（神经生物学专业论文）cdc42信号介导的突触前快速成熟机制研究.pdf

简写 5 h t a m p a r b a p l _ a b d n f c y td e c s e f s e g t a e p s c e p s p 0 a b a g f a p 0 1 、p l t d n b n m d a r r n a i r p r r p s p s n p t b s _ r 1 k b v a m p 简写( a b b r e v i a t i o n s ) 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ， d l - a - a m i n o 一3 - h y d r o x y 一5 一m e t h y l - 4 - i s o x a z o l e p r o p i o n i ca c i dr e c e p t o r 1 , 2 ，一b i s - ( 2 一a m i n o p h e n o x y ) e t a n e - n ，n ，n ，n - t e t r a a e e t i ca c i d b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r c y t o c h a l a s i nd e x t r a c e l l u l a rs o l u t i o n e l e c t r i cf i e l ds t i m u l a t i o n e t h y l e n e - g l y c o l - b i s - ( b e t a a m i n o e t h y l e t h e r ) - n ，n ，n ，n t e t r a a c e t i ca c i d e x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cc u r r e n t e x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l g a m m a a m i n ob u t y r i ca c i d g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n l o n g - t e r mp o t e n t i a t i o n l o n g - t e r md e p r e s s i o n n e u r o b a s a lm e d i u m n - m e t h y l d - - a s p a r t a t er e c e p t o r r n ai n t e r f e r e n c e r e s e r v ep o o l r e a d i l yr e l e a s a b l ep o o l s y n a p s i n s y n a p t o p h y s i n t h e t a b u r s ts t i m u l a t i o n _ f v r o s i nr e c e l 9 t o rk i n a s e 3 v e s i c l ea s s o c i a t e dm e m b r a n ep r o t e i n 5 - 羟色胺 n - 氨基3 一羟基一5 一甲基一4 一异丙 酸受体 ( 】，2 一双( 2 一氨基苯氧) 乙基 n ，n ，n ，n 一四乙酸) 脑源性神经生长因予 细胞松弛素d 细胞外液 电场刺激 乙二醇一双( 2 一氨基乙基醚) 一 n ，n ，n7 ，n 一四乙酸 兴奋性突触后电流 兴奋性突触后电位 y 一氢基丁酸 胶质纤维酸性蛋白 长时程增强 长时程衰减 神经细胞培养基 n m d a 受体 r n a 干扰 囊泡储备库 待释放囊泡库 突触素 突触体素 0 脉冲的电刺激 酪氨酸受体激酶b 囊泡相关膜蛋白 3 中文摘要 c d c 4 2 t 言号介导的突触前快速成熟机制研究 沈万华( 神经生物学) 指导老师：段树民研究员 摘要 突触前递质释放装置的发育成熟和突触后受体的转运是中枢神经系统突 触发育过程中非常重要的两个方面。普遍认为在神经元的发育早期，大多 数突触后细胞膜上只含n m d a 受体而不含a m p a 受体。随着神经系统的发 育成熟，a m p a 受体的转运 二膜后才有大量功能性突触的产生。研究者也习 惯的把只含n m d a 受体的突触定义为沉默突触( s i l e n ts y n a p s e ) 。大量研究 表明，a m p a 受体的上膜所导致的沉默突触活化机制也是l t p 形成的神经 基础，沉默突触的形成和活化机制研究在神经可塑性领域受到了很火的重 视，阐明沉默突触的活化过程不仅为神经系统发育机制的研究、也为与学习 记忆相关的l t p 机制的研究提供了基础。虽然突触前细胞在沉默突触活化 过程中的作用也已经得到重视，但其具体的活化机制和介导的信号通路还不 清楚。 我们运用双膜片钳技术同时记录两个培养的海马神经元，发现了和传 t d c 2 靛号舟导盼突融裁快速战熟魂勃研究 统认识一 ：不同的一类沉默突触，即该类突触既没有n m d a 受体介导的反 应，也没有a m p a 受体介导的反应。当存突触前细胞t b s 后，能快速的诱 导此类沉默突触转化为功能性突触，并进一步揭示了这种转变需要突触前细 胞b d n f c d c 4 2 信号的参与。为进一步探索这种转变的分子机制，我们用 f m 4 6 4 标记实验证明r 突触前细胞有新的功能性囊泡增加，此过程和 c d c 4 2 介导的突触前细胞丑儿动蛋白微丝( a c t i n ) 的聚合有关。a c t i n y f p 荧 光变化的动态观察实验证实j ，这种突触前细胞活性依赖的肌动蛋白聚合可以 被b d n f 及c d c 4 2 信号通路的阻断剂阻断。f m 4 6 4 标记的功能性囊泡与突 触前囊泡蛋白s n p 的共定位实验结果表明，电场刺激( e f s ) 或b d n f 诱 导的功能性囊泡增加是因为促进了待释放囊泡库( 心) 处的囊泡成熟。电 镜实验进一步直接观察到了神经元突触前末梢位于活性带的待释放囊泡，并 证明了待释放囊泡的增加是电活动依赖的。 综上所述，本文发现了类与传统认识上不同的沉默突触。此种沉默 突触既4 i 含n m d a 受体、也不含a m p a 受体介导的电流，可以被神经元电 活动依赖的突触前细胞刺激快速诱导活化，这一快速成熟的过程是由突触前 细胞b d n f c d c 4 2 信号介导的a c t i n 聚合嘶完成。冈此，本文揭示了神经发 育过程中沉默突触活化的新机制，对进步研究突触发育以及神经回路的形 成具有一定的意义。 关键词：可塑性突触前递质释放沉默突触肌动蛋白细 胞骨架 a b s t r a c t p r e s y n a p t i cc d c 4 2s i g n a l i n g m e d i a t e dr a p i dm a t u r a t i o no f s i l e n ts y n a p s e s w a n h u as h e nf n e u r o s c i e n c e ) d i r e c t e db yp r o fs h u m i nd u a n a b s t r a c t m a t u r a t i o no fp r e s y n a p t i ct r a n s m i u e rs e c r e t i o nm a c h i n e r ya n dt r a f f i c k i n go f p o s t s y n a p t i cr e c e p t o r sa r et w oc r i t i c a ls t e p s i ns y n a p t o g e n e s i sa n ds y n a p t i c d e v e l o p m e n to fc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ( c n s ) s i l e n ts y n a p s e sa r ef r e q u e n t l y f o u n di nd e v e l o p m e n t a lb r a i na n da r eg e n e r a l l yr e f e r e dt o s y n a p s e sc o n t a i n i n g o n l yp o s t s y n a p t i cn m d ar e c e p t o r sb u tn oa m p ar e c e p t o r sa n dt h u sa r en o t f u n c t i o n a lu n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o nd u et ot h ev o l t a g e d e p e n d e n tm 9 2 + b l o c k a g e o fn m d ar e c e p t o r s u n s i l e n ts u c hn o n f i m c t i o n a l s y n a p s e sa r e g e n e r a l l y b e l i e v e dc a u s e d b yt r a f f i c k i n ga m p ar e c e p t o r s t o p o s t s y n a p t i c m e m b r a n e a l t h o u 曲t h ec o n t r i b u t i o no fp r e s y n a p t i cc e l l i nu n s i l e n c i n gh a s b e e na d d r e s s e d ，t h em e c h a n i s mo fa c t i v a t i o na n dr e l a t e dm o l e c u l a rs i g n a l i n gi s u n c l e a r u s i n gd o u b l ep a t c hr e c o r d i n gf r o mc u l t u r e dh i p p o c a m p a ln e u r o n s ，w ef o u n d t h a id u n n ge a r l yd e v e l o p m e n ts t a g em a n yp a i r sl a c kb o t hn m d aa n da m p a r e c e p t o r sm e d i a t e dr e s p o n s e ab r i e ft r a i no fp r e s y n a p t i ca c t i o np o t e n t i a l s r a p i d l yc o n v e r t st h e s en o n f u n c t i o n a lc o n t a c t si n t of u n c t i o n a ls y n a p s e sb yt u m i n g o np r e s y n a p t i cg l u t a m a t er e l e a s e t h ee n h a n c e dr e l e a s ew a sc o n f i r m e db ya 一6 - c d c 4 2 f f f 号介导的瓮触前抉速成熟执翩研究 m a r k e di n c r e a s e i nt h en u m b e ro fd e p o l a r i z a t i o n i n d u c e df m 4 - 6 4p u n c t ai nt h e p m s y n a p t i ca x o n t h i sr a p i dp r e s y n a p t i cm a t u r a t i o nc a nb ea b o l i s h e db y t r e a t m e n t st h a ti n t e r f e r e dw i t hp r e s y n a p t i cb d n f c d c 4 2s i g n a l i n go ra c t i n p o l y m e r i z a t i o n a c t i v a t i o no fc d c 4 2b ya p p l y i n gb r a d y k i n i nm i m i c k e dt h e e f f e c to fe l e c t r i c a l a c t i v i t y i n p r o m o t i n gs y n a p t i cm a t u r a t i o n f u r t h e r m o r e ， a c t i v i t y i n d u c e di n c r e a s ei np r e s y n a p t i c a c t i n p o l y m e r i z a t i o n ，a sr e v e a l e db y i n c r e a s e dc o n c e n t r a t i o no f a c t i n y f pa ta x o nb o u t o n s ，w a sa b o l i s h e db yi n h i b i t i n g b d n fa n dc d c 4 2s i g n a l i n g t h ea c t i v i t y i n d u c e di n c r e a s ei nr e a d i l yr e l e a s a b l e v e s i c l e si na c t i v ez o n ew a sa l s oo b s e r v e db ye l e c t r o nm i c r o s c o p y t a k e nt o g e t h e r , o u rs t u d yr e v e a l san o v e lm e c h a n i s mo fu n s i l e n c i n gd u r i n ga c r i t i c a l s t a g e o f s y n a p s e f o r m a t i o nt h a t m a yp l a yi m p o r t a n t r o l e si n s y n a p i o g e n e s i sa n dn e u r a lp l a s t i c i t y r e yw o r d s ：p l a s t i c i t y ，p r e s y n a p t i c ，t r a n s m i t t e rr e l e a s e ，s i l e n ts y n a p s e s ，a c t i n ， c y t o s k e l e t o n 7 | 言 引言 突触( s y n a p s e ) 是一类高度特异化了的细胞问连接，介导轴突和目 标细胞间的信息传递。突触的基本性质就决定了它们可以通过不同形式 的突触可塑性来改变突触传递的效率。因此，在探讨突触发育和成熟的 过程中，对突触前和突触后细胞的功能变化研究已经成为阐明脑工作原 理的基本方向。在研究突触发育的大量文献资料中，人们对突触后细胞 的发育及形成机制已经有了比较深刻的认识【】，但由于研究手段和认识 上的限制，对突触前细胞的成熟机制研究还相对缺乏。 我们知道，突触的形成和成熟遵循严格的时间过程，也是一个高度 动态的过程，并可被神经元电活动所调节 2 4 1 。在突触发育的早期阶 段，人们发现了一类没有功能的沉默突触( s i l e n ts y n a p s e s ) ，f n n n g 的发育过程r 1 均已发现了沉默突触的存在【2 ；5 9 】。目前较为流行的观念 认为，谷氨酸能的沉默突触是指那些突触后细胞只含有n m d a r 但没有 a m p a r 介导反应的突触。在生理条什下，因为电压依赖的镁离子阻断了 n m d a r 的功能，所以检测不出n m d a r 介导的反应。一些能诱导形成 l t p 的刺激可以移去镁离子的阻断作用，伴随着电活动依赖的突触后细 胞a m p a r 上膜和突触传递持续性增强，此过程与活化沉默突触的机制 类似d ；5 1 。尽管很多研究从l t p 的角度探讨沉默突触的形成及活化机 制，但在突触形成和发育的过程中，沉默突触的产生特性及其激活机制 c d c 4 2 f 芎号赍导钓突触前快速战熟机翻研究 并不清楚。而且相当多的研究只是集中在突触后细胞的活化机制上，虽 然也有些研究认为，沉默突触叫能是由于突触前细胞的递质释放缺陷造 成的 2 ；6 ；8 ；1 0 】。这种缺陷随着突触的发育成熟或神经元电活动依赖的刺 激被活化，但其活化的过程及具体机制并不清楚。 肌动蛋白细胞骨架的重排( r e o r g a n i z a t i o n ) 参与了电活动依赖的突 触修饰过程 1 1 15 】。f 1 前对树突棘的肌动蛋白微丝动力学变化和重排已 经有了相当深入的研究 1 l ；1 3 】，但对突触前细胞的微丝骨架重排机制却 仍不清楚 1 4 1 6 。一些存存于突触小体中的微丝骨架都受到r h og i p 酶家族成员【17 1 ，包括r h o a 、r a c 和c d c 4 2 的调节【1 8 。c d c 4 2 激酒 的g a c t i n 聚合与f - a c t i n 解聚参与了b d n f 诱导的轴突导向过程【1 9 】。 5 - h t 艮时问处理海兔的感觉神经元，所引起的与学习记忆相关的新突触 形成也是c d c 4 2 信号介导的f 2 0 】。新的突触形成需要经过比较长的时 间，那我们就提出r 这样的问题，是否有类似的分子信号通路介导_ r 电 活动涛导的突触快速成熟与可塑性? 我们在小于1 0 天的培养神经元中，用无镁加甘氨酸的细胞外液记录 到了一种与传统定义上不j 耐的沉默突触，即该类突触既没有n m d a r 也 没有a m p a r 介导的反应。电生理条件下给予突触前细胞t b s ，能快速 的活化此类沉默突触，记录到n m d a r 和a m p a r 介导的反应能稳定4 0 分钟以上。功能性囊泡标记物f m 4 6 4 与突触前细胞囊泡相关蛋白s n p 的共定位实验发现，电活动依赖的刺激可以诱导结构性突触向功能性突 5 f 言 触转化【2 。同时，f m 4 6 4 实验证实了电活动依赖的功能性囊泡增加也 是b d n f c d e 4 2 信号依赖的，并受c d c 4 2 介导的a e t i n 聚合调控。综上所 述，本文在细胞发育的特定阶段，发现了一类新的与传统定义不同的沉 默突触，并揭示了突触前细胞b d n f t r k b c d e 4 2 信号通路介导了电活动 依赖的沉默突触快速活化，并最终由a c t i n 重排诱导的囊泡释放增加完 成。 c d c 1 2 信号赍导的突鼬前快速或熟枫毒4 研究 1 细胞培养及转染 1 1 海马神经元培养 s e c t i o ni 材料与方法 海马神经元的详细培养方法请见以前报道，并稍做改动 2 1 】。用 o 2 5 胰酶( t r y p s i n ) 在3 7 。c 消化2 0m i n 后，用枪头吹打分离e 1 8 大 鼠的海马，然后以6 5 ，0 0 0 绌 j g c m 2 的密度接种在铺有p o l y d 1 y s i n e 玻 片上，用含有1 0 胎牛血清( f b s ) 和f 1 2 的d m e m 培养液孵育，放 在3 7 c ，5 c 0 2 的培养箱中培养2 4 小时后，用含有2m m 谷氨酰胺 ( g l u t a m i n e ) 和b 2 7 的n b ( 2 ) 培养液替换一半原来的培养液。5 8 天后，根据细胞的生长情况用1 0p m 的阿糖胞。i j ：孵育4 8 小时，抑制 扩增的胶质细胞，最后j l | 含有b 2 7 的n b 培养液进行培养。 1 2 转染 1 2 1 磷酸钙转染 如无特殊说明，一般采用5 - - 6d i v 的神经元进行磷酸钙转染。本文 使用过的质粒有a c t i n y f p ，t r k b t i g f p ，d n c d c 4 2 一g f p ，d n r a c g f p 。d n c d c 4 2 一m y c 和a c t i n y f p 共转染的比例为1 ：1 。具体操作步骤 如下：首先制备磷酸钙一d n a 沉淀，将质粒d n a 加到2 0 4l a l 无菌水 中，滴加3 6 此c a c l 2 ( 2 5m o l l ) 溶液。然后用巴斯德吸管在3 0p l 的 材料与方法 2 h b s ( p h7 0 7 ) 中逐滴加入d n a c a c l 2 溶液，同时用另吸管吹打 溶液，直至d n a - c a c l 2 溶液滴完，整个过程缓慢进行，至少需持续1 - - 2 m i n 。室温静置2 0m i n ，出现细小颗粒沉淀。将沉淀溶液逐滴均匀加入无 血清的培养基中，轻轻晃动，使d n a 沉淀均匀分布以整个盘面。在标准 生长条件下培养细胞2 4h r ，除去无血清的培养基，换液后继续培养。 1 + 2 2 脂质体转染 脂质体l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 的转染按试剂说明书进行，转染时均采用 无血清、无抗生素培养基。脂质体与d n a 的比例2 ：1 ( l ：p g ) 。将脂 质体和d n a 分别加入4 0 0 j l 的无血清培养基，混匀静置5m i n 后将两 者混合，轻轻拍打混匀。放置2 5m i n 后加入含有无血清培养基的培养 皿，3 7 。c 培养2h 后换n b 培养液继续培养。 2 电生理记录 2 1 微电极的拉制 选用外径为1 2m m ，长约7 5c m ，内径( i d ) 为o 6 9m m ( b o r o s i l i c a t es u t t e ri n s t r u m e n tc o ) 的玻璃毛细管，在p p 一8 3 0 垂直拉制 仪上用二步法或p 9 7 水甲拉制仪上用四步法拉成记录用的玻璃电极。对 于神经元电生理实验，电极尖端直径一般为2 , 5 3 0p m ，灌注电极内液 后其阻抗在3 7m 。所有电极无需抛光即可直接进行实验。 c d c 4 2 信号奔导的突触裁快速成熟帆4 研究 2 2 给药装置和灌流系统 在进行给药实验时，采刚循环灌流。溶液进入记录槽是通过重力作 用：而溶液的流出通过循环采的动力抽出。溶液的流速大约为1 m l m i n 。需要同时进行多种药物处理的实验是通过多管给药系统进行 的。进行n m d a 诱导电流实验时采用y 管给药方式。所有实验均在有 空调房间内进行，温度维持在2 0 - - 2 4 。c 。 2 3 全细胞膜片钳记录 用无镁离子的细胞外液，在培养的海马神经元上做双电极全细胞膜 片钳记录 2 1 】。实验过程中，通过相差显微镜( i x 5 0 ，o l y m p u s ) 来观 察神经元形态。状态好的混合培养细胞中，神经元胞体折光率强，边界 清楚，胶质层光滑并铺满整个玻片( 图2 a ) 。电极灌注前先将电极浸入 内液中虹吸一分钟左右，然后用食指弹至无气泡为止。电极尖端入水 前，轻轻用嘴或推动注劓器在电极内给一个正压。在电压钳模式下用压 电微操纵器( b u r l e i g h ，u s a ) 或三维机械微操纵器( s d m x 7 6 0 ) b 导允有电极内液的玻璃微电极，入水后在软件p a t c h m a s t e r 2 1 的界面上 进行初始化( s e t u p ) 。待电极尖端靠近细胞后( 表现为胞体能被电极尖 端压出个浅的凹坑，还能观察到电极阻抗上升现象) ，释放掉正压并顺势 用嘴给一个负压，同时慢慢将钳制电压调节到- - 7 0m v 。待形成高阻封接 ( 1g q ) 之后( o n c e l l ) ，给予快速有力的负压使电极尖端下的细胞膜 材料与方法 破裂，从而形成全细胞记录模式( w h o l e c e l lr e c o r d i n g ) 。用软件 p a t c h m a s t e r 2 1 通过放大器( h e k ae l e c t r o n i k s ，g e r m a n y ) 来同时记录两 个细胞的电生理特性。 在电压钳状态下分析突触联系时，用低频( 0 0 3 一o 0 5h z ) 的电刺 激使细胞从- - 7 0m v 去极化到+ 3 0m v ，存另外一个神经元上记录反应。 记录的两个细胞可以互为突触前或突触后细胞。如果记录的突触后细胞 在连续2 5 5 0 个电刺激后还没产生突触后电流，就被认为是沉默突触。 把突触前细胞转换到电流钳后，给予突触前细胞t b s ( 以频率为1 0 0h z 的5 个脉冲为一短串，串间隔2 0 0m s ，共5 串为。组，重复5 次，组间 隔为15s ) 来诱导沉默突触的活化。判断沉默突触是否激活的标准是 f b s 诱导后连续3 0 分钟的记录过程中，有突触后电流出现。诱导成功率 则是指诱导成功的细胞对数和所有涛导的细胞对数比值。t b s 诱导一般 都是在全细胞记录形成后1 0 分钟内完成，这是为_ r 防止对l t p 诱导需要 的胞内细胞因子丢失。实验需要时，b a p t a ( 1 0m m ) 或e g t a ( 2 0 m m ) 通过电极内给药的方式加入到电极内液。 我们只有在两个都是谷氨酸能的神经j 二上以做诱导长时程增强 ( l 丁p ) 的实验。l t p 诱导有两种方法，一是直接给突触前细胞注入 t b s ，诱导时突触前细胞转换到电流钳，突触后绌胞为电压钳，可以用 来鉴别突触后电流的成份( 分别为n m d a r 和a m p a r 介导的反应) 。在 计算n m d a r 和a m p a r 的成份实验中，分别用n m d a r 和a m p a r 特 c d c 4 2 信号龠导斡突触前快速战熟杌翻研究 异性的阻断剂a p v ( 1 0u m ) 和d n q x ( 5 0p m ) 分离n m d a r 和 a m p a r 介导的突触反应。另外一种方法是关联刺激法( p a i r e d i n d u c t i o n ) ，突触前细胞注入电流( 2m s ，ln a ) 以产生动作电位，突触 后细胞同样注入电流( 2m s ，1n a ) 产生后发放，两次动作电位发放的 时间间隔小于】0m s ，这要根据不同的细胞来相应的调节时间间隔。然后 持续给予两个细胞刺激( 1h z ，8 0s ) 诱导u 1 p 2 2 ；2 3 。在所有连续的记 录过程中，给细胞一个超极化的方波( + 5m v ，4 0m s ) 记录所诱发的电 位来监测输入阻抗的变化，如果其变化范围超过1 0 ，则该组数据丢弃 不用。 3 f m 4 6 4 标记 f m 4 6 4 标记的方法详见文章 2 4 】。除非特别说明，溶液槽中一直灌 流e c s 。标记突触囊泡时，培养的细胞用含有f m 4 6 4 ( 1 0g m ) 的高钾外 液( k c i ，9 0m m ) 孵育3 0s 。离子型谷氨酸受体的拮抗剂a p v ( 5 0 m ) 和d n q x ( 1 0u m ) 一直加在高钾外液巾，用来阻断可能发生的反馈 ( r e c u r r e n t ) 激活和电活动依赖的突触可塑性而造成的细胞兴台性增加。采 集图像前用e c s 灌流1 0m i n ，洗去非特异性染色( 第一次标记) 。继续用 高钾外液脱色( d e s t a i n i n g ) 3 0s ( 第一次脱色) 后，进行第二次图像的采 集。b d n f ( 1 0 0n g m 1 ) 处理或e f s 后，再进行第二次f m 染色和脱色。对 照实验只用e c s 灌流1 5 分钟。用软件把脱色前采集的图像减去脱色后采集 的图像就减去了非特异性染色。实验需要时，k 2 5 2 a ( 2 0 0n m ) ，t o x i nb 树料与击注 ( 1 0 l a g m 1 ) ，或c y t d ( 2g g m 1 ) 与培养液一起孵育3 0 分钟。所有的实验 均在室温进行。 4 免疫细胞化学 将培养的细胞用p b s 清洗之后迅速转移到含有4 多聚甲醛的固定 液中于4 固定2 0 分钟，用o 2 的t r i t o nx - 1 0 0 破膜1 0 分钟，并用1 0 b s a 封闭1 小时。然后用a n t i - m y c ( 1 ：1 0 0 0 ) ，a n t i s n p ( 1 1 0 0 0 ) ，a n t i v a m p 2 ( 1 ：8 0 0 ) ，或a n t i p s d 9 5 ( 1 ：2 0 0 ) 孵育2 4 小时 ( 4 。c ) 。用p b s 洗三遍后，用f i t c 二抗( 1 ：4 0 0 ) 或者c y 3 二抗( 1 1 0 0 0 ) 在室温下进行染色标记、观察。 5 图像采集与分析 细胞图像通过o l y m p u s 共聚焦显微镜( f l u o v i e w5 0 0 1 x 7 1 ) 用6 0 水镜或4 0 x 油镜拍摄。包括免疫细胞化学的实验，图像均采用5 1 6 5 1 6 的分辨率。拍摄过程中，把光电倍增管的增益调到最大( 9 0 0 ) ，增高 信噪比，但不要信号过强以至于饱和。软件i m a g e p r op l u s5 1 写成m a c r o 之后，用来分析f m 4 6 4 标记的功能性p u n c t a 数量或荧光强度的变化。 其分析的方法遵循下列原则：f mp u n c t a 的直径在0 1 到0 6 “m 之间，荧 光强度高于平均背景的三个标准误。在明视野下，所采集的每幅图像都 尽量包含相同的细胞数日。每组独直的实验都会采集超过3 0 个区域 c d c 4 2 靛号会导的突触蔼快速战熟枫锄研究 ( 3 1 7 3 1 7l l m 2 ) 的细胞。f m 4 6 4p u n e t a 和p s d 一9 5 簇( c l u s t e r ) 共定 位的数目测量也使用上面类似的方法。 采用7 9d i v 的海马神经元转染a c t i n y f p ，在共聚集显微镜f 采用 t i m e 1 a p s e 的方法动态拍摄a c t i n y f p 荧光强度的变化。电场刺激装置是 把两根平行的铂电檄周定在灌流槽中，两根电极相距约1 0c m ，培养在玻 片上的细胞就放置存两根电极之间。正式试验前，用欧姆表测量两根电 极巾央电场的电压，确保能达到1 0v c m 。除非特殊说明，细胞一直用 e c s 在宦温下灌流。选取4 x4 的面积来定量分析单个神经曲张体 ( v a r i c o s i t y ) 或邻近轴突的荧光强度变化。 6 电镜 细胞在3 戊二醛( g l u t a r a l d e h y d e ) ，4 c 条件下固定2 0m i n ，戊_ 醛配制在o 1m 的磷酸缓冲液( p b ) 中。用p b 清洗( 5m i n 3 ) 后，1 _ j 1 o s 0 4 孵育6 0m i n ，丙酮梯度脱水( 5 0 ，7 0 ，9 5 ，1 0 0 3 ) ，常规电镜包埋( e p o n8 1 2 ) ，平行于玻片表面的方向切片( 6 0 8 0 n r r l ) ，捞于铺有f o r m v a r 膜的铜网上，钳一铀双染( 2 a q u e o u su r a n y l a c e t a t ea n ds a t o sl e a dc i t r a t e ) 后，n jj e o l1 2 3 0 ( b k y o ，j a p a n ) 电镜观 察。选择分析的突触要求边界清晰，结构完整没有破损。突触前细胞结 构鉴别根据以下几个特征：岔囊泡，并有高电子致密区的活性带，在活 性带邻近位置有突触间隙和突触后致密体( p s d ) 。搭靠( d o c k i n g ) 囊泡 材料s 方法 一般位于突触前膜( 活性带) 一个囊泡直径的距离( - - 5 0n m ) 【2 5 。分 别观察对照组、b d n f 组和e f s 组三个实验组。扫描电镜胶片生，制成 3 0 0d p i 的数字图像进行统计分析。 7 溶液的配置 转染用2 x h b s c h e m i c a l sm wm m g 1 0 0 m l h e p e s2 3 8 3 5 01 1 9 4 5 n a c l5 8 4 4 2 8 0 】6 3 6 3 2 n a 2 h p 0 4 2 11 2 0 1 7 8 0 5 1 50 0 2 6 7 1 p n = 7 0 7 ，a d j u s t e dw i t hn a o h 电生理记录的电极内液( i c s ) c h e m i c a l sm wm m g 1 0 0 m i k - g l u c o n a t e 2 3 4 21 3 6 53 1 9 6 8 k c l7 4 5 5 17 5 0 1 3 0 5 h e p e s 2 3 8 3l o0 2 3 8 3 m g c l 2 + 6 h 2 0 2 0 3 31 00 2 0 3 3 n a ，a t p 5 5 1 13o 1 6 5 3 3 n a g t p 5 2 3 20 3 00 1 5 6 9 6 e g t a3 8 0 3 5 0 20 0 0 7 6 】 d h = 7 2 7 3 。a du s t e dw i t hk o h ，o s m = 3 0 0 无镁细胞外液( e c s ) ： c d c 4 2 苈号彳卜导的突蚀前快速成熟机勃秘究 c h e m i c a l sm wm m 1 0 0 m l n a c l5 8 4 4 1 4 5 0 8 4 7 4 k c j7 4 5 53o 0 2 2 3 6 c a c l 2 1 4 7 030 0 4 4 l h e p e s2 3 8 31 00 2 3 8 3 g l u c o s e1 8 0 1 680 1 4 4 2 p h = 7 2 7 3 ， a du s t e dw i t hn a o h ， o s m = 3 0 0 f m 4 6 4 标记囊泡的高钾外液 c h e m i c a l sm wr a m g ，1 0 0 m l n a c l5 8 4 46 4 0 3 7 4 k c l7 4 5 59 0o 6 7 l m g c l 2 2 0 3 32o 0 4 0 8 g l u c o s e18 0 1 61 00 1 8 0 2 h e p e s2 3 8 31 00 2 3 8 3 c a c l 2 1 4 7 02o 0 2 9 4 p h 2 7 2 - 7 3 ， a du s t e dw i t hn a o h o s m = 3 0 0 免疫细胞化学用p b s c h e m i c a l sm wm m g 1 0 0 m l n a c l5 8 4 41 3 70 8 n a 2 h p 0 4 2 h 2 0 1 7 8 0 51 6 70 2 9 6 n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 1 5 6 0 51 8 5 82 9 溶于1 0 0m l 去离子水中，可能需要h c i 调p h = 7 4 ，高压灭菌，4 v 备 用。 电镜用p b ( p i i = 7 2 ) - 】9 材料s 方法 c h e m i c a l sm wm m g 1 0 0 m l n a 2 h p 0 4 2 h 2 0 1 7 8 0 5 2 0 13 5 8 1 k h 2 p 0 4 1 3 6 0 91 0 0 1 3 6 8 主要药品来源 药品名 来源 b 2 7 b a p l l a b d n f b i c u c u l l i n e c y td d l a p v d m e m d n q x f 1 2 e g t a f b s g l u t a m a t e h e p e s k 2 5 2 a k y n u r e n i ca c i d m k 8 0 1 n a 2 a t p t e t r o d o t o x i n ( t t x ) t o x i n b l i f et e c h n o l o g i e s ，g a i t h e r s b u r g ，m d s i g m a r & d s y s t e m s ， m i n n e a p o l i s ， m n s i g m a c a l b i o c h e m s i g m a l n v i t r o g e n s i g m a i n v i t r o g e n s i g m a h y c l o n e ，l o g a n ，u t s i g m a s i g m a c a l b i o c h e m s i g m a s i g m a s i g m a 河北水产研究所 c a l b j o c h a m 9 主要抗体，质粒和荧光染料的来源 2 0 c d c 4 2 信号靠导的突触前快速或熟执翻研究 抗体和荧光染料名来源 a c t i n y f p a n t i - m y c a n t i p s d 9 5 a n t i s y n a p t o p h y s i n a n t i v a m p 2 c y 3 f l u o r e s c e i n ( f i t c ) d n - c d c 4 2 g f p d n i h c g f p f m 4 6 4 r h o d a m i n e t r k b t 1 一g f p 10 主要实验仪器和软件 b db i o s c i e n c e s ，c l o n t e c h ，p a l oa l t o ，c a c h e m i c o n a f f i n i t yb i o r e a g e n t s ，g o l d e n c h e m i c o n a l o m o n e ，i s r a e l m o l e c u l a rp r o b e s m o l e c u l a rp r o b e s g i f t sf r o md rg b o k o c h m o l e c u l a rp r o b e s m o l e c u l a rp r o b e s ag i f tf r o md re c a s t r e n 仪器或软件名称生产一商 5 0 0 i x 7 1 激光共聚焦显微成像系统 o l y m p u s ，日本 f l u o v i e w 50 采集分析软什 b x 5 0 正置相差显微镜 o l y m p u s ，日本 c c de v o l u t i o nq e i m e d i ac y b e r n e t i c s 加拿大 ( m o n o c h r o m e ) e p c 9t r i p l e 放大器h e k a ，德国 l m a g e p r op l u s5 1 m e d i ac y b e r n e t i c s 加拿大 m x 7 6 0 四维微操纵器 s c i e n t i f i cd e s i g n ，美国 p a t c h m a s t e r 2 1 数据采集分析软件h e k a ，德国 2 1 材料与方法 p - 9 7 电极拉制仪 s u t t e ri n s ，美国 冰冻切片机型号c m l 9 0 0 l e i c a ，德国 循环泵型号l a n g e ，b t 0 1 1 0 0 河北保定 1 1 数据统计与分析 所有的电生理数据用软件p a t c h m a s t e r2 1 记录，再用该软件的 o n l i n ea n a l y s i s 功能或m i n i a n a l y s i s6 0 或i g o r4 0 软件进行分析处理。所 有免疫细胞化学和荧光数据一般用o l y m p u s 共聚焦显微镜自带软件 f l u o v i e w 采集，然后由i m a g e p r op l u s5 1 软件进行处理，处理的数据 全部在o r i g i n 7 5 或者e x c e l2 0 0 3 软件里面作图，结果用平均值标准误 ( m e a n s e m ) 表示，并根据不同的要求进行成对或组间，一检验。 d o