（微生物学专业论文）碱性蛋白酶高产菌株的选育与酶学性质研究.pdf

摘要 摘要 碱性蛋白酶是一类在生理上、商业上非常重要的酶类。现己广泛应用于洗涤剂、制 革及丝绸工业，在医药、食品、环保、银回收、基础研究等领域显示了广阔的应用前景。 因此，不断提高碱性蛋白酶生产菌株的发酵活力，大力开展碱性蛋白酶的相关研究有着 非常重要的意义。利用复合诱变原生质体技术选育工业新菌种，是一种行之有效的方法， 近年来受到国内外普遍重视。 本实验出发菌株为地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n 折o r m & ) s 2 3 ，其碱性蛋白酶活力为 2 0 3 8 7u m l 。本文采用原生质体复合诱变进行菌种选育，并对发酵条件、酶的纯化方法 和酶学性质进行了研究。主要研究内容如下： 1 研究了青霉素、溶菌酶、甘氨酸和渗透压稳定剂等因素对原生质体形成和再生 的影响，得出原生质体形成及再生最佳条件为：甘氨酸1 m g m l ，青霉素0 4 u m l ，加 入时间为对数生长中期；溶菌酶添加量2 m g m l ，作用温度3 7 。c ，作用时间6 h ；稳定剂 为琥珀酸钠，再生培养方法为平板双层法。原生质体形成率和再生率分别达到9 3 8 和 3 7 5 。 2 研究了原生质体紫外线单因素诱变和u v - e m s 复合诱变，最佳实验条件：紫外 线单因素处理剂量为3 m i n ：紫外线u v - e m s 复合诱变剂量为u v 照射1 m i n ，e m s 浓度 为3 0 m g m l ；孢子加热选育实验条件为温度8 0 。c ，处理时间2 0 r a i n ，7 葡萄糖肉汤培 养基交替处理。经多次诱变选育，从大量突变株中筛选到一株稳定高产的碱性蛋白酶产 生菌s h 一5 9 ，其活力达到3 2 3 5 6 , u m l 。 3 对高产菌株s h 5 9 进一步进行了发酵培养基的优化实验，分别研究了碳源、氮 源、各种无机盐、培养基起始p h 对产酶的影响，并采用正交实验方法，探索了培养基 各组成成分对发酵产酶的影响。确定最佳培养基( ) 为：玉米粉6 5 ，豆饼粉4 0 ，k h 2 p 0 4 0 0 4 ，n a 2 h p 0 4o | 3 ，c a c l 20 4 ，p h 9 0 。同时对摇瓶发酵工艺进行了研究，分别试验了种 龄、接种量和装液量对产酶的影响，绘制了发酵过程曲线。确定最适发酵条件为：种龄 1 2 h ，接种量2 ，装液量2 5 m l 2 5 0 m l ，摇床转速2 1 0 r r a i n ，培养温度3 7 。c ，发酵周期 4 4 h 。酶活达到3 8 9 2 5l a m l 。 摘要 4 ，对高产菌株s h 一5 9 碱性蛋白酶纯化方法进行了研究。发酵液经硫酸铵分级盐析 获得粗酶，再由d e a e s e p h a d e x a 一5 0 及c m s e p h a d e x c 一5 0 层析等方法对酶进行了纯 化，s d s p a g e 表明纯化后的样品己达到电泳纯，分子量为2 8 k d a 。 5 对酶的性质进行了研究。当以酪蛋白为底物时，该酶的最适p h 为1 0 0 ，最适 温度为5 5 。c 。此外，该酶在p h 7 1 1 的范围内稳定，在5 0 。c 以下有较好的热稳定性，对 1m o l l h 2 0 2 具有一定的耐氧化性。 关键词地衣芽孢杆菌；原生质体；碱性蛋白酶；发酵条件；性质 i 】 a b s t r a c t a b s t r a c t a l k a l i n ep r o t e a s e sa r eap h y s i o l o g i c a l l ya n dc o m m e r c i a l l yi m p o r t a n tg r o u po fe n z y m e s i th a sb e e na p p l i e du n i v e r s a l l yt oi n d u s t r i a lo fd e t e r g e n t s ，l e a t h e rp r o c e s s i n ga n ds i l k b e s i d e s ， i th a saw o n d e r f u lp r o s p e c to fa p p l i c a t i o np o t e n t i a li nm e d i c a lp u r p o s e ，f o o dp r o c e s s i n g ， s i l v e r r e c o v e r ya n de n v i r o n m e n tp r o t e c t i o n ，a sw e l la sb a s i cr e s e a r c h t h e r e f o r e ，i t i s i m p o r t a n tt oi m p r o v et h ee n z y m ea c t i v i t yo ft h es t r a i n so fp r o d u c i n ga l k a l i n ep r o t e a s e c o n t i n u o u s l y t h ec o m p l e xm u t a g e n e f i ct r e a t m e n t s0 1 1p r o t o p l a s t sa r eak i n do fe f f e c t i v e m e t h o dt og e th i g h o u t p u ts t r a i n s t a k i n gb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s $ 2 3a st h ei n i t i a ls t r a i n ，i t se n z y m ea c t i v i t yi s2 0 3 8 7 9 m l l l a ec o m p l e xm u t a g e n e t i ct r e a t m e n t so np r o t o p l a s t sw e r eu s e di nt h i ss t u d y t h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，t h em e t h o do fp u r i f i c a t i o na n dp r o p e r t i e so f a l k a l i n ep r o t e a s e sw e r es t u d i e d t h e m a i nc o n t e n t so f t h es t u d yw e r e 嬲f o l l o w s ： 1 a l lf a c t o r se f f e c t i n go nf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t sw e r es t u d i e d t h e s e f a c t o r si n c l u d ep e n i c i l l i n ，l y s o z y m e ，a m i n o a c e t i ea c i da n ds t a b i l i z e r s u n d e rt h eo p f i m u l n c o n d i t i o n so fp r o t o p l a s t sf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o n ，t h ep r o t o p l a s t sf r o mt h eo r i g i n a ls t r a i n $ 2 3w e r ep r e p a r e d t h eo p t i m a mc o n d i t i o n sw e r ec o n f i r m e d ：a m i n o a c e t i ca c i dl m g m l ， p e n i c i l l i n0 4 9 m l ；l y s o z y m e2 m g m l ，t e m p e r a t u r e3 7 * c ，t i m e 6h o u r s t h er a t e so f f o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t so fs t r a i n $ 2 3h a dr e a c h e dt o9 3 8 a n d3 7 5 r e s p e c t i v e l y 2 t h ec o m p l e xm u t a g e n e t i ct r e a t m e n t so np r o t o p l a s t sw e r es t u d i e d t h eo p t i m a n l c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：t h ed o s a g eo fu l t r a v i o l e ti s3m i n u t e s ( s i m p l et r e a m e n t ) ；t h e d o s a g eo f u l t r a v i o l e ti si m i na n dt h ec o n c e n t r a t i o no f e m s i s3 0 m g m l ( c o m p l e xt r e a t m e n t s ) t h es p o r ew e r eh e a t e da t8 0 。cf o r2 0m i n u t e s a f t e rs e v e r a lc o m p l e xm u t a g e n e t i ct r e a t m e n t s o np r o t o p l a s t so fs t r a i n $ 2 3a n dal a r g ea m o u n to ft h er e g e n e r a t i v em u t a n t s ，as t a b l em u t a n t s h 一5 9p r o d u c i n gh i 曲- o u t p u ta l k a l i n ep r o t e a s ei so b t a i n e d t h ee n z y m ea c t i v i t y i s 3 2 3 5 6 9 m l 3 t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dt h ec o n d i t i o n so fah i g hy i e l ds t r a i np r o d u c i n gh i g h a l k a l i n ep r o t e a s ew e r es t u 出e d t h em a i nc o m p o n e n t so ft h em e d i u mw e r es u b s t i t u t e d t h e o p t i m u mm e d i u mw e r ec o n s i s to f ：6 5 c o i t if l o u r , 4 o s o y b e a nf l o u r , 0 0 4 k h 2 p 0 4 ，o 1 n a 2 h p 0 4 ，0 4 c a c l 2 ，p h 9 0 t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ec o n f i r m e d ：s e e d a g e1 2 h i n o c u l u mv o l u m e2 ，a2 5 0 m if l a s kc o n t a i n i n g2 5 m lm e d i u m ，2 1 0 r r a i n ，3 4 。c a n d t h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t yr o s eu pt o3 8 9 2 5 v i r a la sc o m p a r e dw i t h2 0 3 8 7 9 m lo f t h eo r i g i n a l i i i a b s t r a c t s t r a i na f t e rc u l t i v a t e d4 4 1 1 4n ea l k a l i n ep r o t e a s ew a sp u r i f i e df r o mt h ec u l t u r eo fb a c i l l u sl i c h e n i f o m a i ss h 一5 9b y m e a d so fa m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t m i o n f o l l o w e d b yd e a e s e p h a d e x a 一5 0 a n i o n e x c h a n g e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , c m s e p h a d e x c 一5 0h y d r o x y a p t i t e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i f i e dp r o t e i n a s ew a sd e m o n s t r a t e dt ob ee l e c t r o p h o r e t i ch o m o g e n e i t y b ys d s p a g e ，w i t ham o l e c u l a rw e i g h to f 2 8 k d a 5t h ep r o p e r t i e so ft h ea l k a l i n ep r o t e a s ew e r es t u d i e d t h eo p t i m u mp ha n dt e m p e r a t u r e t o w a r dt h eh y d r o l y s i so f c a s e i nw e r ep h1 0 0a n d5 5 。c t h ea l k a l i n ep r o t e a s ev c a ss t a b l eu pt o 5 0 。c i n t h e p hr a n g e f r o m7 - 1 1 i n a d d i t i o n ，i tc a n r e s i s to n l m h 2 0 2 k e y w o r d s ：b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ；p r o t o p l a s t s ：a l k a l i n ep r o t e a s e ；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n p r o p e r t i e s 河北大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所早交的学何论文，是本人在导师指导r 进行的研究一l 作及取得的研究成果。 尽我所知除r 文中特别加以标沣和致谢的地方外，论丈中不包含其他人已经发表或撰写的研究成 粜，也小包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同上作的同，。 对本研究所做的任何贡献均己在论文r p 作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：日期：丞些年上月之h 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北人学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部j 或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属丁 i 、保密口，在年一片曰解密后适用本授权声明。 2 、不保密曰。 ( 请在以上相应方格内打“”) 作者签名： 导师签名： l j 期：翌! 年生月一堑e 日期：杉竖年月上二日 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 碱性蛋白酶的性质 碱性蛋白酶( a l k a l i n e p r o t e a s e ) 是指在p h 值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类。 碱性蛋白酶除可催化蛋白质水解为氢基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的合成。 1 1 。l 碱性蛋白酶的一般性质 微生物碱性蛋白酶的作用p h 值般在7 - 1 1 范围内有活性。在以酪蛋白为底物时的 最适p h 多在9 5 1 0 5 范围内，这些酶除可以水解肽键外，还具有水解酯键、酰胺键和 转酯及转肽的能力。 多数微生物碱性蛋白酶不耐热，在5 0 6 09 c j j h 热1 0 - t 5 r a i n ，几乎一半酶的活性下降 5 0 ，只有费氏链霉菌( s f r a d i a e ) 与立德链霉菌( s m c t u s ) 等所产碱性蛋白酶经7 0 。c 处理3 0 m i n ，酶活性仅损失1 0 1 5 。我国生产的几种碱性蛋白酶的耐热性也在6 0 以 下。碱土金属，特别是钙对碱性蛋白酶有明显的热稳定作用。 1 1 。2 酶的结构和活性中心 碱性蛋白酶的分子量在2 0 ，0 0 0 3 4 ，0 0 0 之间，等电点多为8 - 9 。 大多数微生物碱性蛋白酶作用于肽链，生成二个肽。除酶本身的氨基酸残基外，不 具有特定的活性基团，酶发挥作用时不需要特定的激活剂，丽需要金属离子激活，如除 去金属离子就不能作用，必需的金属离子有m n 2 + 、m 矿+ 、z n 2 + 、c o “、f e 等。 碱性蛋白酶属丝氨酸蛋白酶，除二异丙基氟磷酸( d f p ) 夕b ，苯甲磺酰氟( p m s f ) n 其 它磺酰卤化物，以及来自马铃薯、大麦、大豆的蛋白酶抑制剂可引起碱性蛋白酶的失活。 1 1 t 3 碱畦蛋白酶的专一陛 碱性蛋白酶的专一性决定于其自身结构，当它与不同底物结合时，首先形成一个非 共价的酶一底物复合物，它们靠物理引力维持在一起，接着丝氨酸的羟基对底物发起攻 击产生四面体中间产物，然后中间产物破裂，形成酶一产物复合物。 微生物碱性蛋白酶具有强烈的酯酶活性，可水解甲苯磺酰基精氨酸甲酯( t a m e ) 和 各种对硝基苯基酯。枯草杆菌( b s u b t l i s ) 蛋白酶最佳的合成底物是乙酰基酪氨酸乙酯。 城陛蛋白酶的专性强烈地受到切开点两例氨基酸残基，尤其是p i - p 。氨基酸的影响， 。1 河北大学理学碛士学位论文 因此对天然底物的专一性甚广，它对酪蛋白的作用比对血红蛋白或牛血清蛋白更容易。 根据微生物碱性蛋白酶对切开点羧基侧的专一性可将其分为四类： 类似于胰蛋白酶的碱性蛋白酶，对碱性氨基酸如糖氨酸、赖氨酸有专一性。 对芳香族或疏水性氨基酸残基有专一性，如枯草杆菌碱性蛋白酶。 对小分子脂肪族氨基酸残基有专一性，如粘细菌a 裂解型蛋白酶，这是一种溶解 细菌细胞壁的蛋白酶。 对酸性残基有专一性，如葡萄球菌碱性蛋白酶。 1 _ 2 碱性蛋白酶的分类 1 2 1 命名 枯草芽孢杆菌生产的碱性蛋白酶称为枯草杆菌溶菌蛋白素( s u b t i l i s i n ) ，它起源于丹 麦n o v o 公司用枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) $ i l 造的一种碱性蛋白酶，即卡斯柏格枯草 杆菌溶菌蛋白素( s u b t i l i s i nc a r l s b e r g ) 。n a g a s e 公司用枯草杆菌n 所产的碱性蛋白酶取名 s u b t i l i s i n b p n 。由n o v o 公司另一株枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 生产的碱性蛋白酶称 为s u b t i l i s i n n o v o ，现在s u b t i l i s i n 这个名称就是指枯草杆菌碱性蛋白酶。 1 2 2 类型 细菌碱性蛋白酶从生态上可以分成两类，一类是在中性p h 才能良好生长并生产碱 性蛋白酶，例如枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、短小芽孢杆菌( b p u m i l u s ) 、地衣芽孢 杆菌旧1 i c h e n i f o r m i s ) 等，另一类是嗜碱微生物，它们只有在p h 8 - 1 0 的环境中生长和产 酶。 k e a y 将不同类型芽孢杆菌生产的碱性蛋白酶分为两种类型： a 型( c a r l s b e r g 型) 枯草杆菌碱性蛋白酶：由短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌生产的酶， 其性质和结构与枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶一致。这类菌株只产生碱性蛋白酶一种。 b 型( n o v o 型) 枯草杆菌碱性蛋白酶：由枯草杆菌淀粉糖化变种及枯草杆菌n r r l b 3 4 1 1 所产生，与b p n 或n o v o 枯草杆菌碱性蛋白酶相一致。这类菌株除产生碱性蛋白 酶外，还产生中性蛋白酶。 a ，b 两型碱性蛋白酶在免疫学分析上没有交叉反应，用抗枯草杆菌n r r l b 3 4 1 l 型 ( b 型) 血清同c a r l s b e r g 型( a 型) 相混合后，生成沉淀极少，说明两者分子结构很不同， 这：j 氨基酸排列顺序和构象上存在区别是符合的。 第l 章文献综述 在酯酶活性上，酯酶活性与蛋白酶活性之比，a 型强于b 型。一般认为a 型酶组 成的洗涤剂除污效果好，主要因为它在洗涤溶液中随温度的降低活性下降缓慢。 a 型和b 型的分子量分别为2 7 5 3 2 d a 和2 7 2 8 7 d a ，各有2 7 5 和2 7 4 个氨基酸残基。 二者的一级结构和酶的构象存在很大差异，彼此间有8 3 个氨基酸不同，但在活性部分 的肽段第6 4 7 4 、第2 1 8 2 2 9 个氨基酸的顺序却完全相同。它们性质相似，最适反应温 度为6 0 。c ，最适p h 为1 0 。都具有广泛的底物专一性，但a 型更宽一些，而且其稳定 性不依赖于c 矿。 1 3 生产碱性蛋白酶的菌种 几乎所有细菌碱性蛋白酶都是胞外酶，与动、植物来源的碱性蛋白酶相比具有适于 大规模工业化生产的优点。微生物作为碱性蛋白酶的主要生产来源，是因为微生物存在 物种多样性和生长的快速性。微生物繁殖速度快。细菌在合适条件下2 0 3 0 m i n 就可 以繁殖一代，其生长速度为农作物的5 0 0 倍，为家畜的1 0 0 0 倍。微生物种类繁多， 酶的品种全。在不同的环境下生存的微生物有不同的代谢途径，可以产生适应不同环境 的酶分子，如高温酶、中温酶和低温酶，耐高盐酶、耐高碱酶等。微生物培养方法简 单。微生物培养所用的原料大多为农副产品，来源丰富，机械化程度高，易于大批量生 产，连续发酵生产可以提供经济有效的产品。 不少微生物可生产碱性蛋白酶，碱性蛋白酶生产菌株见表1 一l ，但工业生产用的菌 种主要是枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌等。我国用 于生产碱性蛋白酶的菌种主要有：地农芽孢杆菌2 7 0 9 及其变株( c 1 2 1 3 ，a 5 7 ，3 3 2 6 ) ，短 小芽孢杆菌2 8 9 和2 0 9 菌株，地衣芽孢杆菌5 3 3 f 1 3 ，嗜碱性芽孢杆菌s m j p 等。 河北大学理学硕士学位论文 表l 一1 碱性蛋白酶生产菌株 t a b l e l 一1s t r a i n so f p r o d u c i n ga l k a l i n ep r o t e a s e 菌株菌株 枯草杆菌( 丑s u b t l i s ) 嗜碱性芽孢杆菌a l c a l o p h i l u s ) b a c i l l u sf i r m u s ( n e e zbl 1 0 7 ) 短小芽孢杆菌陋p u m i l u s ) 地衣芽孢杆菌1 i c h e n i f o r m i s ) 马铃薯杆菌旧m e s e n t e r i c u s ) 粘质赛氏杆菌( s e r r a t i am a g e s c e n s ) 纳豆芽孢杆菌( b a c i l l u sn a t t o ) 棕曲霉口o c h r a c e u s ) 米曲霉似o r y z a e ) 黄曲霉t z a v u s ) 酱油曲霉似s o j a e ) 栖土曲霉州t e r r i c o l a ) 萨氏曲霉叫s p e r g i l l u ss y d o w i ) 硫曲霍( 一c n p r u i l l a cs u l p h u r e u s ) 芽孢杆菌( b a c i l l u s 妇t a s e n s i s ) 立德链霉蔓 r e c t u s ) 费氏链霉菌( 最f r a d i a e ) 灰色链霉菌假g r i s e u s ) 鬼伞菌( c o p r i n u s m a e r o h i z u s l 蓝棕青霉僻c y a n e o 向h u m ) 细极链格孢“l t e r n a r i at e n u t s s i u m 嗜热圆酵母( t o r u l at h e r m o p h i l a ) 小球菡( m i c r o c o c c u ss o c l o n e n s i s ) 头孢霉( c e p h a l o s p o r i u m l 节杆菌( a r t h r o b a c t e r 辨) 假单饱菌( p s e u d o m o n o ss p1 镰刀菌( f u s a r i u ms p 1 解腊假丝酵母( c a n d i d al i p o l y t i c a ) 1 4 生物技术在碱性蛋白酶研究中的应用 1 4 1 微生物诱变育种 传统的诱变育种技术应用于工业微生物育种，成绩辉煌，菌株生产能力突飞猛进， 所以利用物理或化学诱变剂单独或复合处理微生物选育高产变种是世界各国经常使用 且行之有效的重要方法。目前，仍然是碱性蛋白酶育种的有效方法之一。 邱秀宝等从3 8 份土样中筛选到一株嗜碱性短小芽孢杆菌，应用亚硝基胍诱变筛选 获得一株具有高产稳产碱性蛋白酶变异株b 4 5 ，发酵酶活达1 8 0 0 0 u m l 拍l 。徐予渊等将 原碱性蛋白酶生产菌2 7 0 9 进行诱变育种，获得变异株c 1 2 1 3 ，酶产量提高了4 0 i j 。 郑铁曾等在此基础上通过诱变育种，又进行了提高c 1 2 1 3 菌碱性蛋白酶活力的研究，酶 活力提高了1 7 0 1 8 。 但传统诱变其诱发突变是随机而不是定向的，高产突变频率很低，因此随机筛选工 作繁重琐碎，盲目性大，周期较长。 1 4 2 微生物的原生质体技术 1 9 5 3 年w e i l b u l l 等首先提出原生质体的概念，并用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌获得原 土质体。7 0 年代，s c h a e f f e r 等人成功地进行了微生物原生质体融合，原生质体技术便 4 一 第1 苹文献综述 i i i i i 成 为工业微生物育种的种重要手段，并取得了很大成效。 原生质体技术，对实现有效的遗传育种提供了很大的方便。以原生质体诱变、原生 质体融合或原生质体的诱变融合相结合来改变菌种的遗传特性，从而选育出碱性蛋白酶 高产菌株，是一种非常有效的遗传育种技术。 徐威等以枯草杆菌a x - 4 6 为出发菌株，在原生质体形成及再生的最佳条件下制备原 生质体，并对原生质体进行紫外诱变处理，对大量的再生突变株进行发酵筛选，获得高 产菌株，酶产量提高了3 6 1 9 1 。冯清平等，从2 8 份土样中筛选到一株嗜碱性地衣芽孢 杆菌，对其原生质体进行复合诱变处理，从中选育出了耐高温、耐碱的碱性蛋白酶高产 菌株【20 1 。 1 4 - 3 芽孢热处理技术 将细菌芽孢进行热处理，可以获得耐高温的碱性蛋白酶，该方法特别适合于芽孢杆 菌( b a c i l l u sk a t a s e n s i s ) 的选育。热处理的对象可以是菌体、芽孢或原生质体，将其在高 温下处理一定时间，使低温菌淘汰而高温菌得以纯化，连续多次交替处理就可获得耐热 菌株。 1 - 4 4 基因工程研究进展 基因工程是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技 术而发展起来的一门新兴技术学科。国内外在这方面的技术研究进展较快。在碱性蛋白 酶基因的克隆、表达等方面取得了许多重大成果。 利用基因工程技术对细菌和酶进行改造的主要目的是：1 ) 提高酶的产量；2 ) 改变底 物特异性和酶的活性；3 ) 提高酶稳定性；4 ) 使酶适应高温环境；5 ) 提高酶在有机相中的 反应能力。目前研究较多的碱性蛋白酶表达系统的质粒一宿主有三种：大肠杆菌系统、 酵母系统和枯草芽孢杆菌系统。 雷虹等利用p c r 技术从地衣芽孢杆菌2 7 0 9 菌株的染色体d n a 中扩增了2 7 0 9 碱性 蛋白酶的编码序列，肯定了2 7 0 9 菌碱性蛋白酶属典型的s u b t i l i s i nc a r l s b e r g 2 1 1 。江盛梅 等利用p u c l 8 质粒作载体，将嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白酶基因克隆到e c o l i ( t g i ) q b ， 获得克隆株g 3 ，其酶活是出发株的3 4 倍口2 1 。赵云德等对地衣芽孢杆菌2 7 0 9 碱性蛋白 酶麓网进行了克隆和序列分析。 河北大学理学硕士学位论文 1 4 5 蛋白质工程 蛋白质工程是指通过天然蛋白质或蛋白质衍生物的结构分析，确定其三级结构模 型，然后通过分子设计合成突变基因，经过筛选突变体、d n a ，合成相应蛋白质的方法。 蛋白质工程的目标是改造蛋白质或创造新型蛋白质，使之具有天然蛋白质所没有的性 能，以满足人类需要。 在芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶的蛋白质工程研究中，焦点集中在提高碱性蛋白酶的 稳定性、抗氧化性及改变蛋白酶的专一性等方面。 王培之等用蛋白质工程的方法完成了构建一个分泌枯草杆菌蛋白酶的工程菌 p w 8 8 8 8 ，所分泌的碱性蛋白酶具有较强的抗氧化性，以期应用于增白加酶洗涤剂。王 贤舜等用蛋白质工程的方法首先在计算机图象系统上对预定的分子改造方案进行预测、 设计方案，成功地完成了构建一个分泌热稳定性比野生型枯草杆菌蛋白酶e 高4 倍的工 程菌| ：1 9 】。 随着定向改造天然碱性蛋白酶或设计制造新型碱性蛋白酶研究的不断深入，除了期 待新型碱性蛋白酶应用于工业之外，蛋白酶也是进行蛋白质工程研究的很好的模型，是 研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，同时也为其它工业酶的性能改造提供了范例 和理论指导依据。 1 5 碱性蛋白酶的应用 酶作为生物催化剂，在许多化学反应中具有不可低估的作用。酶催化剂与一般的化 学催化剂相比，它可以在非常温和的条件下高效、专一地催化底物转变为产物。酶工程 技术已成为生物工程技术的重要组成部分，无论是基因工程、蛋白质工程、细胞工程和 发酵工程都需要酶分子的参与。酶催化的高效性、特异性及产品的高效回收、简单的反 应体系等优点使酶工程技术成为现代生物技术的主要支柱之一。 2 0 世纪中叶以来，工业用酶制剂市场得到了蓬勃发展。1 9 8 5 年工业酶制剂约生产 7 5 ，0 0 0 吨，产值约6 亿美元；1 9 9 8 年全世界工业酶制齐4 销售额高达1 6 亿美元。进入2 0 世纪9 0 年代后，市场对酶制剂的需求进一步增强。从总体来看，世界酶制剂的生产量 正以每年8 左右的速度递增，酶制剂的生产品种已由原来的十多个发展为数十个。 蛋白酶是工业酶种中用得最多的一种酶，约占酶总量6 0 ，其中碱性蛋白酶就占 2 5 。碱性蛋向酶可以在碱性条件下保持良好的活力，并催化蛋白水解，可用卜制革、 第l 章文献综述 丝绸、医药、食品和生物化学试剂等许多领域，其最大用途是作为添加剂生产加酶洗涤 剂。 1 5 1 碱性蛋白酶在洗涤剂中的应用 碱性蛋白酶最早在猪的胰脏中发现。1 9 1 3 年，r o h m 首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡 剂使用。1 9 4 5 年瑞士的d lj a a g 等发现了微生物碱性蛋白酶，使蛋白酶有可能广泛应用 于洗涤剂工业。1 9 6 3 年，诺和诺德公司发现了更适用于洗涤剂的碱性蛋白酶a l c a l a s e ， 它由地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sb c h e n 折o r m i s ) 产生，商品名为b i o t e x ，酶制剂被广泛地 应用于洗涤剂产品中，出现了加酶洗衣粉。随后的二十年中，细菌类蛋白酶是唯一被应 用于洗涤剂中的商品化酶制刹。 1 9 9 2 年西欧工业酶的市场总额达3 5 亿美元，居于首位的蛋白酶为1 4 亿美元。就 工业用的蛋白酶来讲，洗涤剂用的碱性蛋白酶居第位。例如，美国1 9 8 9 年总的工业 蛋白酶的销售额为3 3 亿美元，其中用于洗涤剂的碱性蛋白酶为1 5 亿美元。所以，不 仅蛋白酶是工业用酶中用量最大的酶，而且碱性洗涤剂蛋白酶又是蛋白酶中用量最大的 一种。 洗涤剂中使用的蛋白酶必须具有如下特性：在高o h 下具有活性并且稳定，与清洁剂 中的螫合剂、氧化剂相容。清洁用酶是否能发挥其最好效果，主要在于其等电点的高低。 众所周知，如果蛋白酶的等电点与清洁剂的p h 相同，那么此酶最适合于在此种清洁剂 中使用。 碱性蛋白酶是一种生物催化荆，可以在碱性条件下保持活力，并催化水解蛋白质。 因为人类衣服上的污迹主要有尘土的微粒、人体分泌的皮脂和汗液、食物残渣和汤汁等 构成。用于洗涤这些污物的洗涤剂是由表面活性剂、纯碱、水玻璃( 硅酸盐) 、三聚磷酸 盐等配制而成。所以，在洗涤时的水溶液中，就显示出较高的碱性，p h 一般在9 1 l 之 间。在这种条件下，碱性蛋白酶就可将污迹中的蛋白质水解，使复杂的蛋白质分解成结 构简单、相对分子量较小的水溶性肽，或者迸一步分解为氨基酸。在这个过程中，碱性 蛋白酶可反复起分解蛋白质的作用，只是酶活越来越低。 洗涤剂中加入碱性蛋白酶后具有以下优点：提高产品的去污效果，保持被洗衣物的 原有色彩。减少了洗涤剂中表面活性剂和某些助剂的用量。增加了节水、节能和环 境保护的效益。在洗涤过程中，通过碱性蛋白酶的作用，可减少衣物的漂洗次数、降低 河北大学理学硕士学位论文 洗涤渝度，而酶本身又是极易生物降解的物质。因此加酶洗涤剂是近十几年来的热门产 品，在整个洗涤剂中所占的比例日渐增加。据统计，日本为9 5 ，西欧为9 0 ，美国为 7 0 。仅美国在1 9 9 4 年至2 0 0 0 年间，洗涤剂酶市场销售额就增长了近一倍，达到2 4 亿美元。 1 5 2 碱性蛋白酶在皮革工业中的应用 我国皮革工业资源丰富，发展迅速，猪、羊皮产量居世界之首，皮革制品不仅满足 国内i 节场需要，还大量出口，为国创汇。皮革处理包括浸泡、脱毛、洗涤、制革等几个 过程。皮毛的主要成分为蛋白类物质。传统的“灰碱法”脱毛涉及诸如n a 2 s 0 a 等有毒 化学物质，它们会引起有关于污染防治和污水处理的问题，对环境造成严重污染。 酶作为化学处理方法的替代，已经证明了它在提高皮革质量和减少环境污染方面的 优越性。蛋白酶可选择性地水解非胶态的皮革组分，也可以除去诸如白蛋白、球蛋白等 非纤维蛋白。浸泡的目的是增加毛孔的体积。这一步骤传统上是用碱处理。目前使用微 生物碱性蛋白酶可以使水分吸收更快，减少浸泡时间。非离子甚至阴离子表面活性剂与 酶基本上是相容的。 传统的脱毛、软化法是在极端碱性条件下用硫化物处理溶解毛根的蛋白质。应用碱 性蛋白酶可以破坏表皮生发层和毛鞘的组织细胞，消弱毛、表皮和真皮粒面层的关系， 从而达到脱毛的目的。应用酶法脱毛可以从根本上消除“灰碱法”中硫化物带来的严重 污染，毛还可以回收利用，废液中富含的蛋白质可以做肥料，对推动制革业可持续发展 具有重要意义。 早期洗涤法是使用动物尿作为蛋白酶的来源，这种方法气味难闻并且不可靠，后来 喟胰腺代替了动物尿。现在用加有胰岛素的蛋白酶来洗涤。酶的特异性依赖于其对蛋白 质诸如弹性蛋白、角蛋白等的空间结构的选择性，酶的用量大小依赖于所处理的皮革的 类型f 软或硬) 。 浸泡、脱毛和洗涤中酶的广泛使用不仅可以减少环境污染，而且可以降低能源的消 耗。n o v o 公司生产了三种蛋白酶a q u a d e r m ，n u e 和p y r a s e 分别用于浸泡、脱毛和洗 涤。 1 5 3 碱性蛋白酶在食品工业中的应用 碱性蛋自酶在食品工、 k 中有着广泛的用途。 第1 章文献综述 豆制品加工：大豆由于其含有高质量的蛋白质而作为一种富营养性食物。很早以前 蛋白酶就作为大豆酱和其他豆制品的一种配料。真菌来源的碱性和中性蛋白酶在大豆酱 制作中发挥着重要的作用。经蛋白水解后的大豆蛋白可提高其功能。在p h 8 条件下用 a l c a l a s e 处理大豆蛋白，其水解产物具有溶解度高、产量高、苦味低的特点。水解产物 也应用于添加蛋白质的软饮料和食疗食物中。 猪血加工：我国猪血资源丰富，猪血有“液体肉”之称，是很好的营养、补血和补 钙剂。过去，没有得到利用，小部分做血豆腐食用，或作为饲料，大部分废弃，这不但 浪费了资源，还造成了环境污染。用碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解猪血，其血粉制品可 用于食品工业作为食品添加剂，也可用于医药工业作为补血、补钙剂及各种口服液的原 料。 玉米深加工：玉米黄粉是玉米湿法淀粉厂的副产品，含有4 0 6 0 的蛋白质，这些 蛋白质大部分是醇溶蛋白、谷蛋白和球蛋白。玉米醇蛋白只能溶于异丙酮和乙醇中，不 溶于水。谷蛋白只溶于碱水溶液中。因此与其它商业化蛋白源相比，玉米蛋白的疏水性 使得其食品功能特性极差。要想使蛋白质具有理想的食品功能，就必须使其成为水溶解 状态或处于较好的悬浮状态。为了提高玉米蛋白的水溶性以制备一些特殊产品，用碱性 蛋白酶修饰玉米蛋白使其成为可溶性肽就显得尤为重要。王梅谷等对碱性蛋白酶水解玉 米蛋白的反应动力学进行了研究，探索了酶法修饰玉米蛋白的可行性，在适宜的反应体 系中，可大幅度提高酶促玉米蛋白的溶解量。 玉米皮水解：玉米皮是玉米加工副产品，其蛋白质含量为1 2 左右。可通过酸、碱 或酶法水解蛋白，研究开发一些高附加值的功能产品。经碱性蛋白酶水解后，蛋白溶出 率为8 9 3 ，水解度d h 为9 0 ，也就是况，被切断的蛋白质分子肽键很多，同时生成了 许多游离氨基酸和低分子量肽。王遂等对枯草杆菌碱性蛋白酶水解玉米皮蛋白的工艺条 件进行了研究。发现玉米皮蛋白变性处理对蛋白水解度无太大影响，因此制取不同水解 度的产物，可不进行加热变性处理。 1 5 4 碱性蛋白酶在丝绸脱胶中的应用 生丝织物必须脱胶，去除外层丝胶才能具有柔软的手感和特有的丝鸣现象。丝胶是 一种蛋白质，在桑蚕丝中含2 0 3 0 ，在柞蚕丝中含5 , 8 5 ，中间还夹杂着大量尿酸钙。 我困历来用碱皂法高温炼丝进行脱胶，缺点很多，碱质侵袭丝素，易引起发毛影响光泽。 河北大学理学硕士学位论文 柞蚕丝则由于丝胶中含钙盐易生成钙皂，附于绸面难以去除，致使成品手感粗糙，成品 光泽黯淡使用蛋白酶脱胶则可以克服上述缺点。 用蛋白酶脱胶的优点是：成品手感润滑柔软，光泽鲜艳，牢度增加；节约成本；脱 胶时间缩短，操作温度降低，劳动生产率提高。 1 5 5 碱性蛋白酶在医药中的应用 有碱性蛋白酶活性的胶原酶在医疗上应用于缓慢释放的药剂，如来源于a s p e r g i l l u s n i g e r l c f 9 的高胶原蛋白水解性的半碱性蛋白酶，可应用于临床。梭菌胶原酶或枯草杆 菌蛋白酶可以和广谱抗菌素复合使用来处理烧伤和碰伤。从大肠杆菌分离的天( 门) 冬酰 胺酶可用来除去各种淋巴细胞白血病血流中的天冬酰胺酸。c o n i d i o b o l u sc o r o n a t u s 产生 的碱性蛋白酶可以取代动物细胞培养中所使用的胰岛素。 1 5 6 碱性蛋白酶在其它方面的应用 废物处理：碱性蛋白酶提供了有潜力的处理各种食品工业、家庭生活废弃物的方法， 它可变废为宝，提供大量的鱼或家畜的饲料，如一种使用枯草杆菌碱性蛋白酶处理家禽 屠宰场废弃羽毛的方法，可使羽毛变为高蛋白质的饲料添加荆。 银的回收：在x 一射线胶片生物处理回收银中，碱性蛋白酶有应用的潜力，使用过 的x 一射线胶片中含有1 5 2 o ( 质量比) 的银，传统回收的方法是燃烧这些胶片，这导 致了环境污染，使用碱性蛋白酶处理，不仅可使银得到回收，多元酯也可再循环，同时 减少了污染。 基础研究：碱性蛋白酶对肽键断裂的选择性可以解释结构与功能、肽链的合成以及 蛋白质序列等方面的问题。 1 6 本论文的研究目的与内容 碱性蛋白酶是产量最大，用途最广的一种蛋白酶。它被广泛地用于洗涤剂添加剂， 皮革脱毛，蚕丝脱胶，食品及医药加工等诸多领域，在我国的酶制剂工业中占有极其重 要的地位，在改善人民生活质量、降低劳动强度、节约原料和能源、保护环境等方面发 挥着重要作用，并产生了巨大的经济效益和社会效益，有着广阔的发展前景。所以，不 断提高碱性蛋白酶生产菌株的发酵活力，大力开展碱性蛋白酶的相关研究势在必行。 诱变育种、原生质体融合、基因工程等先进技术为菌种改良提供了新的途径。原生 质体融合技术，作为一种有效的遗传育种手段，已被广泛用来改良微生物的菌种特眭、 第1 章文献综述 提高产率。但原生质体融合是两出发菌株基因的随机组合，不能定