（遗传学专业论文）通过木质素调控改良杨树制浆性能的研究.pdf

中文摘要 木质素是一类酚类次生代谢产物，在植物体内行使重要的生理功能，但它却是形成造纸 污染的主要来源。利用基因工程手段，在分了水平调节木质素的生物合成，降低木质素的含 量或改变组分以培育适合造纸的植物原料树种具有较大的应用价值和环保效益。木实验主要 研究木质素合成途径涉及的两利啼h 关酶阿魏酸5 羟化酶( f 5 h ) 、咖啡酰辅酶a o 甲基转移酶 ( c c o a o m t ) 的基因对植物木质素生物合成的调节作用，取得如下进展： 1 以生长4 年的转反义c c o a o m t 基因的白杨杂种( 欧洲山杨与银白杨，p o p u l u st r e m u l a p o p u l u sa l b a ) 及野生型对照为实验材料，测定k l a s o n 木质素含量并分析了木质素组分，结 果表明转基因植株木质素含量经历4 个生长季后，依然比对照降低1 3 ，同时转基因植株木 质素组分的g s 比比对照轻微降低，约为2 ；对茎杆切片显微观察表明转基因植株中部分 导管向内凹陷，存在轻度变形；转基因植株与野生型对照在株高、胸径等外部生长形态上没 有明显差别。 2 通过对生长3 年的表达反义c c o a o m t 的转基因白杨杂种株系y a p c o a 3 8 及对照株 系进行纤维特性和制浆性能的研究与比较，认为经过转基因育种后，y a p c o a 3 8 的木材比重 略有增加；纤维宽度、纤维壁厚和壁腔比都较对照株系有所提高；纤维长度较对照略长，这 与转基因株系的纤维在0 6 1 m m 以上长度范围分布频率较高有关；从制浆性能上分析，转基 因株系在纸浆得率、聚合度、白度、成纸的物理强度等方面均得到改善；纸浆经过打浆处理 后，转基因株系的成纸白度、裂断长和撕裂指数均高于对照株系，表明其成纸的结合强度大 大提高。 3 通过r t p c r 分离了白杨杂种f 5 h 基因的伞长e d n a 序列；构建表达正义f 5 h 和反 义c c o a o m t 双基因的具有两个表达框架的载体a p f c 。农杆菌介导分别转化烟草和白杨杂 种，p c r 和s o u t h e r n 检测结果表明正义f 5 h 和反义c c o a o m t 双基因都已整合到烟草基因 组d n a 上；p c r 检测获得了2 9 株的转正义f 5 h 和反义c c o a o m t 双基因的白杨杂种。 关键词：杨树木质素制浆造纸c c o a o m tf s h a b s t r a c t l i g n i ni sap h e n o l i cp o l y m e ra n dp l a y si m p o r t a n tr o l e si np l a n t s ，b u ti st h em a i nr e s o u r c eo f p a p e r m a k i n gp o l l u t i o n t h u st h e r ei so fe c o n o m i c a la n de n v i r o n m e n t a li n t e r e s t si nc u l t i v a t i n g m a t e r i a l sw i t hg e n e t i c a l l ym o d i f i e dl i g n i nf o rp u l p i n gi n d u s t r y t h ee f f e c to ff 5 h o v e r e x p e r s s i o n a n dc c o ao m t d o w n r e g u a l t i o n ，w h i c ha r ei nt h el i g n i nb i o s y n t h e s i sp a t h w a y ，w e r es t u d i e di nt h i s p a p e r t h ef o l l o w i n ga r et h em a i np r o g r e s s 1 t r a n s g e n i cp o p l a r ( p o p u l u st r e m u l a p o p p l u sa l b a ) w i t ha n t i s e n s ec c o ao m tw a s p l a n t e di nf i e l df o rf o u ry e a r s t h ek l a s o nl i g n i nc o n t e n te v a l u a t i o ns h o w e dt h a tt h et r a n s g e n i ct r e e h a dal i g n i nc o n t e n td e c r e a s e db ya b o u t13 c o m p a r i n gt ot h ew i l dc o n t r o l ，w h i c hm e a n st h a tt h e d e c r e m e n to fl i g n i nc o n t e n tw a sm a i n t a i n e di n4 - y e a r - o l dt r a n s g e n i cp o p l a r t h el i g n i ns t r u c t u r e a n a l y s e sb yt h i o a c i d o l y s i sa n dg cd i s p l a y e dt h a tg sr a t i oi nt r a n s g e n i cp o p l a rw a ss l i g h t l y d e c r e a s e db ya b o u t2 c o m p a r i n gt oc o n t r o l ；h i s t o l o g ye x a m i n a t i o no fs t e ms e c t i o ns h o w e dt h a t m o s to fv e s s e l si nt r a n s g e n i ct r e ew e r er e g u l a rs i m i l a rt ot h a ti nw i l dc o n t r o l ，b u ts o m ev e s s e l si n t r a n s g e n i ct r e e sw e r ed e f o r m e dw i t hi n w a r ds u n kw a l l s ；t h e r ew e r en od i f f e r e n c ei np l a n th e i g h t a n ds t e md i a m e t e rb e t w e e n t r a n s g e n i ct r e e sa n dw i l dc o n t r o ld u r i n gf o u ry e a r so fg r o w i n g 2 f i b e rq u a l i t ye v a l u a t i o ns h o w e dt h a td e n s i t y , f i b e rw i d t h , r u n k e lr a t i oa n dc e l lw a l l t h i c k n e s so fy a p c o a 38w e r es l i g h t l yh i g h e rt h a nt h o s eo fc o n t r 0 1 y a p c o a 38h a das l i g h t l y s m a l l e rl u m e nd i a m e t e r ，w h i c hi sc o n s i s t e n tw i t hi t sb i g g e rd e n s i t y y a p c o a 38h a das l i g h t l y h i g h e rd i s t r i b u t i o nf r e q u e n c yo fl o n g l e n g t hf i b e r ( o v e ro 6 1 m m ) t h a nt h a to f c o n t r 0 1 k r a f tp u l p i n g a tl a b o r a t o r ys c a l ew a sd o n et ot h et r a n s g e n i ca n dw i l dc o n t r op o p l a r t h e p u l py i e l d sa n dc e l l u l o s e d e g r e e so fp o l y m e r i z a t i o no fy a p c o a 38w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h o s eo fw i l dc o n t r 0 1 t h e p u l p so fy a p c o a 3 8h a dl o w e rk a p p an u m b e r st h a nt h o s eo fc o n t r o lu n d e ra l lc o n d i t i o n s ，w h i c h m e a n st h a ty a p c o a 38h a dal e s sr e s i s t a n c et ok r a t td e l i g n i f i c a t i o n t h er e s u l t sf r o me v a l u a t i o no f h a n d s h e e t si n d i c a t e dt h a tt h eh a n d s h e e t sp r o d u c e df r o my a p c o a 38p u l ph a ds i g n i f i c a n th i g h e r t e a ri n d e xt h a nt h a to f w i l dc o n t r o l ，w h i c hm e a n st h a ti th a db e t t e rm e c h a n i c a lp r o p e r t i e st h a nw i l d c o n t r 0 1 a l s o ，t h eb r i g h t n e s so fy a p c o a 3 8h a n d s h e e t sh a das i g n i f i c a n th i g h e rv a l u et h a nt h a to f c o n t r 0 1 t h er e s u l t sd e m o n s t r a t et h ei m p r o v e m e n to fq u a l i t yo fh a n d s h e e t sm a d ef r o mt r a n s g e n i c p o p l a r ( y a p c o a 38 ) a l lt h e s ed a t ad e m o n s t r a t e dt h a td e c r e a s e dl i g n i nc o n t e n ti m p r o v e dt h e p u l p i n gp r o p e r t y , i n c l u d i n gi n c r e a s e dp u l p i n gy i e l d ，e a s i e rd e l i g n i f i c a t i o na n dh i g h e rc e l l u l o s ed e 3 w ei s o l a t e dt h ew h o l ef 5hc d n au s i n gr t - p c ra n dc o n s t r u c t e dv e c t o re x p r e s s i n gb o t h s e n s ef 5ha n da n t i s e n s ec c o ao m t w i t hv e c t o r , t h et r a n s g e n i ct a b a c c oa n dp o p l a r ( p o p u l u s t r e m u l axp o p u l u sa l b a ) w a so b t a i n e d p c ra n ds o u t h e r na n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a tb o t hs e n s e f s ha n da n t i s e n s ec c o a o m ta r ei n t e g r a t e di n t ot h et o b a c c og e n o m es u c c e s s f u l l y w eg o t2 9 p o s i t i v ec l o n e so f t r a n s g e n i cp o p l a r ( p o p u l u st r e m u l a p o p u l u sa l b a ) k e y w o r d s ：p o p l a rl i g n i np u l p i n g c c o a o m tf 5 h 缩写词 a m p ( a m p i c i l l i n ) 6 一b a ( 6 一b e z y l a m i n o p u r i n e 、 c a m v ( c a p l i f l o w e rm o s a i cv i r u s ) c c o a o m t ( c a f e o y l c o a3 一o m e t h y l t r a n s f e r a s e 、 c e f ( c e f a l o t h i ns o d i u m ) c t a b ( c e t y lt r i e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ) d i g ( d i g o x i g e n i n ) e b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) e d t a ( e t h y l e n e d i a m i n et e t r aa c e t a t e ) f 5 h ( f e r l x l a t e5 - h y d r o x y l a s e ) k a n ( k a n a m y c i n ) i b a ( 3 一i n d o l e b u t y r i ca c i d ) n a a ( n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) r p m ( r o t a t i o np e rm i n u t e ) r i f ( r i f a m p i c i n ) r n a i ( r n ai n t e r f e r e n c e ) r t - p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r ) s d s ( s o d i u md o d e c y ls 1 t l f a t e ) s s c ( s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e ) v b l ( v i t a m i n eb 1 ) z t ( z e a t i n ) 氨苄青霉素 6 苄基氨基嘌呤 花椰菜化叶病毒 咖啡酰c o a3 - 0 一甲基转移酶 头孢霉素 十六烷基三己基溴化铵 地高辛 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 阿魏酸5 羟化酶 卡那酶素 吲哚丁酸 萘乙酸 聚合酶链式反应 转分钊， 利福平 r n a 干扰 反转录p c r 十二烷基磺酸钠 标准柠檬酸钠盐 维生素b t 玉米素 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得 的成果。除文巾已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的作品成果。对木文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文巾以明确方式标明。本人 完伞意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 棒楠 日期：2 0 0 8 年4 月5 日 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完伞了解首都师范大学自关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并 向国家主管部门或其指定机构送交论文的电- 了版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的 的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行 检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名：林楠 日期：2 。8 年4 月5 日 第一章通过调控木质素的合成途径改良杨树的制浆性能 ( 文献综述) 木质素是一种复杂的酚类聚合体，它的出现与陆生植物直立生长的_ ) = i 性相关，是植物进化的 一种标志，在植物体内比重仅次于纤维素。木质素渗入到细胞壁中，主要沉积于一些特化细胞内， 如木质部的导管分予、厚壁组织和韧皮部纤维等，在维持槽物正常结构、疏导水分和养料、防御 机体不受病原菌侵害等方面起重要的作用。 木质素与人们的生产生活息息相关，与某些农艺性状也密切相关。例如木质素的含量和组 分与作物的抗倒伏相关；它作为黏合剂和各种添加剂成分也己广泛应用于化学工业巾；木质素具 有高热能，分了中的碳氢含量高达7 0 - - - 8 0 ，其内蕴藏丰富的能量，将来可能作为燃料替代品等。 然而木质素的存在也有一些负而效应，例如制浆造纸的中心环节是用大量化学品将原料巾的木质 素与纤维素分离，纤维素用于造纸，分离的木质素等成为制浆造纸工业的主要废弃物。木质素的 含量可以影响制浆生产及纸浆质量。降低木质素含量，可以改善造纸资源植物的制浆性能，并有 助于从源头减轻制浆造纸工业对环境的污染，降低造纸成本，利于更好地利用资源植物【。 随着转基因植物和突变体研究的不断深入及各利- 分析技术的进步和发展，木质素生物合成 途径在不断地完善巾。现就木质素组成、分布及其木质素生物合成调控研究进行详尽叙述，并对 近年来木质素生物合成及其调控的研究进展加以系统介绍，结合本实验工作对未来研究进行展 望。 1 木质素的组成与分布 1 1 木质素的组成 木质素是一利t 异质聚合体，主要由香豆醇、松柏醇和芥予醇三种单体组成，木质素的合成 从苯丙酸起始，经过一系列羟基化、甲基化、连接与还原反应，最终生成上述三种甲基化程度不 同的木质素单体。这些单体迸一步氧化聚合生成相应的- - 币1 木质素：对羟基苯基木质素( h ) 、紫丁 香基木质素( s ) 和愈创木基木质素( g ) 。这些木质素在植物体内通过多种键型连接在一起，形成结 构复杂的木质素聚合体【2 】。其巾植物木质素s g 的比值与纸浆生产工艺中木质素去除的难易程度 密切相关，g 木质素巾苯环c 5 处于游离状态，能自由地与其它键型结合，形成c c 键，这利- 键 型相比s 木质素巾所含的1 3 0 - 4 键而言，不易断裂，这种发生在c 5 位置上的c c 共价连接方式 l 苴签哑菹太堂硒j 金玄通过丕压蠢调控弦良扬挝剑越芏e 雎盥砥究 在裸了植物巾约占c c 键的2 5 ，而被了植物巾仅有1 0 ，因此裸了植物木质素降解要难于被 了植物3 l 。 随着各利- 分析技术的提高及多种突变体的发现，人们对木质素本质的认识日趋深入。自然 界巾木质素单体不仅仅以三种形式存在，另有一些其它形式的单体也参与木质素的聚合过程，如 许多植物巾存在一些乙酰化的木质素单体，在木质素组成中占有相当比例【4 ，5 1 。一些自由基偶连 反应的产物阿魏酸及其脱氢二聚体，也可能在草类植物木质素发生聚合反应时起到晶核作用1 6 i 。 人们在对转基因植物和突变体的研究r f l 发现，当植物的木质素合成途径受阻时，植物会合成一些 其它成分参与木质素的构建过程，以保证整个植物结构的完整性。如在c a d 活性缺失的转基因 植物r f l ，可检测到大量的羟基肉桂醛，这些醛类物质以1 3 0 - 4 方式与木质素单体偶连在一起，参 与木质素聚合过程。当c o m t 活性受到抑制时，芥了醇合成量减少，在终木质素聚合体巾可检 测到一些未甲基化的前体产物5 一羟基松柏醇【7 1 。可见木质素生物合成途径具有较大的可塑性，当 其正常合成代谢途径受阻时，会有其它次生代谢物填充到木质素构架巾，以保证植物体内输导和 机械支持系统的生理代谢功能不受影响。 1 2 木质素的分布 木质素的分布主要限于维管植物( 厥类植物、裸了植物和被了植物) ，主要沉积在输导组织( 如 导管或管胞) 、机械组织( 如纤维、厚壁组织等) 和保护组织( 如表皮) 的细胞次生壁巾，木质素的生 物合成受到窄间和时问的调控。在窄间上，从宏观意义上的植物类群到微观的细胞类型，其分布 遵循一定的规律。一般双了叶植物( 硬木) 巾的木质素主要由g 木质素、s 木质素和极微量的h 木 质素组成。裸了植物( 软木) 的木质素则以g 木质素为主，同时含有少量h 木质素和微量s 木质 素。草木植物( 单子叶植物) 中的木质素主要由g 和s 木质素组成，同时含有少量h 木质素。木 质素分布在不同类型细胞中也呈现出一定的特点，如裸予植物黑皮云杉的筛管次生壁富含g 木 质素，而胞间层细胞以h 木质素为主：被了植物白桦的纤维细胞和射线细胞次生壁巾以g 和s 木 质素为主，其导管细胞巾却含有大量的g 木质素【引。木质素在细胞巾这种相对固定的分布模式与 细胞在植物整个生命活动中的具体生理功能密切相关。 木质素沉积发生在特定时期，即细胞生长完成、细胞次生壁加厚的时期【9 j ，植物细胞壁的总 体结构在木质化发生之前就已大致形成，木质素单体从细胞质转运到细胞壁巾。电子显微镜观察 表明，木质素合成起始的位点远离胞质和质膜。随后，这些细胞壁位点上形成木质化结构域穿过 细胞壁的各层物质不断向内延伸，最终融合在一起。 木质素整个沉积过程巾，三种单体合成呈现一定的时序性。如在松树的细胞壁分化初期，主 2 苴壑哑范太堂亟i 盒塞道过丕厦蠢退控弦良扬控剑鏊芏e 能的班究 要是肉桂醇在胞i 、h j 层和细胞角隅处杉c 积，其次松桐醇先在胞问层和细胞角隅分布，然后扩展到次 生壁t l ，芥了醇的形成发生在木质化进程晚期，主要分布存次生壁内层【l 引。由此1 i j 见，木质素的 沉积表王见出明显的时窄性，控制这一过程的发生机制至今还不清楚，可能与三种木质素合成相关 酶时卒表达特性的交互作用有关，或者取决于单体术质素向细胞壁输送的动力学反应，也可能受 制于木质素单体与木质素聚合体间的耦联反应机制。 上述这种分布的时卒格局也并非一成不变，在特殊条件下会发生相应的改变，以应付外界环 境的刺激。人们用显微放射自显影技术对松树的受压木巾木质素的沉积过程进行研究时发现，虽 然管胞r f l 木质素的沉积顺序与正常木相同，即h 单元先沉积，其后依次为g 和s 。但是一些木 质素单元的沉积区域发生改变，在正常木中h 木质素主要分布于胞问层，而在受压木中它在次 生壁中也有积累，并且受压木巾h 和g 单元的沉积时期较正常木延长【】。由此可知，植物体内 的木质化进程是一个极其复杂的生化动态过程，木质素的生物合成受空间、时间、某些外界环境 条件以及一些未知因素的多元化综合控制。 2 木质素生物合成调控研究 近年来，植物木质素生物合成调控研究主要是通过调节其巾关键酶的表达，达到改变木质 素生物合成的目的。从调控的效果看，可以分为三类。( 1 ) 苯丙酸途径的调控，有p a l 、c 4 h 和 4 c l 。抑制它们的表达可有效降低木质素含量；( 2 ) 木质素单体特异合成相关的酶，主要有c o m t 、 c c o a o m t 和f 5 h 。抑制它们的表达，不仅降低木质素含量，还影响木质素单体的组成比例；( 3 ) 木质素单体特异合成途径下游酶类，包括c a d 和c c r 。对他们的调控主要影响木质素单体的组 成。另外，近年出现一些木质素单体聚合酶的相关研究，如过氧化物酶等【l2 1 。由于至今还不清楚 其在木质素聚合过程中的具体功能，应用于木质素调控尚不多。 2 1 苯丙酸途径的生物调控 苯丙酸途径起始于p a l 催化的酶促反应，为连接莽草酸和苯丙酸途径的关键酶。抑制烟草 中p a l 活性，木质素含量降低，对植物的生长产生不良影响【i3 1 。苯丙酸途径与许多次生代谢产 物的合成密切相关，其调控不仅改变木质素生物合成途径，还可能影响其它次生代谢物的合成， 易影响植物的性状。c 4 h 催化肉桂酸向香豆酸的转化，在该酶活性受抑制后，转基因植株木质素 含量减少，植物生长无异常现象发生【1 4 1 6 1 。d i x o n 等与l i 等推测c 4 h 可能存在于酶复合体 或其他代谢通道中，调控s 木质素的生物合成。4 c l 是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的 关键酶，将羟基肉桂酸乙酰化生成羟基肉桂酰一c o a 酯。在拟南芥、烟草【2 0 j 和颤杨中研究表 3 苴都哑菹太堂亟论玄通过丕匾嚣通控兹岜扬垄生制邃e 鹾的班究 明，抑制该酶表达会使木质素含量下降。且转基因颤杨生长加速，纤维素含量明显增加。然而木 实验室获得的转基因毛白杨，并未发现4 c l 活性受到抑制后植株生长加快的现象，纤维素的含 量亦无明显变化【2 2 1 。木质素与纤维索之r j 4 谢补偿机制是否在植物巾普遍存在还有待进一步探 讨。k a j i t a 等1 2 3 1 用抑制4 c l 的转基因烟草进行制浆类似实验，结果木质素易去除，化学品耗用 量少，纸浆产量增加，可见4 c l 是较为理想的用于改良造纸原料植物的目标基因。 2 2 与木质素单体特异合成相关酶的生物调控 有3 种酶与木质素单体的特异合成有关：c o m t 、c c o a o m t 和f 5 h 。过去对抑制c o m t 表达的转基因研究比较多。在大多数c o m t 受抑制的转基因植物巾，木质素含量变化不明刷2 4 2 5 】； 只有个别转基冈植物在c o m t 活性被抑制到足够低时，木质素含量减少2 6 1 。c o m t 并不影响碳 向木质素的转化，c o m t 主要影响s 木质素的生物合成。l a p i e r r e 等【2 4 】对c o m t 活性仅存1 0 的转基冈杨树进行制浆实验，由于木质素结构致密，制浆效率很低。 c c o a o m t 研究较晚，其表达受到抑制，木质素含量下降，s g 比值升高2 6 2 8 1 ，c c o a o m t 可能特异调控g 木质素的合成。z h o n g 等【2 8 1 用傅立叶转换红外光谱对木质素含量下降的转基因 杨树进行分析，发现木质素结构变得疏松，键问的连接也相对松散，预示制浆巾脱木质素相对容 易。本研究组获得的生长3 年的转反义c c o a o m t 基因杨树，木质素含量下降约1 3 ，化学制浆 实验表明细浆得率增加，同时可减少碱用量，纸的质量也明显改善。c c o a o m t 也是理想的改良 造纸树种的目标基因。 突变体和转基因植物研究发现，f 5 h 对s 木质素合成起限速作用1 2 9 , 3 0 。在f 5 h 活性缺失的 拟南芥突变体中，仅含有微量的s 木质素；将f 5 h 在该突变体巾过量表达时，转基因植物巾的 木质素基本上都是由s 木质素组成的【3 l 】。同样将该基因导入正常植株并表达，也会使s 木质素 含量增多，且组织分布特异性消失3 0 1 。f 5 h 对于植物木质素的组分改造具有重要应用价值，增加 f 5 h 表达，提高s 木质素在木质素总量中的比例，对纸浆生产极为有利。对转c 4 h - f 5 h 基因的 杨树进行制浆实验，增加纸浆产量，减少了分离木质素的化学品投入，具潜在的经济和环保效益 【3 2 1 。 2 3 木质素特异合成途径下游酶类的生物调控 c c r 催化羟基肉桂酰c o a 酯向相应的醛转化，是潜在的碳向木质素分配的控制关节点。抑 制该酶表达，木质素含量降低，同时一些非正常的酚类物质增加阮3 4 1 ，但这些物质并不参与木质 素的聚合过程。部分转基因株系生长畸形。木质素组巾s 与g 含量均降低，说明c c r 非特异地 4 苴盔哑范太堂亟主j 金交 道过丕厦蠢调控兹良扬拦制盗芏e 能的班盔 参与s 或g 木质素的合成过程。 c a d 参与木质素单体合成的最后一步还原反应。转基因植物研究巾，c a d 活性受到抑制， 植株生长正常，木质素含量变化不明显，s g 比值的影响也不大，但会自弪基肉桂醛的积累。这 些醛类物质通过自由基偶联反应与其它木质素成分交连，成为木质素组成部分。这利- 结构改变利 于脱木质素的生产工艺【3 5 】。 综上所述，结合本课题组的研究结果，我们认为以不影响植物正常生长为前提，以降低木 质素含量、改变木质素组分及提高制浆效率为目标，c 4 h 、4 c l 、c c o a o m t 、f s h 和c a d 是 较为理想的用于造纸原料植物品质改良的目标基因。 3 近年来木质素生物合成及其调控的研究进展 木质素是一种异质聚合体，主要由香豆醇、松柏醇和芥子醇三科单体组成。木质素合成以苯 丙酸起始，经过一系列羟基化、甲基化、还原反应最终生成上述三种甲基化程度不同的木质素单 体。单体经氧化聚合生成相应的三种木质素：对羟基苯基木质素( h ) 、紫丁香基木质素( s ) 和愈创 木基木质素( g ) 。木质素在植物体内通过多利t 键型连接在一起，形成结构复杂的木质素聚合体1 2 1 。 上个世纪9 0 年代，许多研究已经揭示了木质素生物合成途径的轮廓。随着对转基因植物和 突变体研究的不断深入以及各种分析技术手段的进步，研究者对已知的木质素生物合成途径不断 进行修 3 6 , 3 7 , 3 8 , 1 7 ，主要体现在对一些酶的功能的重新认识。目前比较公认的木质素合成途径如 图1 一l 所示i ”l 。下面重点介绍近两年来新发现或提出的问题，主要集中与下述三个方面： c i n n n m a t e _ 一i 岫m j l a l n n l r m c 倔l p a l 4 一c o 帅_ r o 蝴c o c 吸 4 - 4 e m 硼d o h y d o c d 0 螂 4 - c o u m n m r y la l c o h o l + 甓慧 p - h y d r o x y p h e n y l ( h ) u n i t 图1 1 啪e a f o j t f o r u l 吲c 孓呐哪r 圳口叫c o as m m p o y lc o & c c 丑c c 置c c r ? o a l c o m t 咖5 - h 州r 掣一c 嗍t 咖a 蚋a l d e h y d e + c o 嗍甜刮- 科可啊+c o n i f o r o l d e h y d e - _ m m m p m c x - 1 k $ 4 0 c 柚js 加c a d 0 s 加 c x d + s a i d c 町叫出州望驾c 二咖。m i 嗒_ i u i5 帅二。嘲喇骘! _ 唧畸岫h 哪 甓：罂 疵曲州 0 它器窖。 k t c a 觯 l i 嘲 g u a i a c y l ( g ) u n i t s y r i n g l ( s ) u n i t 5 木质索的牛物合成途径( b a u c h e r 等1 3 9 11 苴都哑范太堂亟j 金奎通过丕匾塞调控兹良扬挝制鏊性能的班究 p a l ：笨内氨峻解氨酶( p h e n y l a l a n i n e am m o n i a l y a s e ) ：f 5 h ：阿魏酸5 羟化酶( f e r u l a t e5 h y d r o x y l a s e ) ：c 4 h ： 肉桂峻- 4 一羟化酶( c i n n a m a t e4 - h y d r o x y l a s e ) ；c c h ：香可酰c o a 一3 一羟化酶( c o u m a r o y l c o a3 - h y d r o x y l a s e ) = 4 c l ：4 香百酸：c o a 连接酶( c o u m a r a t e ：c o al i g a s e ) ；c c o a o m t ：咖啡酰c o a3 o 甲基转移酶( c a f e o y l - c o a 3 o - m e t h y l t r a n s f e r a s e ) = c 3 h ：香再酸一3 一羟化酶( c o u m a r a t e3 - h y d r o x y l a s e ) c c r ：肉挂酰c o a 还原酶 ( c i n n a m o y l c o ar e d u c t a s e ) ；c o m t ：咖啡酸一3 一。甲基转移酶( c a f f e i ca c i d 3 - 0 m e t h y l t r a n s f e r a s e ) ；c a d - 肉桂酰乙醇脱氧酶( c i n n a m o y la l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ) ；p e r o x i d a s e - 过氧化物酶；l a c c a s e ：漆酶；? ，该反 应涉及的酶类末知；? ? ，有待验证的发生途径 3 1 肉桂酸一3 羟基化酶( c 3 h ) 介导的羟基化反应 以前对c 3 h 研究不很清楚，直到最近才有了突破性认识。s c h o c h 等1 38 1 分离c y p 9 8 a 3 基因， 推断它可能编码c 3 h 酶蛋白。f r a n k e 等【4 0 1 从拟南芥巾分离得到r e f 8 基因，并证实该基因编码 c 3 h ，属于c y p 9 8 a 3 基因成员，是一种细胞色素p 4 5 0 单氧化物酶。a b d u l r a z z a k 等】手艮道了另 一个c y p 9 8 a 3 突变体，比r e f 8 突变体生长发育与细胞生长的抑制更为强烈。该突变体巾木质 素含量降低，羟苯基( p h y d r o x y p h e n y l ) 组分在木质素聚合r f l 含量很高，仅含有痕量的g 与s 组分， 细胞生长减弱。反义抑制c y p 9 8 a 3 表达，木质素含量下降4 0 ，植株畸形，木质素结构发生与 突变体体相同的改变。r a l p h 等1 4 2 1 报道了苜蓿c 3 h 突变体，n m r 结果显示木质素单元间的连接 被改变：在c 3 h 缺失的突变体巾，没有检测到正常植株巾的木质素b 1 连接。 3 2 咖啡酸一。一甲基转移酶( c o m t ) 和阿魏酸5 羟基化酶( f s h ) 的底物特异性 以前认为f 5 h 羟基化和c o m t 甲基化主要发生在羟基肉桂酸水平。o s a k a b e 掣3 8 】早在1 9 9 9 年就认为f 5 h 和c o m t 所介导的g 向s 木质素转化合成过程可以在醛的水平上进行，但未引起 重视。h u m p h r e y s 等p7 l 同样证明，将拟南芥f 5 h 编码的酶对松柏醛和松柏醇的亲和力是阿魏酸 的上千倍，表明f 5 h 优先催化的底物是松柏醛和松柏醇。f 5 h 催化生成的产物5 一羟基松柏醛和 5 一羟基松柏醇是c o m t 优先催化的底物【3 6 , 3 7 , 4 3 】。对上述研究的重新认识，促使对木质素生物合成 途径的修正，认为f 5 h 羟基化和c o m t 甲基化主要在肉桂醛或醇的水平上进行。 3 3 肉桂醇脱氢酶( c a d ) 与芥子醇脱氢酶( s a d ) l i 等他1 对颤杨( 尸t r e m u l o i d e s ) 研究认为，存在两个c a d 酶，p t s a d 在富含s 木质素的韧皮 纤维巾高水平表达，对芥予醛表现出特异的催化活性；而p t c a d 主要定位于g 木质素沉积的木 6 苴都哑范太坐亟j 金玄通过丕厦蠢调控弦良扬挝制鏊芏e 能的班窥 赝部区域，对松柏醛有很高的催化活性，s a d 和c a d 特异参与不同细胞类型巾s 与g 木质素的 合成。然而，a n t e r o l a 和l e w i s i 。3 i 发现，c a d 活性受剑抑制时，s 和g 小质素含量同时减少，s g 比值降低，认为植物体内并不存在一种与芥j r 醇合成相火的特异脱氢酶，被了植物体内的g s 木质素合成途径巾的还原反应f f l j 能是受c a d 同工酶催化，s a d 基因可能是被了植物进化过程巾 引入外源基因的结果。可见木质素合成是一个极其复杂的生化调控过程，相关酶类的具体生理功 能还需要深入研究。 4 展望 4 1 木质素组份改变 木质素的存在虽然不利于制浆造纸，但对植物体本身具有重要的生物学意义。木质素含量 降低到一定程度，必将影响植物正常生长发育特征，削弱植物对外界环境的抵缃 l l r l j h 她i 己力。因此对造 纸植物木质素的调控，仅着眼于含量的降低，存在着植物忍受极限的问题。木质素组分的改变也 有利于制浆过程巾木质素的脱除，如增加f 5 h 的表达，可以提高木质素中s g 比值，即使木质 素总含量没有明显降低，仍可显著改善制浆性能。调控另外一些酶的表达，可以造成特殊单体参 与木质素的聚合，如抑制c a d 的表达，s g 比值保持不变，但会有特殊羟基肉桂醛的积累，并 参与木质素聚合，结果木质素结构疏松，利于制浆造纸【3 5 1 。但也有观点不同的报道，r e d d y 等f 4 4 1 对通过反义r n a 分别抑制c 4 h 、c 3 h 、f 5 h 基因表达的苜蓿研究后，认为降低木质素含量的确 可以提高反刍动物可消化率、改善牧草的饲用品质，但是木质素的组份改变并没有带来相应的改 良，以此推断木质素组份改变也不会带来木材造纸性能的改良。目前还没有木质素改变的造纸树 种用于制浆的实验报道，因此明确回答这个问题需要更多的实验证据。 4 2 木质素特异性表达启动子的使用 在不同木质素调控研究中，使用组成型表达与木质部特异表达启动子均可有效调节总木质 素的生物合成。虽然，组成型启动子与特异性启动予的表达效率不同，目前尚不能确定启动予的 表达效率与抑制程度密切相关。但转基因植物的实际应用不仅要求降低木质素含量、改变木质素 组分，而且要保持该植物原有的抗逆性，如抗病性、抗倒性等。使用木质化部位特异性表达的启 动了，比使用组成型启动予更有利于保持植物固有的生长发育特征。木实验室前期的研究中，使 用c a m v3 5 s 启动予，下调c c o a o m t 与4 c l 基因表达，均获得木质素含量下降1 0 以上的转 基因株系。在我们可控的小规模田问扩繁巾，多数转基因植株表现为生长发育正常。但我们不能 7 苴都匝范太堂亟论玄通过丕压蠢诅控馥良扬越制邃芏e 篮的班荭 确定多年大规模田间推广的实际种植是否会影响其正常生长发育。由于目前转基冈改良的此类树 种还没有得到生产释放，还不能明确回答是否特异件启动了优于组成型启动了。我们认为，从植 物自身生长发育考虑，前者优于后者。 4 3 转基因植株多年连续的跟踪检测 植物体内木质素的积累是一个渐进连续的过程。本实验室前期的研究巾对c o m t 、c c o a o m t 及4 c z 基因进行时窄性表达分析，均表现为在一个生长季巾双峰表达的特征，对应于春材与晚 材的形成。这个表达特征是否影响木质素的调控，还没有确切的实验证据。p a t t e n 掣4 5 1 对t r x 4 ( c c r ) 拟南芥突变体进行了重新研究，从苗期到衰老伞生育期进行了木质素组分与茎横切片组织化学分 析，认为i r - x 4 发育迟缓，间接的影响木质素合成，造成木质素含量降低1 0 1 5 。但在生长后 期g s 比例与野生型无明显差异。尤其是没有检测到非正常前体参入到木质素的聚合。该结果与 以前j o n e s 等【4 6 峙艮道的不同。p a t t e n 等【4 5 1 认为应该检测目标材料的伞生育期，而不是局限于一个 生育时期来鉴定分析一个目标基因对木质素生物合成的影响。造纸树种是多年生植物，日前还缺 乏对转基因树利- 多年连续的跟踪检测，也就不能明确木质素含量与组分的改变在多个生长季后的 变化规律。对这个问题的阐明，需要多年的实验数据。 4 4 多基因共整合载体 多基因共整合载体是将多个与木质素合成相关的基因整合到一个表达载体上，再导入植物。 现已有几个实验室开展这方面的尝试，多数结果表明，同时抑制多个基因的表达，具有加和效应。 z h o n g 和我们的研究均证实c o m t 和c c o a o m t 反义基因通过共整合载体的方式导入烟草巾， 除木质素总量下降外，s 木质素减少得更多 2 7 , 2 5 1 。c h i a n g 实验室将反义4 c l 基因和正义丹基 因同时导入颤杨巾，转基因植株木质素含量减少5 2 ，s g 提高6 4 ，同时纤维素增加3 0 ，而 植株生长并无异常表现h 7 1 。与抑制单个基因表达相比，利用共整合载体能更有效地调控植物体内 木质素合成途径，并提供木质素合成途径相关的更多信息。 4 5 植物自身特异转录调控因子应用 研究表明，对苯丙酸与木质素的合成过程以在转录水平上加以调控。在许多参与苯丙酸合成 代谢途