为乙酸乙酯:环己烷（1:1，v/v），流速3.0 mL/min。收集14-17 min组分于100 mL茄形瓶中，30C，120 rpm旋转蒸发至干，1 mL甲醇（3.1）定容，用0.22有机滤膜过滤后上机，同时做试剂空白试验。6.2 测定6.2.1 参考液相色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（50 mm 2.1 mm）；捕集柱：Waters Isolator Column（P/N：186004476），捕集柱位于进样阀之前（图1）。流动相:甲醇-0.1氨水进样量：10l流速：0.3mL/min柱温：355样品室温度：155根据仪器性能调至最佳状态，液相仪器参考条件见下表目标化合物参考液相色谱条件时间（min）流速（ml/min）A%（甲醇）B%(0.1%氨水溶液)0.340600.60.3100020.310002.50.3406030.340606.2.2 参考质谱条件质谱条件：离子源，电喷雾电离ESI（-）；毛细管电压，2.8 KV；离子源温度，150C；脱溶剂温度，400C；脱溶剂气流量，800 L/h；锥孔气流量为50 L/h。采用多反应监测具体的离子采集参数见下表化合物名称母离子（m/z）子离子（m/z）锥孔电压v碰撞能量ev4-NP（壬基酚）219.19132.934304-NP（壬基酚）219.19146.883426BPA（双酚A）227.06132.783630BPA（双酚A）227.06211.9636266.2.3 超高效液相色谱-质谱联用仪测定（定量测定）将标准储备液用甲醇稀释称为标准工作液，在仪器最佳工作条件下，标准工作液分别进样，以标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。采用外标法进行定量测定，样品溶液中的待测物的响应值应该在标准曲线的线性范围内。7.1 分析结果的表述7.1.1试样（粉和油）中壬基酚和双酚A的含量按下式计算：X=CV/m式中：X试样中检测目标化合物残留量，单位为微克每千克（g/kg)C由回归曲线计算得到的上机试样溶液中目标化合物含量，单位为纳克毫升（ng/ml）；V浓缩至干后试样的定容体积，单位为毫升（mL）；m试样的质量，单位为克（g）。7.1.2试样（膜）中壬基酚和双酚A的含量按下式计算：X=6*CV*f/S式中：X试样中检测目标化合物残留量，单位为微克每千克（g/kg)C由回归曲线计算得到的上机试样溶液中目标化合物